Royaume du Maroc

Université Sultan Moulay Slimane

Ecole Supérieure de Technologie Béni Mellal

Licence Professionnelle: Industrie Alimentaire (IA)

Module: Traitement des déchets

𝑻𝑷𝟏 (Le 30/11/2021)

Etude Microscopique des Levures & des Moisissures

Réalisé : Année Universitaire :

- RZAK Ilham 2021/2022

- NAM Ayoub
 Introduction
L’antibiogramme est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou plusieurs
antibiotiques par la technique de diffusion sur milieux gélosé. Il a pour but de guider le clinicien
dans le choix d’un antibiotique pour traiter une infection bactérienne, d’exploitées les données
pour la surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques.

Les antibiotiques sont des substances chimiques naturelles ou de synthèse, utilisées pour
traiter les infections bactériennes Il existe plusieurs familles d'antibiotiques, chacune étant
efficace contre une bactérie ou un groupe restreint de bactéries.
L’antibiotique fonctionne soit comme un inhibiteur de la synthèse :
 des enveloppes.
 des protéines.
 des acides nucléiques.
 d’acide folique.
Les antibiotiques qui on va tester leur efficacité dans ce travail sur la bactérie Escherichia coli
sont :
La teicoplanine (TEC 30µg) : est un antibiotique bactéricide, appartient à la famille
glycopeptides, produit par la fermentation d'Actinoplanes teichomyceticus.
La tetracycline (TE 30µg) : un antibiotique Bactériostatique, appartient à la famille des
cyclines produit par une bactérie du genre Streptomyces.
La tobramycin (TMN 30µg) : est un antibiotique bactéricide appartient à la famille des
aminosides produit à partir du Streptomyces tenebrarius.
(30 µg c’est la dose nécessaire pour obtenir une activité bactériocyte pour les antibiotiques TE
et TEC et activité bactériostatique pour l’antibiotique TMN).

Ce TP a pour but de tester la sensibilité ou la résistance de la bactérie Escherichia coli

aux antibiotiques TE, TEC et TMN par le test d’antibiogramme.
1. Milieu de culture: Gélose de Mueller- Hinton
1.1. Définition
Mueller-Hinton est un milieu de culture recommandé pour l'étude de la sensibilité des
bactéries aux antibiotiques et également comme milieu de base pour la préparation d'une
gélose au sang. Son principe repose sur la croissance de la plupart des bactéries favorisant les
substances nutritives apportées par l'infusion de viande de bœuf et l'hydrolysat acide de
caséine (peptone).

1.2. Conservation
Il se présent sous forme de poudre au début (pré-coulé) à une température située environ de -
20°C, une fois on veut l’utiliser, on augmente la température à -8°C. Au niveau de la
préparation du milieu à ensemencer, on l’utilise à une température entre 15 et 25°C en
ajustant le pH à 7.5.

1.3. Composition
La composition des géloses MH, doit être suffisamment maitrisée pour que les résultats
obtenus lors de l’étude de l’activité des antibiotiques soient reproductibles :

Composés Proportion en gramme (g)

Viande de bœuf infusée déshydraté 4

Hydrolysat acide de caséine 17,5
Amidon de Maïs 1,5
Agar 12
Eau distillée 1000
1.4. Préparation
Toujours agiter avant chaque utilisation,

- Dissoudre 38 grammes de poudre dans un litre d'eau distillée.

- Porter à ébullition jusqu'à dissolution complète.

- Répartir en tubes ou flacons et stériliser à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes.

Taux de reconstitution: 35 g/l 500 grammes de poudre permettent de réaliser 14,2
litres de milieu.

1.5. Protocole
 - Au moment de l'emploi, faire fondre le milieu au bain-marie bouillant et le couler en
boites de Pétri. L'épaisseur de la couche de gélose doit être de 4 min.

- Sécher les boites 30 minutes à 37°C, Pour la technique et la lecture de

l'antibiogramme.

2. Méthodologie
Avant de commencer il faut organiser le poste de travail en localisant la zone où on va
manipuler le matériel, toutes les opérations doit être effectuées dans une zone stérile, ainsi il
faut porter des gants pour assurer la sécurité microbiologique.

2.1. Préparation de la culture en milieu solide

La souche de bactérie d’Escherichia Coli concernée dans ce travail est un gram -,
considéré comme une souche sauvage, indésirable dans les denrées alimentaires en raison sa
nuisibilité, C’est pour cela qu’il faut prendre en compte tous les précautions lors de sa
manipulations (masque, les gants, mesures d’hygiène...etc.).

A partir de cette souche conservée au milieu glycérol à une température -20°C, on

l’ensemencer sur un milieu nutritif (comme VNBL) après l’incubation du boite, on obtenue des
souches jeunes qui on va les utiliser pour préparer la suspension bactérienne.

2.2. Préparation de la suspension bactérienne

A partir d'une culture pure et fraîche, préparer une suspension d'une opacité équivalente au
standard de Mac Farland 0,5 c’est une norme pour ajuster la suspension bactérienne.
Mac Farland 0,5 correspond à 1,5x108 cellule/ml d’Escherichia coli.

 Prélever une colonie à partir la gélose avec une anse stérile.

