Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

Ministre de lenseignement suprieur et de la recherche scientifique

Universit Ferhat Abbas Stif

Facult des sciences de la nature et de la vie

Dpartement de Microbiologie

Travaux pratiques de systmatique bactrienne

Table des matires

2. Purification des souches 3. Conservation des souches 4. Identification des souches purifies 4. 1. Etude des caractres morphologique 4. 1. 1. Examen macroscopique 4. 1. 2. Aspect microscopique 4. 1. 2. 1. Observation ltat frais 4. 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de mthylne 4. 1. 2. 3. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram 4. 1. 2. 4. Techniques de colorations particulires : Coloration des spores : mthode au vert de Malachite 4. 1. 3. Etude des types respiratoires 4. 1. 3. 1. Culture en arobiose 4. 1. 3. 2. Culture en anarobiose 4. 1. 4. Etude des enzymes respiratoires terminales 4. 1. 4. 1. Recherche de loxydase 4. 1. 4. 2. Recherche de la catalase 4. 2. Etude des caractres biochimiques 4. 2. 1. Le mtabolisme glucidique 4. 2. 2. tude des diffrentes voies fermentatives intermdiaires 4. 2. 2. 1. Raction au rouge de mthyle 4. 2. 2. 2. Raction de Voges-Proskauer (Production dactone)

4. 2. 3. Production du gaz partir du glucose 4. 2. 4. Recherche de -galactosidase 4. 2. 5. Mtabolisme des composs azots 4. 2. 5. 1. Recherche de nitrate rductase 4. 2. 5. 2. Recherche de lurase 4. 2. 5. 3. Mtabolisme protique 4. 2. 5. 3. 1. Recherche des dcarboxylases : Lysine dcarboxylase (LDC), Ornithine dcarboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH) 4. 2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane dsaminase (TDA) 4. 2. 5. 3. 4. Production dindole 4. 2. 6. Mtabolisme des molcules larges 4. 2. 6. 1. Recherche de lcithinase 4. 2. 6. 2. Recherche de lipase 4. 2. 6. 3. Recherche d-amylases 4. 2. 6. 4. Recherche des protases 4. 2. 6. 4. 1. Recherche de la casinase 4. 2. 6. 4. 2. Recherche de la glatinase 4. 2. 6. 5. Recherche de citrate permase 4. 2. 7. Autres tests 4. 2. 7. 1. Utilisation du mannitol 4. 2. 7. 2. Recherche dhmolysines 4. 2. 7. 3. Lantibiogramme 4. 2. 7. 4. Systmes didentifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E 4. 2. 7. 5. Croissance sur milieu King (King A et King B):

Annexe Composition des milieux de cultures utilises Colorants et ractifs utilises

1. Isolement des souches 2. Purification des souches Aprs 24h dincubation, les cultures sont purifies. Celle-ci qui permet dobtenir des cultures pures partir de souches obtenues. La slection est base sur laspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le diamtre, lopacit Un chantillon de chaque type de colonie est prlev ensuite purifi par repiquage successif selon la mthode de stries (Austin, 1988). 3. Conservation des souches Les souches isoles sont conserves dans des tubes essai contenant un milieu GN inclin (annexe 2). Les souches sont ensemences sur la pente des tubes par la mthode des stries, puis incubes 30C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu une croissance seront conservs 4C pour une dure de 4 6 semaines. Afin de pouvoir toujours disposer de souches viables, la ractivation doit se faire tous les mois (Marchal et Bourdon, 1982). 4. Identification des souches purifies Lidentification des isolats est base sur leurs caractristiques morphologiques,

physiologiques et biochimiques (Coloration de Gram, dtermination de la temprature dincubation, catalase, croissance dans NaCl, croissance en anarobiose, test de VogesProskauer et de rouge de Mthyle, Croissance pH 5.7, la fermentation des carbohydrates, lhydrolyse de lamidon, utilisation du citrate, la formation dindole, formation du dihydroxyacetone, damination du phnylalanine, hydrolyse de casine, dgradation de tyrosine, hydrolyse de glatine, jaune d'uf lcithines) et sur les systmes didentification rapides (galerie API 20E). 4. 1. Etude des caractres morphologique Cette tude est base sur des observations macroscopiques et microscopiques (x100) permettant de diffrencier le type de Gram, les coques, les bacilles ainsi que la disposition des cellules.

4. 1. 1. Examen macroscopique Lobservation de laspect macroscopique des colonies permet deffectuer une premire caractrisation, avec une orientation possible des rsultats au cours de lidentification. Daprs les auteurs Thoma et al. (1970), les lments didentification macroscopiques sont : La forme des colonies : rondes, irrgulires,etc. La taille des colonies par la mesure du diamtre : pinctiformes ou non pinctiformes. La chromognse : couleur de la colonie. Llvation : convexe, concave, plate. Lopacit : opaque, translucide ou transparente. La surface : lisse, rugueuse, sche, dentele,etc.

4. 1. 2. Aspect microscopique 4. 1. 2. 1. Observation ltat frais Ce test permet de dterminer la forme, larrangement et la mobilit des bactries. Il consiste en lobservation dune goutte de suspension bactrienne, prpare avec de leau physiologique et place entre lame et lamelle. Lobservation se fait sur microscope photonique. a) 1. Mode opratoire -Dposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. -Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas dborder les contours de la lamelle). -Luter la lame avec de la paraffine fondue. -Observer immdiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relev au maximum, diaphragme non compltement ouvert). -Aprs observation jeter immdiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel. a) 2. Observation au microscope Elle se fait en lumire blanche, clairage direct de la prparation (grossissement : objectif x 40).

