LES ENZYMES INDUSTRIELLES

Pour sélectionner une souche productrice d’enzymes en vue d’une production

industrielle ; il faut définir au moins 3 paramètres ;
 Définir le type d’enzyme recherchée et ses caractéristiques
 Choisir le type de microorganisme
 Mise en œuvre des techniques d’isolement et de sélection en fonction des
critères choisis, Cette dernière comprend
Le choix des milieux naturels et la source d’isolement
Choix des milieux d’isolement en milieu solide : milieux sélectifs et de
milieux de production en milieu liquide
Mise en évidence des activités enzymatiques en milieu solide et en milieu
liquide

1) Les ENZYMES INDUSTRIELLES et leurs APPLICATIONS

Ce sont en général des hydrolases classées par familles selon le type de produit
à dégrader glucides protéines et lipides
Famille des glucides : les enzymes industrielles les plus connues sont
les amylases a et b ,les glucose isomérases, les glucomylases, les pullulanases …
Ces enzymes sont utilisées dans les procèdes amidonniers pour la liquéfaction
de l’amidon pour la production de sucres liquides, mais également dans les
détergents pour éliminer les impuretés à base d’amidon etc …. Tels que les
cellulases, les xylanases, Les lactases, l’invertase ….

Les M.O producteurs quelques exemples :

Amylases a et b produites par Bacillus licheniformis, elle sont relativement
stables à 6o°c ais il existe des amylases plus stables et thermorésistantes
produites par des MO hyperthermophiles notamment par les Archeae tel que
Pyrococcus furiosis qui résiste à 100 °C

Les amylases sont également produite par des moisissures du genre Aspergillus
et des actinomycetes ( streptomyces)

Cellulases :
Les cellulases sont utilisées dans les industries agroalimentaires dans la
clarification des jus et dans la composition des détergents pour le nettoyage et
la clarification des couleurs, elles empêchent le ternissement des couleurs et
améliorent la douceur des tissus en coton
Dans l’alimentation du bétail elles servent à pré digérer la cellulose
Les Mo producteurs sont essentiellement les moisissures tel que Aspergillus
niger
Xylanases : catalyse les polymères de xylane à base de xylose (pentoses)
présents dans les hemicelluloses
Elle est utilisée en papeterie et augmente l’accès des produits chimiques de
blanchiment aux fibres de la pâte en éliminant le xylane
Les xylanases sont produites par les champignons et les bactéries
Bacillus subtilis, Aspergillus terreus

Lactases (B galactosidase)
Utilisée en alimentation humaine pour améliorer la digestibilité du lait, fromage,
yaourt (intolérance au lactose)
Elle est produite industriellement par les levures du genre Kluyveromyces
K. lactis et K fragilis sur des substrats à base de lactoserum

Les protéases
On les différencie en fonction de leur pH d’activité, protéases alcaline, acide et
neutres et de la température. Protéases thermostables
Les protéases industrielles sont utilisées en industrie agroalimentaire ( présure) ,
en industrie des détergents et en tannerie (cuir et peau)
La présure : un grand nombre d’enzymes protéolytiques ont les propriétés de
coaguler le lait. Les plus utilisées sont les protéases d’origine animale (mélange
de chymosine et de pepsine ) mais elles sont de plus en plus remplacées par les
protéases d’origine microbiennes tel que celles extraites de Mucor miehei
Actuellement la présure est produite par génie génétique sur Ecoli modifiée
portant l’information génétique de la chymosine prélevée dans les cellules de
l’estomac de veau

Les protéases utilisées dans les détergents, éliminent les impuretés protéiques,
elles sont les composants essentiels des détergents modernes , elles sont utilisées
à de faibles concentrations et évitent les températures de lavage élevées
Les protéases thermostables sont isolées à partir isolées à partir des MO
hyperthermophiles
Les MO producteurs Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Bacillus
Amyloliquefaciens
Elles sont également d’origine fongiques ou d’archeae ( Pyrococcus)

Les lipases
Elles catalysent l’hydrolyse des triglycérides dans les détergents, elles sont
utilisées pour éliminer les taches de graisse présentes dans les tissus mais leur
efficacité est limitée dans les détergents en raison de leur faible stabilité dans les
milieux dénaturants (ph élevés et presence de métaux lourds..)
Elles sont produites essentiellement par les champignons filamenteux tel que
Aspergillus oryzae mais aussi par des bactéries du genre pseudomonas

