TRAVAUX PRATIQUES DE

MICROBIOLOGIE
INDUSTRIELLE (MIB3066)

Année académique 2022_2023

DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE
Faculté des sciences, Université de Yaoundé 1
 Avant-propos
Les microorganismes remplissent une quantité de fonction dans la nature. L’homme a
appris parfois empiriquement, à domestiquer les microorganismes pour les faire travailler à
son avantage. Les Travaux pratiques de l’Unité d’enseignement de Microbiologie Industrielle
(MIB 3066) visent à exploiter les potentialités des microorganismes dans la production des
molécules d’intérêt économique, la réduction des pertes post-récoltes ou la protection de notre
environnement pour ne citer que ces quelques cas. Au cours des manipulations qui vont suivre,
nous verrons comment sélectionner des microorganismes d’intérêt industriel et les utiliser dans
des fermentations.
Au terme de ces travaux pratiques, l’apprenant doit être capable de Maîtriser les
opérations associées à la conduite des fermentations et à la production des molécules par voie
microbienne

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 RECOMMANDATIONS PARTICULIERES A OBSERVER AUX
TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE

En salle de Travaux pratiques (TP), tout étudiant doit :

❖ Être muni d’une blouse blanche de coton.

❖ Travailler dans l’ordre et avec précaution, en évitant tout déplacement inutile.

❖ Respecter rigoureusement les principes de manipulation aseptique enseignés, afin

d’éviter des gestes dangereux.

❖ Vérifier le bon fonctionnement des Becs Bunsen, faire attention pendant la manipulation

aseptique de ne pas enflammer les manches de la blouse ou les cheveux.

❖ Fermer le robinet de gaz dès que la flamme n’est plus nécessaire.

❖ S’assurer en fin de séance, avant de quitter sa place que tout le matériel septique

manipulé n’est pas susceptible de contaminer les personnes chargées de l’entretien.

❖ Placer les pipettes, étaloirs de verre contaminés, lame, sitôt après usage dans les bacs

renfermant du liquide décontaminant.

❖ Placer les tubes à essai, tubes à hémolyse contenant ou ayant contenu des produits

microbiens, convenablement bouchés, dans les paniers métalliques pour subir une

destruction à l’autoclave.

❖ Nettoyer la paillasse avec un décontaminant.

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 SEANCE N°1 : Criblage des microorganismes d’intérêt
industriel

De nombreuses molécules nouvelles peuvent être synthétisées par les microorganismes

compte tenu de leurs énormes potentialités biochimiques. C’est la raison pour laquelle une
partie importante de Microbiologie industrielle consiste à mettre au point des méthodes
d’obtention de ces molécules d’origines microbiennes.
Si la modélisation par ordinateur se développe de plus en plus, les techniques classiques
sont encore utilisées. L’une d’elle, examinée dans cette manipulation, est basée sur le criblage
(ou screening en anglais) de la production de nouvelles molécules à partir des germes isolés de
la nature. A la fin de cette séance de TP qui est une initiation des étudiants aux techniques de
screening des germes microbiens producteurs d’amylases, chaque étudiant doit être capable :

• D’isoler des microorganismes amylolytiques d’intérêt à partir d’un échantillon

de terre
• Comparer ces microorganismes en fonction du diamètre des halos d’hydrolyse
sur la base
• Caractériser les colonies des microorganismes produisant les amylases

I. Principe
L’hydrolyse enzymatique de l’amidon (constitué d’amylose et d’amylopectine) se fait grâce
aux amylases (alpha et béta) et conduit à la production du maltose et du glucose. Cette activité
que l’on recherche chez les microorganismes peut être appréciée par différentes techniques
parmi lesquelles les techniques amyloclastiques basées sur l’appréciation de l’intensité de la
coloration bleue que l’iode communique à l’amidon.

II. Matériels
❖ Spatule
❖ Echantillon de terre
❖ Solution de Lugol
❖ Tubes à essais, boîtes de Pétri, pipettes stériles de 1 à 10mL
❖ Anse de platine, Étaloir,
❖ Solution physiologique (NaCl 9g pour 1000ml)
❖ Gélose Kuster-Amidon
❖ Boîtes de Pétri
❖ Papier aluminium
❖ Balance de précision

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III. Méthodes :
➢ Écarter les trois premiers centimètres de particules terreux et à prélever environ
100grammes de terre vers 5 à 10 cm en dessous de la surface du sol, en zone aérobie.
➢ Puis déposer l’échantillon de terre prélevé à l’aide d’une spatule, sur une feuille en
aluminium stérile.
➢ Broyer l’échantillon de terre à l'aide d'un pilon dans un mortier.
➢ Mélanger vigoureusement (pour permettre une bonne dispersion de la charge
microbienne dans le tube à essais) 1g de broyât à 9 ml de solution stérile de NaCl à 9g/L
(solution mère 10-1).
➢ Décanter quelques instants et utiliser le « surnageant » pour établir une série de dilutions
décimales allant jusqu’à 10-4.
➢ Ensemencer par étalement 100µL de la dilution 10-4 de l’échantillon à la surface de la
gélose Kuster-amidon préalablement coulée dans des boîtes de Pétri stériles.
➢ Incuber les boîtes à 25-28°C pendant 24 à 48 heures.
➢ Prélever un peu de chaque colonie repérée en dans les boîtes incubées précédemment et
les ensemencer à la touche sur gélose Kuster-amidon. Bien repérer les ensemencements,
bien s'assurer que les boîtes ensemencées contiennent toutes les colonies des boites de
stockage.
➢ Cultiver 24 heures à dans les conditions précédemment définies.
➢ Révéler l’hydrolyse de l’amidon et donc, la production des amylases en pulvérisant une
solution iodée à la surface de boîtes répliquées.
➢ Observer la présence d’un halo clair autour des colonies. Celui-ci met en évidence
l’hydrolyse de l’amidon.
➢ Comparer le diamètre des halos d’hydrolyse de l’amidon.
➢ Préciser les facteurs pouvant influencer la taille de ces halos d’hydrolyse.
➢ Préciser l’aspect des colonies produisant ces amylases par des examens microscopiques
(la coloration de gram)