4. 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de mthylne b) 1. Technique -Faire un frottis des bactries sur une lame propre et sche : avec une anse on tale doucement un peu de suspension bactrienne sur le milieu de la lame. -Scher. -Fixer lalcool et rincer leau, ou fixer la flamme en passant la lame trois fois dans la flamme du bec Bunsen rgl en flamme clairante (virole ferme). -Recouvrir dune solution de bleu de mthylne pendant une minute. Rincer et scher entre deux papiers-filtres. Eliminer lhumidit rsiduelle au-dessus de la veilleuse du bec Bunsen. b) 2. Observation A limmersion (grossissement : objectif x 100). En lumire blanche. 4. 1. 2. 3. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram C'est une double coloration qui nous permet de connatre la forme, l'arrangement, la puret ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifies. Cette coloration permet de classer les bactries selon leur capacit fixer le cristal violet. Celles qui possdent une enveloppe externe sont dcolores lors du lavage lthanol (Gram-), alors que celles qui nen possdent pas vont retenir le colorant (Gram+) (Perry, 2004). La consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond des diffrences biochimiques entre la paroi des bactries Gram positif et les bactries Gram ngatif (Marchal et Bourdon, 1982). Technique : - Prparer et fixer un frottis bactrien la chaleur du bec Bunsen. - Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1min. Eliminer l'excs par l'eau courante; - Ajouter du Lugol : deux bains de 45 secondes, jeter l'excs par l'eau courante; - Traiter l'alcool 95 pendant 30 secondes, puis rinage l'eau; - Recolorer la Fuschine pendant 1 2 minutes, rinage l'eau puis schage; L'observation se fait en ajoutant de l'huile immersion .Les bactries Gram positif se colorent en violet alors que les Gram ngatif se colorent en rose.

4. 1. 2. 4. Techniques de colorations particulires : Coloration des spores : mthode au vert de Malachite Le but : Permet la mise en vidence des spores dans les bactries. La Technique : Faire un frottis des bactries sur une lame propre et sche ; Scher le frottis ; Fixer lalcool puis rinc leau, ou la flamme en passant trois fois dans la flamme (ou au-dessus du bec) ; Colorer avec une solution de vert Malachite 5% pendant 10 minutes ; Rincer leau distille ; Colorer la safranine ou au mercurochrome 5% pendant 1 minute ; Rincer leau distille ; Scher. Observation de la prparation : Observer le frottis limmersion (objectif 100). 4. 1. 3. Etude des types respiratoires 4. 1. 3. 1. Culture en arobiose Principe: Les microorganismes arobies peuvent tre cultivs sur milieu glos inclin en tubes ou en boites de Ptri. Lensemencement seffectue en surface par stries (ou talement au rteau dans les boites). La culture se dveloppe en surface. Cette technique permet dtudier la morphologie coloniale mais ne permet pas dobtenir une grande quantit de culture. La culture en tubes de milieu liquide bouchs coton card ne permet qune arobiose incomplte. On lutilise dans le cas o le rendement de culture importe peu (Guiraud et Galzy, 1980). - Incubation 30C pendant 24 heures. 4. 1. 3. 2. Culture en anarobiose Principe: Une anarobiose partielle avec atmosphre enrichie en CO2 peut tre facilement ralise en utilisant un rcipient ferm dans lequel on place une bougie allume ct des boites de Ptri

ou des tubes de milieux. Le rcipient est ferm et la bougie steint au bout de quelques instants en ayant consomm de loxygne et libr du gaz carbonique (Guiraud et Galzy, 1980). - Incubation 30C pendant 24 heures. Lecture: Lorsquil y a une croissance, en dit ; la bactrie est anarobie. 4. 1. 4. Etude des enzymes respiratoires terminales 4. 1. 4. 1. Recherche de loxydase Principe Ce test permet la dtection de la phnylne-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase; enzyme entrant dans divers couples d'oxydorduction. Agissant sur un substrat incolore, cet enzyme entrane la formation d'une semi-quinone rouge. Cette dernire, trs instable, s'oxyde rapidement pour donner un compos noirtre (Marchal et Bourdon, 1982). La technique Sur un papier filtre strile, dposer un disque d'oxydase imprgn de dimthyl-para-phnylne diamine. Humidifier le disque avec quelques gouttes d'eau distille strile. Un excs d'eau peut nuire la lecture. l'aide d'un cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24heures) et la dposer sur le disque. Lecture: Apparition d'une coloration violette immdiatement : la souche est dite oxydase positive. 4. 1. 4. 2. Recherche de la catalase Principe: La catalase est un enzyme ayant la proprit de dcomposer le peroxyde d'hydrogne (H2O2) avec dgagement d'oxygne selon la raction suivante (Marchal et Bourdon, 1982) :