Autres enzymes
Penicilline amidase ;
Utilisée dans la fabrication de pénicillines semi synthétiques, elle libère l’acide
aminopenicillanique
Origine Ecoli : intracellulaire
Bacillus megaterieum : extracellulaire
Taq polymerase (taq pol)
ADN polymérase thermorésistant extraite de la bactérie Thermus aquaticus , sa
température d’action est 72 °C
Règne bacteria, division deinococcus, thermus
Classe dinococci, ordre thermales

2) TECHNIQUES D’ISOLEMENT DES SOUCHES PRODUCTRICES

D’ENZYMES

Choix des milieux d’isolement

Les MO sont abondants et localisés là ou les substances à hydrolyser sont
abondantes ; on ciblera également les milieux possédant certaines propriétés
recherchées pour les enzymes (température ,Ph)
ex les hyperthermophiles , il faut les rechercher dans le sources thermales , les
microorganismes halophiles dans les milieux salés
Les cellulases, les xylanases, les pectinases : il faut les rechercher dans les sols
forestiers riches en débris végétaux
Les lactases, on va les rechercher dans les milieux ou le lactose est présent ( lait
et produits laitiers) et souvent les enzymes sont induites par la présence de leur
substrat
Les méthodes classiques d’isolement utilisent des milieux sélectifs selon le type
de Mo recherché ; levures, moisissures, bactéries Gram+ , Gram-, contenant le
substrat de l’enzyme comme seule source de carbone
Ex ; sélection de Bacillus producteur de xylanases thermostables
On utilisera un milieu gélosé à base de xylane , un antifongique
(cyclohexemide) pour éliminer les champignons envahissant et un antibactérien
ou un colorant anti Gram+, pH 7 .On incube à 50 °c

Sélection de Aspergillus producteur de lipases

On utilisera un milieu à base trioleine et un antibactérien à large spectre
(oxytetracycline ou streptomycine ) pH 5
L’isolement des hyperthermophiles nécessite l’utilisation de Gel rite à la
place d l’agar pour incuber à 70 °C
Mise en évidence des activités enzymatiques
Le principe consiste à mettre la souche ou l’extrait enzymatique produit par la
souche en présence de son substrat spécifique et de mettre en évidence le produit
de la dégradation par des techniques
Chimiques et biochimiques ,Spectroscopiques ou chromatographique
Les méthodes peuvent être simplifiées pour des raisons de rapidité et de gain de
temps (miniaturisation , coloration , galeries)
La souche est généralement purifiée après isolement puis conservées soit par
repiquages successifs soit par congélation en présence d’un cryoprotecteur

Préparation de l’extrait enzymatique

On réalise des cultures dans 25 ml de milieu contenant le substrat de l’enzyme
comme source de carbone et inducteur de l’enzyme
On arrête la culture vers la fin de la phase exponentielle de croissance
Le surnageant est obtenu par centrifugation de la culture à 1200 rpm pendant
10mn dans une centrifugeuse réfrigérée à 4°c ; ils sont ensuite stérilisés sur filtre
de 0,22 µ puis stockés dans des tubes Eppendorf à des températures de -20°c.
Chaque tube contient environ 1,5ml d’extrait qui serviront pour les tests
enzymatiques

Technique
L’activité enzymatique est réalisée soit sur milieu solide ou milieu liquide
En Milieu solide
C’est La technique de diffusion sur agar est souvent utilisé notamment pour les
champignons filamenteux qui ont un équipement enzymatique très important et
exo cellulaire
Les souches sont déposées directement en spot soit leur extrait enzymatique sue
géloses contenant le substrat à hydrolyser
Des observations sont effectuées après l’incubation selon les réactions prévues
dans le milieu gélosé
Lorsque on utilise l’extrait enzymatique au lieu de la souche , on applique la
technique des cup plates . Dans la gélose contenant le substrat on creuse des
puits de 4mm , 4 par boite , on les remplit avec 100 µl de la solution
enzymatique et sont incubées à température appropriée

Les activités enzymatiques apparaissent sous forme de zones claires autour de

la souche ou du puit.
La taille du halo peut être in indicateur de mesure de l’activité enzymatique
puisqu’il est proportionnel à l’activité. Le résultat est exprimé par le calcul du
rapport taille du halo /taille de la colonie
Mesure de l’activité en milieu liquide
Dans ce cas la réaction enzymatique est réalisée en milieu liquide en tube ou en
fiole , on utilise généralement l’extrait enzymatique et on mesure les produits de
l’hydrolyse par les techniques appropriées

Activité lipasique : substrat : trioleine

L’activité est déterminée par mesure de l’acidité par titration acide base des
acides gras libres