  Introduire l’anse dans un tube ou un bécher contenant eau physiologique.

1 2

!!!!!!

2.3. Ensemencement par inondation et le dépôt des disques

 Inonder la boîte entière avec la suspension obtenue puis enlever l'excès de suspension.
 Déposer les différents disques d’antibiotique sur la surface de milieu manuellement à
l’aide d’une pince stérile.
 Incuber la boite à une température de 37°C pendant 24h jusqu’à 48h.
 Après l’incubation on récupère la boite et on passe à la lecture des résultats.

Désinfecter la pince avant Prélever les disques Déposer les disques

l’utiliser des antibiotiques

4. Résultat et discussion
4.1. Procédure
- Après l’incubation pendant 48h à 37°C, on amène les boites de pétri (en portant les
gants) entre les deux becs de benzène et on observe à l’œil nu la zone qui entoure
chaque disque
- On sert à mesurer le diamètre de chaque galerie (à l’aide d’une règle) en apercevant
s’elle est colorée ou non.
 4.2. Observation et interprétation
D’après les résultats on voit qu’il y a des zones incolores ou dans certains cas sont colorés, ce
qui correspond à la sensibilité de cette bactérie aux antibiotiques :

- Pour l’antibiotique TMN, le diamètre est égal 2,5 cm.

- Pour l’antibiotique TEC, le diamètre est environ de 2,3 cm.
- Pour TE, il n’y pas diamètre (D = 0).

On voit des zones incolores, ce qui traduit la sensibilité de la bactérie à l’antibiotique

(Exemple de TEC) et l’effet bactéricide ou bactériostatique. Par contre on a trouvé
des zones normales (les disques sont entourés par l’inoculum), on parle ici de sa
résistance à l’antibiotique.

En cas de sensibilité :

 La teicoplanine (TEC 30 µg) : la teicoplanine bloque la transpeptidation par fixation

aux peptides précurseurs de la paroi bactérienne ce qui conduit à l’état de stress puis la
lyse bactérienne
 La tetracycline (TE 30µg) : Les tétracyclines agissent au niveau de la synthèse
protéique de la bactérie, grâce à sa capacité de diffusion intracellulaire, en empêchant
la synthèse protéique par rupture de la liaison ester située avec les acides aminés
(inactivation de l’enzyme acétyle transférase) Donc, la réplication, la division cellulaire
bactérienne et la multiplication des bactéries sont stoppées (Approche bactériostatique)
 La tobramycin (TMN 30µg) : elle se caractérise par un effet bactéricide dose-
dépendant par liaison à la sous-unité 30S du ribosome bactérien et interférence avec la
 synthèse de protéines bactériennes, menant ultimement à des protéines non
fonctionnelles.

En cas de résistance :

En général lors que la bactérie a l’aptitude de résister à l’effet de l’antibiotique, c’est dû à

l’incompatibilité de l’antibiotique avec l’enveloppe bactérienne. Autrement dit, les sites actifs
de l’antibiotique ne peuvent pas se fixer aux récepteurs de la bactérie.

Donc l’effet de chaque antibiotique dépend à la souche microbienne concerné, ce qui traduit
la grande diversité des antibiotiques en fonction de l’agent ciblée.

4.3. Mise en route d'une antibiothérapie

Différentes techniques d'évaluation de l'activité des antibiotiques peuvent être mises en couvre
au laboratoire de bactériologie : elles reposent sur les mesures de CMI (concentration minimale
inhibitrice) et CMB (concentration minimale bactéricide). La mise en route d'une
antibiothérapie avant que l'infection soit documentée tient compte du spectre des antibiotiques.
Si l'infection est documentée, l'antibiogramme donne une réponse qualitative (sensible,
intermédiaire, résistant) à un panel d'antibiotiques.

4.3.1. concentration minimale inhibitrice (CMI)

La CMI est la plus petite concentration en antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance
d’une bactérie, Elle correspond à plus petite quantité d'antibiotique qui inhibe toute culture
visible d'une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise
l'effet bactériostatique d'un antibiotique.

Pour déterminer la CMI d’un antibiotique, on teste des concentrations croissantes d’antibiotique
vis à vis d’un germe.

La méthode classique se fait par dilution en milieu liquide.

 On met dans chaque tube une même quantité connue de bactérie, et on ajoute des
quantités croissantes d’antibiotique.
  Au bout de 18 heures si le tube est trouble, c’est que la bactérie s’est multipliée,

 Le premier tube clair nous donne la CMI

 On met une petite goutte de ce tube dans un cuve de spectrophotomètre jusqu’au le trait
et on mesure sa densité optique par un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 320
nm.

On détermine la valeur de CMI par sa relation avec la turbidité

- N.B :

On parle de 𝐶𝑀𝐼50 , lorsque sa valeur est à partir laquelle, il y a une inhibition de 50 % de la

population

4.3.2. Concentration minimale bactéricide (CMB)

La CMB est la plus petite concentration d'antibiotique laissant 0,01% ou moins de survivants
de l'inoculum initial après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise
l'effet bactéricide d'un antibiotique.

Pour la déterminer, on utilise le même protocole de CMI, avec une différence de la longueur
d’onde, cette fois est à 800 nm