Technique: Sur une lame et laide dune pipette Pasteur, on dpose une colonie bactrienne laquelle on ajoute de l'eau oxygne ( 10 volumes). Lecture: Catalase+ : effervescence. Catalase - : pas d'effervescence. 4. 2. Etude des caractres biochimiques Grce cette tude, il est possible de connatre certaines caractristiques du mtabolisme des bactries isoles. Les tests biochimiques permettent donc de vrifier si la bactrie a un mtabolisme oxydatif ou fermentatif, sil y a formation dun acide la suite de lutilisation dun hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un compos particulier est utilis comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide amin peut tre transform (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier est prsent (ex : oxydase, catalase, pectinase ...) ou si des molcules complexes sont dgrades (ex : glatine, amidon ...). 4. 2. 1. Le mtabolisme glucidique Le milieu utilis est le milieu Hugh et Leifson (annexe 2) de couleur vert, Ce milieu permet de dterminer la voie d'attaque des glucides, comme par exemple le glucose. Milieu de type MEVAG : Milieu d'tude de la Voie d'Attaque des Glucides. L'acidification ou non des glucides : glucose, arabinose et xylose suffisent gnralement pour l'identification. Principe De l'tude du mtabolisme nergtique il dcoule que un glucide peut tre catabolis par voie respiratoire ou par voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus. La dgradation d'un glucide s'accompagne gnralement d'une acidification du milieu : - lors des respirations le glucide est oxyd en CO2, par le dioxygne (ou un autre oxydant minral) ; - lors des fermentations le glucide est oxyd en acides, alcools, qui sont librs dans le milieu qu'ils acidifient sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont cependant pas galement acidifiantes.

Le milieu de Hugh et Leifson contient un indicateur de pH, le bleu de bromothymol, qui prend une couleur jaune en milieu acide. Technique - Rgnrer le milieu au bain-marie bouillant. Ramener 45-50C. - Ajouter aseptiquement le glucide tudi (glucose, arabinose, xylose, maltose, galactose, saccharose, cellobiose et trehalose) pour obtenir une concentration finale de 1%. - Agiter (l'agitation doit tre douce pour viter l'entre d'air) et laisser le milieu se solidifier (en le passant sous l'eau froide par exemple). - Ensemencer par piqre centrale les deux tubes de Hugh et Leifson, l'un sera recouvert d'une couche d'environ 1-1.5cm d'paisseur de vaseline strile, - Deux tubes non ensemencs, l'un additionn de vaseline strile l'autre sans vaseline qui seront utiliss comme tmoins, - Ne pas revisser fond le bouchon. - Incuber les tubes ensemences et les tmoins l'tuve 30C pendant 24 48 heures. Lecture: Bactries fermentatives: virage au jaune du tube avec vaseline. Bactries oxydatives : virage au jaune du tube sans vaseline. Bactries oxydatives fermentatives: virage au jaune des tubes avec et sans vaseline. 4. 2. 2. tude des diffrentes voies fermentatives intermdiaires Principe Cette tude permet deffectuer une diffrenciation entre la fermentation des acides mixtes (raction rouge de mthyle : RM) et butylne glycolique (raction Voges-Proskauer, VP). Ces deux ractions ont un intrt diffrent, mais elles peuvent tre effectues sur le mme milieu et le plus souvent, se vrifiant mutuellement, une souche RM+ est habituellement VP- et vice versa. 4. 2. 2. 1. Raction au rouge de mthyle : elle consiste mettre en vidence lacidification finale dun milieu glucos par la fermentation du glucose, cette acidification provoque le virage du rouge de mthyle (rouge un pH 5; jaune pH 5.8).

4. 2. 2. 2. Raction de Voges-Proskauer (Production dactone) : certaines bactries sont capables de produire de lactyl-mthyl carbinol, soit partir de deux molcules dacide pyruvique, soit, le plus souvent au cours de la fermentation de 2-3 butylne glycolique.

En prsence dune base forte lactone donne une coloration rouge au milieu oxygn (oxydation en diactyle). Le diactyle form ragit avec le groupement guanidine de compos rouge. - naphtol pour donner un

Technique : Une colonie de la souche tudier est ensemence sur le milieu Clark et Lubs puis incuber 30C pendant 24 48 heures. Aprs lincubation, diviser le milieu dans deux tubes striles, verser quelques gouttes de VP I et quelques gouttes de VP II dans lun des tubes, et dans lautre, ajouter quelques gouttes de ractif RM (rouge de mthyle). Lecture: Test VP: Coloration rouge: VP+. Coloration jauntre: VP-. Test RM: Coloration rouge: RM+. Coloration jauntre : RM-. 4. 2. 3. Production du gaz partir du glucose Un milieu liquide (le bouillon nutritif) additionn de 0.004 % de rouge de phnol et 10% du glucose strile avec ventuellement une cloche de Durham. Inoculer le milieu et incuber pendant 24h.

4. 2. 4. Recherche de -galactosidase Principe: Pour dgrader activement le lactose, les microorganismes doivent possder deux enzymes ; la permase et -galactosidase. Lpreuve ONPG permet de mettre en vidence la -galactosidase qui dgrade lONPG soit lorthonitrophnyl- -D- galactopyranoside qui possde une structure analogue au lactose. Le lactose est form de deux molcules de glucose et de galactose, tandis que lONPG est compos dune molcule dorthonitrophnyl lie un galactose. Lhydrolyse de lONPG (compos incolore) libre lorthonitrophnyl qui est responsable de la coloration jauntre de milieu, Ce processus se fait selon la raction illustre dans la figure 7.

Fig. 7 : Raction dhydrolyse de lONPG (Marchal et Bourdon, 1982).