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 SEANCE N° 2 : PRODUCTION DU YAOURT

Les microorganismes sont exploités pour la transformation de nombreux aliments et de

ce fait la création de nouvelles denrées alimentaires. Cette transformation des produits initiaux
vise non seulement à modifier les qualités organoleptiques et nutritives de l’aliment initial, mais
également à réduire les pertes de l’aliment originel. Les aliments transformés étant rarement
stérile, il est indispensables en fin de production de s’assurer sur le plan microbiologique qu’ils
ne poseront aucun problème de santé aux consommateurs.
Le yaourt est un lait fermenté résultant du développement de deux ferments lactiques
que sont Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Ces deux germes sont micro
aérophiles et vivent en symbiose étroite dans le yaourt. Ce sont des bactéries lactiques
homofermentaires, thermophiles mais dont les températures optimales de croissance diffèrent,
ce qui permet en stimulant la croissance de l’un ou de l’autre de jouer sur la qualité du produit
final.
En effet, Au cours de la fabrication du yaourt, le pH initial du lait étant favorable aux
Streptocoques, ceux-ci assurent ainsi le départ de la fermentation, grâce à l’activité caséolytique
des Lactobacilles qui assurent leur développement. Lorsque l’acidité devient plus importante,
les Lactobacilles, qui sont plus acido-tolérants prennent le relais des Streptocoques et la
coagulation du lait est observée lorsque du lait atteint une acidité comprise entre 65 et 70°D
(degré Dornic)
A l’issu de cette séance de TP, chaque étudiant doit être capable de :
• Définir les termes Yaourt et Degré Dornic.
• Décrire les étapes de production du Yaourt.
• Produire le Yaourt à partir d’un lait frais ou reconstitué.
• Expliquer les paramètres responsables de la différence de texture (Viscosité), de goût
(Acidité) entre les yaourts.

1. Matériel :
• Poudre de lait
• Eau distillée
• Souche microbienne de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus
thermophilus
• Erlenmeyer er Becher de 1 et 2 litres
• Boites de conditionnement de 125ml ou 250 ml

2. Méthode
a- Production :
• Préparer une solution de lait en diluant différentes quantités (selon le tableau en
dessous) de la poudre de lait dans de l’eau de manière à obtenir l’extrait sec
souhaité.
• Mélanger soigneusement pour faire dissoudre la poudre de lait et y ajouter une
concentration en sucre désirée (facultatif)

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 • Pasteuriser la solution de lait obtenu (85°C pendant 30 minutes)
• Refroidir le lait à 45°C
• Ensemencer aseptiquement dans le lait une culture de Streptococcus
thermophilus à 3% et de Lactobacillus bulgaricus à 3%
• Homogénéiser le mélange pendant 2 minutes et repartir dans les pots de
conditionnement stériles.
• Incuber les pots à 45°C pendant 2 à 3 heures (temps nécessaire pour obtenir un
gel ferme)
• Refroidir à 5°C pour ralentir et stopper la fermentation

b- Analyse des produits

• Examiner la viscosité de vos produits
• Déterminer l’acidité de vos produits, exprimée en degré Dornic (°D)
• Faire une analyse microbiologique

Tableau de préparation des différents Yaourt

Sous-groupes I II III IV V
Quantité de lait en poudre (g) 140 180 160 180 180
Volume du ferment A ou B *(ml) 125(A) 125 (A) 65,5 (B) 125 (B) 62,5 (A)
Volume final (ml) 1000 1000 1000 1000 1000
*la lettre A, désigne le ferment mis à la disposition par le du laboratoire et la lettre B, celui
apporté par les étudiants

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 ANNEXE
Le degré Dornic (D°) correspond à 0,1g d’acide lactique par litre de lait, même si l’acide
lactique n’est pas le seul acide présent.
Pour déterminer le degré Dornic, il faut calculer la concentration massique C0 en g/l ; c'est-à-
dire la masse d’acide lactique contenu dans un litre de lait. Pour calculer cette concentration C0, on
utilise la formule suivante :

Où C1 est la concentration d’hydroxyde de sodium (soude)

V.éq. Le volume équivalent, en ml, d’hydroxyde de sodium déterminé précédemment
Mac est la masse molaire de la molécule d’acide lactique.
V0 est le volume du lait
Calcul du degré Dornic D : par la formule suivante :

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