Technique: - Prparer une suspension dense d'une culture bactrienne tudier dans un tube essai strile contenant 0.5ml d'eau physiologique, puis y ajouter un disque ONPG. - incuber au bain Marie 37C pendant 24 heures. Lecture: La lecture se fait des intervalles de temps diffrents : aprs 15mn, 30mn, 1 heure, 6 heures et 24 heures. Le test ONPG est positif lorsque la suspension bactrienne se colore en jaune citron.

- Utilisation des sucres TSI (glose au glucose, lactose, saccharose): Principe: Cette mthode permet de mettre en vidence dune part, la fermentation du glucose (avec ou sans dgagement de gaz), du lactose, du saccharose et dautre part, la production d'hydrogne de sulfate (H2S). C'est un milieu inclin dont le glucose prsent dan le culot, est attaqu par voie fermentative entranant une acidification du milieu avec production ou non de gaz. Sur la pente, le lactose et le saccharose seront alors oxyds et ferments. La production du H2S se manifeste par un noircissement du culot (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: Une colonie est ensemence en ralisant une piqre centrale dans le culot et des stries serrs sur la pente. Remettre le bouchon du tube sans le revisser. Incubation 30C pendant 24 heures. Lecture: Lactose-saccharose positif : pente virant au jaune; Glucose positif: culot jaune; H2S positive: noircissement du milieu dans la zone joignant la pente et le culot. Production de gaz : prsence de bulles de gaz dans le culot. 4. 2. 5. Mtabolisme des composs azots 4. 2. 5. 1. Recherche de nitrate rductase Principe: L'tude de la rduction des nitrates se fait par la mise en vidence des nitrites forms. Ces derniers en milieu actique ou sulfurique, donnent une coloration rose. Lenzyme nitrate rductase B catalyse la raction des nitrates en nitrites (rduction assimilatrice) (Marchal et Bourdon, 1982).

Les nitrates peuvent aller galement jusquau stade azote (N2). Dans ce cas, on doit complter par l'preuve de Zoo Bell, preuve qui consiste ajouter de la poudre de zinc au milieu: - si le zinc rduit les nitrates encore prsents en nitrites, la coloration rose apparat et la raction est ngative (bactries sans nitrate rductase). - si au contraire, la teinte du milieu reste inchange, le stade nitrite a t dpass donc les bactries possdant un nitrate rductase trs active (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: A une culture en bouillon nitrat de 24 48h d'incubation 30C, on ajoute cinq gouttes de ractif de Griess. Aprs agitation, la lecture est immdiate. Lecture: - coloration rose ou rouge: nitrates rduits en nitrites (nitrate rductase positive NR+). - milieu restant incolore: ajouter un peu de poudre de zinc (rducteurs des nitrates) ; agitation, inclinaison du tube de culture en position presque l'horizontale et attendre cinq minutes avant la lecture: - si le milieu devient alors rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n'ont pas t rduits par la bactrie: nitrate rductase ngative NR . - si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactries les ont rduit au-del du stade nitrites: nitrate rductase positive NR .
+ -

4. 2. 5. 2. Recherche de lurase Principe: Toutes les bactries hydrolysent l'ure grce la raction suivante:

Seule, une urase trs active aboutit finalement la raction :

Le CO2 et le NH3 se combinent en donnant le carbonate d'ammonium:

Carbonate d'ammonium. Le carbonate d'ammonium alcalinise le milieu (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: La recherche de lurase se fait selon le procd : Dans les tubes dure agar, et laide dune anse strile, on ensemence des colonies de la souche test ge de 24h, on incube 30C pendant 24 heures. Lecture: La lecture seffectue comme suit : - Lurase est positive sil y a virage de couleur du jaune vers le rouge violac ou vers le rose rouge. - Lurase est dite ngative sil ny a pas de changement de couleur.

4. 2. 5. 3. Mtabolisme protique 4. 2. 5. 3. 1. Recherche des dcarboxylases : Lysine dcarboxylase (LDC), Ornithine dcarboxylase (ODC) et Arginine dihydrolase (ADH) Principe: Les dcarboxylases ou carboxylases, scindent les acides amins entranant la formation de l'amine correspondant avec la libration de CO2 suivant la raction :

Il s'agit d'enzymes induites dont la synthse est favorise par un pH acide (pH =3.5-5.5) et des conditions d'anarobiose (Marchal et al. ,1982). Les dcarboxylases sont:

Technique: Le test est ralis avec le milieu Moeller rparti dans 4 tubes hmolyse diffrents: 1- le premier tube constitue le tmoin. Il contient essentiellement du glucose en petite quantit et du pourpre de bromocrsol comme indicateur de pH. 2- les trois autres tubes contiennent en plus du milieu tmoins, un des trois acides amins suivants : Arginine, Lysine ou Ornithine. 3- aprs ensemencement, 1ml de vaseline strile est ajout dans chaque tube et le tout sera incub 30C pendant 24 48h.

La lecture: - la raction est positive lorsque le tmoin vire au jaune (acidification du milieu due l'utilisation du glucose). Les tubes contenant l'acide amin restent violet (phnomne due l'alcalinisation). - la raction est ngative lorsque les tubes contenant l'acide amin et le tmoin virent au jaune (acidification). 4. 2. 5. 3. 2. Recherche du tryptophane dsaminase (TDA) Principe: La dsaminase agit sur le L- tryptophane en donnant l'acide pyruvique. Ce dernier donne avec le perchlorure de fer (Fe Cl3) une coloration brune (Marchal et Bourdon, 1982). Technique : Ensemencer le milieu ure-indole (0.5ml) d'une suspension bactrienne dense. Incuber 30C pendant 24 heures. Lecture: Aprs lajouter de quelques gouttes du ractif TDA, si : - Une coloration brun fonc: TDA positive. - Une coloration brun clair (du ractif): TDA ngative. 4. 2. 5. 3. 4. Production dindole Le test indole sert dterminer si la bactrie produit de lindole partir du tryptophane (acide amin).

 laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture liquide indole (voir annexe 2) avec la bactrie identifier (culture de 18-24heures). Incuber 26oC pour 48 heures. la suite de lincubation, ajouter 3 gouttes du ractif de Kovac (bioMrieux) sous la hotte chimique. Lecture: Aprs agitation: - Anneau rouge vermillon en surface : indole positif. - Anneau bruntre (couleur du ractif): indole ngatif. 4. 2. 6. Mtabolisme des molcules larges 4. 2. 6. 1. Recherche de lcithinase De nombreux micro-organismes peuvent hydrolyser les phospholipides, et tout

particulirement la phosphatidylcholine (ou lcithine). La prolifration de ces microorganismes dans des aliments riches en lipides (lait et drivs, jaune d'uf, viandes) est l'origine d'altrations de ces aliments. La recherche et l'identification des bactries lipolytiques ont un intrt tout particulier en microbiologie alimentaire. Principe La lcithine purifie tant trs coteuse on utilise comme source de lcithine le jaune d'oeuf, jaune d'uf qui est incorpor dans une glose ordinaire. La prsence d'autres lipides, et la formation de complexes lipoprotiques, rendent la lecture dlicate. Deux protines peuvent tre recherches :

-La lipoprotinase: qui dgrade les protines des complexes lipoprotiques, ce qui augmenterait la solubilit des phospholipides contenus dans ces complexes. On observe d'un point de vue technique une clarification de la glose autour de la strie d'ensemencement. Composition du milieu Glose Trypticase-Soja additionne de jaune d'uf strile dilu au 1/2 en eau physiologique (concentration finale 10% soit 2,5 ml pour 25 ml de milieu). Technique Faire une strie la surface du milieu, ou ventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus 37C. La lecture La prsence dclairage entourant les colonies se traduit par une raction positive (Prsence de lcithine). 4. 2. 6. 2. Recherche de lipase De nombreuses bactries doues dactivit lipolytique et estrasique. Les graisses sont dcomposes en acides gras et glycrol par une enzyme appele la lipase (figure. 1). Les lipases sont un groupe de divers enzymes qui catalysent l'hydrolyse des liaisons ester dans les triacylglycerides, montrant l'activit sur une grande varit de substrats. Dans les systmes non aqueux, les lipases catalysent la raction renverse, c.--d. la synthse dester et la transesterification, et elles peut galement des ractions directes de stroslective et rgioselective (Ruiz et al., 2002).

Fig. 8: Hydrolyse de graisse par la lipase

La technique Une glose en boite de Ptri, additionne de tween 80 16ml/l (monolate de sorbitol), est ensemence en piqure (ou par spots) partir dune culture en milieu solide de la souche tudier. Incuber 24-48h 37C. Aprs incubation, les colonies de souches lipase (+) sont entoures dun halo opaque form suite la prcipitation dacides gras issus de la lipolyse. 4. 2. 6. 3. Recherche d-amylases L'amidon, est un polymre de l'amylose (polymre linaire des molcules de glucose lies par liaisons 1,4-glycosidique) et de l'amylopectine (polymre embranch des molcules de glucose lies par des liaisons 1.4- et 1,6-glycosidique). Une chane se compose de quelques cent quelques mille units de glucose qui forment une structure hlicodale en laquelle de l'iode peut tre emprisonn. Les bactries qui produisent l'amylase (amyloglucosidase) peuvent hydrolyser l'amidon en polysaccharides plus courts (dextrines) et finalement en disaccharides et monosaccharides (figure 9). (Madigan et al., 1999).

Fig. 9: Hydrolyse d'amidon par l'amylase (Madigan et al., 1999).

La technique 1. Verser 14 ml du milieu agar l'amidon strile dans une bote de Ptri 2. Laisser l'agar solidifier 3. Marquer le plat d'agar lamidon avec le nom de la bactrie inoculer 4. Strier une baisse culture bactrienne sur le plat d'agar l'amidon 5. Incuber invers au 30 C pendant 48 heures 6. Quand les colonies sont videntes, inonder le plat avec la solution de Lugol 7. Laisser l'iode ragir pendant au moins 1 minute 8. Verser outre de l'iode du plat 9. Laver le plat avec leau distill. 4. 2. 6. 4. Recherche des protases Les enzymes protolytiques catalysent l'hydrolyse des protines dans de plus petits fragments peptidiques et acides amins. Les liaisons sont casses par l'addition de l'eau entre les groupes adjacents carboxyliques et amines (figure 10).

Fig. 10: Hydrolyse de protine par la protase (Madigan et al., 1999).

4. 2. 6. 4. 1. Recherche de la casinase La casine est un mlange des phosphoprotines (un polymre complexe des acides amins essentiels) trouves en lait de vache jusqu'au degr environ de 2.5% en poids. Il existe en lait comme sel hydrosoluble de calcium d'une phosphoprotine et peut tre hydrolyse par une srie d'enzymes appeles casinase. (Madigan et al., 1999). La technique Mlanger 1 g d'agar suspendu dans 50 ml dH2O au lait crm en poudre de 5 g suspendu dans 50 ml dH2O pour faire 100 ml "agar de lait crm" ; pH = 7.2. Autoclave et couler les boites. 1. Verser 14 ml de milieu agar au lait crm strile dans une bote de Ptri 2. Laisser l'agar solidifier 3. Marquer le plat d'agar avec le nom de la bactrie inoculer

4. Inoculer les plats avec une strie d'inoculum 5. Incuber les plats inverss 30C pour 48 h 6. Quand les colonies sont videntes inspecter les plats pour assurer les zones claires autour et au-dessous des colonies casinase-positives. 4. 2. 6. 4. 2. Recherche de la glatinase Les bactries qui ont une activit protolytiques forte, produisent en gnral une glatinase. La glatinase ou collagnase est une protase qui hydrolyse le collagne en acides amins ou en peptides. L'hydrolyse ou la liqufaction de glatine est montre par un test dans lequel l'organisme se dveloppe dans un milieu nutritif a solidifi par la glatine. La technique Un milieu la glatine (annexe 2) est prpar, striliser lautoclave et rparti dans les tubes essais. Ensemencer le milieu par piqure centrale aprs refroidissement et incuber pendant 24-48h 30C. - Enlever les tubes de glatine nutritive de l'incubateur et les placer dans le rfrigrateur 4C pendant 30 minutes ou dans un bain de glace pendant 3 5 minutes. - Notifier si la surface du milieu est liquide ou gel. Si la glatine nutritive est liquide, ceci indique que la glatine a t hydrolyse par la bactrie. Si aucune hydrolyse ne se produisait, le milieu demeurera un gel. 4. 2. 6. 5. Recherche de citrate permase
Principe

Le milieu utilis est le citrate de Simmons (annexe 2), qui ne contient que le citrate comme seule source de carbone. Seules les bactries possdant une enzyme citrate permase seront donc capables de se dvelopper sur ce milieu.

L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu (Marchal et Bourdon, 1982).

Technique La pente du milieu est ensemence d'une suspension bactrienne, par stries longitudinales au moyen d'une anse. Les tubes sont lgrement ferms. L'incubation se fait 30C pendant 3 5 jours. Lobservation a lieu chaque jour. Lecture: La croissance de la bactrie sur le milieu indique que cette dernire possde du citrate permase. Cependant sil ny a pas de dveloppement, la bactrie ne possde pas cette enzyme. 4. 2. 7. Autres tests 4. 2. 7. 1. Utilisation du mannitol Un tube contient le milieu bouillon du mannitol avec le rouge de phnol (annexe 2) est inoculer avec la souche bactrienne et est incuber pendant 24h 30C. Lorsque le milieu vire en jaune, on dit que la bactrie est mannitol positif. 4. 2. 7. 2. Recherche dhmolysines Lagar de sang (annexe 2) (BA) contient des nutriments gnraux et 5% de sang de mouton. Il est utile pour la croissance dorganisme fastidieux et pour la dtermination des capacits hmolytique. Certaines bactries produisent des exoenzymes qui lysent les globules rouges et dgradent lhmoglobine; les hmolysines. Il existe diffrents types dhmolysines. Les Beta hmolysines lyse les globules rouges et dgradent lhmoglobine compltement. Ceci rsulte en une zone dclaircissement complte. De tels rsultats se disent une hmolyse-. La technique 1. Faire un striage pour colonies simple de votre inconnu sur une glose de sang. 2. Incuber 37oC jusqu' la prochaine session de labo. 3. Examiner le patron dhmolyse.

Lecture -Eclairage entoure les colonies : hmolyse -Pas dclairage entoure les colonies : pas dhmolyse 4. 2. 7. 3. Lantibiogramme Antibiogramme standard par la mthode des disques Lantibiogramme dfinit in vitro la sensibilit des bactries pathognes. On utilise largement la mthode des disques, qui permet de voir le diamtre dinhibition de croissance autour des disques imprgns dantibiotiques. Cette mthode standardise donne de bons rsultats en pratique. Elle peut tre complte par des mthodes plus sophistiques telles que la dtermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations minimales bactricides. On dfinit ainsi un phnotype de rsistance naturel ou acquis. (Berche, 2003). 3. 2. 7. 3. 1. Matriel par groupe Disques de celluloses imprgnes dantibiotique Les antibiotiques utiliss sont : Pnicilline (Pen) 6g, kanamycine (K) 30g, trimthoprime (Tri) 25g, gentamycine (GEN) 120g, rythromycine (Ery) 15g, vancomycine (VA) 5mcg, chloramphnicol (Cmp) 30g, ttracyclines (TE) 30g, ampicilline (AM) 10g, et bacitracine (B) 10g. Cet antibiogramme est ralis pour les deux souches 1 et 2 qui ont donn un rsultat positif. Boite de ptri + de glose Culture microbienne en suspension Rteau ou couvillons 3. 2. 7. 3. 2. Mode opratoire Prparation de linoculum : -A partir dune culture jeune de 18 24 h, prparer une suspension de 1 2 colonies dans 2 ml de MH et incuber pendant 3 5 h -Ajuster lopacit quivalente celle produite par le tube 0,5 de la gamme de Mc Farland (concentration de 106 bac/ml ou 106 CFU/ml) Dilution : On ralise une dilution au 1/100.

Ensemencement : Couler la glose dans une boite de ptri Laisser prendre en masse Prlever 2 ou 3 gouttes de la suspension bactrienne, les dposer la surface de la glose les taler avec un rteau Sassurer que la surface de la glose est bien sche (10 15 mn), et y dposer les disques de celluloses imprgnes dantibiotique correspondant laide des distributeurs ou la pince en appuyant lgrement Placer la boite de ptri basse temprature +4C pendant 15 30mn afin de permettre aux antibiotiques de diffuser dans la glose avant que les bactries ne commencent se multiplier Retirer la boites du rfrigrateur et la placer dans lincubateur, la temprature optimale de la croissance du germe tudier (37 C) pendent 24 h. 3. 2. 7. 3. 3. Lectures des rsultats Lactivit de chaque antibiotique sera apprcie, par le diamtre de laurole dinhibition provoqu autour du disque. La culture bactrienne sarrte lorsquelle rencontre une concentration gale sa CMI. La mesure du diamtre dinhibition reflte donc la valeur de la CMI de lantibiotique. 4. 2. 7. 5. Systmes didentifications microbiennes commerciales : La galerie Api 20E Cette bande test API-20E (de bioMerieux, Inc.) qui est utilise pour identifier les bacilles Gram ngatifs entriques possde 20 compartiments de test dshydrat spars. Une suspension bactrienne est utilise pour rhydrater chacun des puits. Certains des puits auront des changements de couleur rsultants des diffrences de pH. Dautres produisent des sousproduits qui doivent tre identifis avec des ractifs. Un numro de profil est dtermin daprs la srie de tests + et -, qui permet didentifier lespce. Buts de cet exercice: Apprendre comment faire et interprter la technique de multi test miniaturis pour lidentification bactrienne. Prparer une suspension de la bactrie dans une prouvette de saline 1. Inoculer une grosse colonie (diamtre de 2-3mm) de la bactrie dans une solution de 0.85% NaCl, vous assurant que la suspension est homogne sans agrgats de bactries qui flottent.

Inoculer la bande API 2. En tenant la bande un lger angle avec le dessus de la table, vous allez maintenant inoculer la suspension bactrienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur strile. 3. Toucher lextrmit de la pipette sur le ct de la cupule permettant au fluide de pntrer dans le puits par laction capillaire tout en appliquant une pression lgre sur le bulbe. Ceci devrait prvenir la formation de bulles dans les puits. Chaque puits doit tre rempli jusquau cou (voir diagramme).

Fig. 11 : Ensemencement de la galerie API 20E.

4. Remplir le tube et la section de la cupule des tubes [CIT], [VP] et [GEL]. 5. Suite linoculation, remplir compltement la section de la cupule des microtubes ADH, LDC, ODC, H2S et URE avec de lhuile minrale. Incuber la bande dans sa chambre 6. Remplir le bas de la chambre avec juste assez deau pour remplir les indentations. 7. Placer la bande dans ce rservoir du bas. 8. Placer le dessus de la chambre dincubation sur le bas et tiquete l. 9. Placer la bande 37o C. Interprtation: 1. Ajouter les ractifs appropris aux compartiments: 1 goutte de ractif de Kovac lIND (faire la lecture dans les minutes qui suivent) 1 goutte de ractif de Barritt A et B au VP (une raction positive peut prendre jusqu' 10 minutes) 1 goutte de Fe Cl3 au TDA 2. Faire la lecture de tous les autres tests, tel que dans le tableau, sans lajout de ractifs. 3. Noter les rsultats et comparer les ractions positives avec le tableau de diffrentiation. Croissance sur milieu King (King A et King B):

Principe: Les milieux King A et King B permettent la diffrenciation entre les espces de Pseudomonas par la mise en vidence de leurs pigments spcifiques. La production des pigments est favorise par la composition du milieu (Marchal et Bourdon, 1982). Technique: Ensemencer un tube de milieu King A et un tube de milieu King B en ralisant des stries mdianes la surface de la pente ; replacer les capsules des tubes sans les revisser. Incuber 30C pendant 4 jours. Lecture: King A : ce milieu favorise la production de pyocyanine, pigment permettant l'identification de Pseudomonas aerugenosa. Les cultures typiques sont colores en bleu-vert. King B: ce milieu favorise la synthse de la pyoverdine, pigment vert fluorescent produit par Pseudomonas aerugenosa et dautres Pseudomonas (Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas putida). La pyoverdine se manifeste par une coloration vert fluorescent du milieu de culture.

Composition des milieux de cultures utilises

1. Bouillon de lindole -K2HPO43,13g -L- Tryptophane...1g -NaCl.....1g -KH2PO4.......0,27g -Eau distille.200ml pH 7,2 0,2 25C 2. Bouillon De Mannitol -Peptone pancratique de casine....10g -D-Mannitol..5g -NaCl.....5g -Rouge de phnol..0.018g -Eau distill...1000ml pH = 7,2 0,2 25C 3. Bouillon de nitrate -Peptone de casine.........5g -Extrait de buf..3g -Nitrate de potassium (KNO3)....1g -Eau distill.........1000ml pH 7,2 0,2 25C 4. Bouillon de trypticase de soja -Peptone de casine (pancratique).....17g -Peptone de soja...3g -NaCl....5g -K2HPO4...2.5g -Glucose2.5g

pH = 7,3 0,2 25C 5. Bouillon nutritive -Extrait de viande3g -Peptone...5g -Extrait de levure.....2g -NaCl....1g -Eau distille1000ml pH 7,4 0,2 25C 6. Citrate de Simmons -Magnesium sulfate MgSO4.0,2g -Ammonium dihydrogne phosphate (NH4) H2PO4..1g -Phosphate dipotassium K2HPO4...1g -Citrate de Sodium ou actate de sodium ..2g -Chlorure de sodium (NaCl)5g -Agar15g -Bromothymol blue..0,08g -Eau distill......1000ml pH 6,9 0,2 25C 7. Glatine nutritive -Glatine.......................................................................................................................120g -Peptone pancratique de glatine................................................................................5g -Extrait de buf.3g -Eau distille..1000ml pH 7,2 0,2 25C 8. Glose au lait -Lait crmer..1 g dans 50 ml dH2O -Glose nutritive....5 g dans 50 ml dH2O pH 7,2 0,2 25C

9. Glose au sang -Sang du cheval.5ml -Glose nutritive...100ml pH 7,3 0,2 25C 10. Glose d'amidon -KNO3...0.5g -K2HPO4...1g -MgSO4. 7H2O.....0.2g -CaCl2...0.1g -FeCl3....traces -Amidon de pommes de terre.....10g -Agar.15g -Eau distill...1000ml pH 7,2 0,2 25C 11. Glose de Mueller Hinton Biomrieux -Infusion de viande buf ....300g -Bio-Case......17,5g -Amidon ...1.5g -Agar ....17g -Eau distill...1000ml pH 7,3 0,2 25C 12. Glose nutritive -Agar.15g -Extrait de viande3g -Peptone5g -Extrait de levure.....2g -NaCl....1g -Eau distille1000ml

pH 7,4 0,2 25C 13. Glose PDA -Infusion de pomme de terre ...100g -Dextrose .20g -Agar-agar ...15g -Eau distille ...1000ml pH 4,5 0,2 25C 14. Milieu Clark et Lubs -Peptone trypsique de viande..6g -Glucose....5g -K2HPO4...5g -Eau distille.....1000ml pH 7 0,2 25C 15. Milieu Hugh et Leifson -Extrait de levures....1g -Peptone pancratique de casine...2g -NaCl....5g -K2HPO4...0,3g -Agar.3g -Bleu de bromothymol (solution aqueuse 0,2g %)..15mL -Eau distill......1000ml pH 7,1 0,2 25C 16. Milieu de lcithine -Bouillon Trypticase-Soja...........................................................................................10ml -Jaune duf...............................................................................................................1ml -NaCl (5%)..................................................................................................................0.2ml -Agar.1.5g -Eau distill..100ml

pH 7,6 0,2 25C 17. Milieu minimum M63 -KH2PO4 ....................................................................................................................68.0g -(NH4)2SO4 ................................................................................................................10.0g -FeSO47H2O..............................................................................................................2.5mg -Solution de carbohydrate..........................................................................................10.0mL -MgSO47H2O............................................................................................................1.0mL -Eau distille........1000ml pH 7,0 0,2 25C Solution de carbohydrate: -Carbohydrate............................................................................................................20.0g -Eau distille........1000ml Solution dMgSO47H2O: -MgSO47H2O...........................................................................................................24.65g -Eau distille........1000ml 18. Ure agar -Ure.20g -Agar.15g -NaCl.....5g -KH2PO4...2g -Peptone....1g -Glucose....1g -Rouge de phnol..0,012g -Eau distill......1000ml pH 6,8 0,2 25C

Colorants et ractifs utilises

1. Coloration simple -Bleu de mthylne...2mg -Eau distill...1000ml 2. Coloration de Gram 1. Crystal violet....2,5 g/L 2. Iodine....1g Iodure de potassium (KI).2g Dissoudre l'iodine dans liodure de potassiumavant d'ajouter l'eau distille Eau distille..300 ml 3. Alcool thylique 95%.............................................................................................750 ml Actone.....250 ml 4. Fuchsine basique (solution sature dans alcool thylique 95%)...100 ml Eau distille..900 ml 3. Coloration des spores -Vert de Malachite....5g -Eau distill...100ml 4. Ractif de catalase -Eau oxygne H2O2.3% 5. Ractif de loxydase -Dimthyle-para-phnylne diamine...1% 6. Ractifs du Barritt (VP) Ractif 1: Alpha- Naphtol, 5% : -Alpha-Naphtol50g -Ethanol1000ml Ractif 2: Hydroxyde de potassium (KOH), 40% : -Hydroxyde de potassium.40g

-L'eau distill..1000ml 7. Ractif du RM -Le rouge de mthyle....0.15mg -Eau distill......1000ml 8. Ractif de Kovac -N-amyle ou isoamyle alcool...150ml -Acide hydrochlorique concentr....50ml -p-dimthylaminobenzaldhyde......10g 9. Ractif de Griess : -Ractif 1: -Acide parasulfanilique0,8 g -Acide actique....100ml -Ractif 2: - - naphtylamine ....0,5 g -(ou mieux dimthyl-a naphtylamine..0,6g -Acide actique 5 N .100ml 10. Ractif de Zoo Bell Poudre de Zinc 11. Ractif du TDA -Chlorure de fer (Fe Cl3)..10g -Eau distill..100ml