UNIVERSITE HASSAN II MOHAMMEDIA

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE

MOHAMMEDIA

compte rendu de Microbiologie

Préparer par : Encadrée par :

❖Bentouil chaimae ❖Pr. Boutaleb
❖Chefri mariem
❖Belmer ahlam
BCG S4 ;TP1B ; GRP:6
 Sommaire :
I. Introduction :

Séance 1 : la manipulation stérile

Application 1 : Stérilisation
1. Par flambage
2. Par chaleur humide
3. Par filtration
Application 2 : transvasement stérile
Application 3 : méthode d’ensemencement
1. Dans un bouillon
2. Dans une gélose en boite de pétri
3. Dans une gélose inclinée
Application 4 : les contaminants des différents biotopes :
1. Flore de l’air
2. Flore de la peau

Séance 2 : identification des bactéries

Application 1 : obtention d’une culture pure à partir d’un mélange de bactéries

Application 2 : détermination des types respiratoire
Application 3 : recherche de la catalase
Application 4 : recherche du métabolisme de la gélose
Application 5 : recherche de l’uréase
Application 6 : recherche de la lipase
Application 7 : Recherche de l’oxydase
Application 8 : L’Antibiogramme

Séance 3 : métabolisme des bactéries

Application 1 : identification macroscopique des microorganismes

Application 2 : identification microscopique après coloration de Gram
Introduction :
L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises
au point des méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces
différentes opérations nécessitent l’emploi de milieux de culture.
oLes consignes de sécurité :
-lavage des mains avant et après la manipulation;
-les blouses doivent êtres fermées ;
-Flamber, avant et après manipulations, les anses métalliques utilisées pour
les prélèvements, en commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin de
dessécher les restes de culture avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour
éviter toute projection.
-Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation

Principales caractéristiques d’un milieu de culture: Les micro-organismes doivent trouver

dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments chimiques les constituant, sous
une forme appropriée.

Un bon milieu doit :

-Etre stérile.
- Etre nutritif: doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la
croissance et l’entretien des micro-organismes.
- Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien.
-Avoir un pH convenable.
Séance 1 : la manupilation stérile
Application 1 : Stérilisation
Le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-organismes introduits
dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la contamination du milieu extérieur
et des personnes.
Il existe deux grands moyens de Stérilisation :
-La chaleur - La filtration
Matériels :
Bec bensen _- gélose nutritive en boite de pétri – anse de stérilisation
1. La chaleur:
La chaleur détruit les bactéries et les spores. On distingue
les procédés à chaleur « sèche » ou « humide »
-Par flambage ou chaleur séche :
On divise une boit de pérti en 2 , sur la moitié on
ensemence avec anse non stérile et l’aure sera donc
stérile
observation :Le coté de la boite ensemencer par l’anse
non stérile contient des colonies de différents aspects.
L’autre coté de la boite ensemencer par l’anse stérile ne
contient aucune colonie.
Conclusion: cette méthode est efficace
-La stérilisation par chaleur humide:
On ensemence avec une ose sur la moitié d’une boite de pétri
partagée en 2 à partir d’une solution bactérienne non
autoclavé , et autoclavée de la même suspension l’autre moitié
La chaleur est toujours un procédé pour tuer les endospores et
les cellules végétatives
Obsérvation:
Autoclavée: pas de colonies bactériennes
Non autoclavée: présence des colonies
conclusion:
La stérilisation par chaleur humide est une méthode aussi
efficace
1. Filtration:
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un
liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de
0,2 µm. Les micro-organismes sont trop gros et sont donc
retenus par le filtre.
Application 2 : Transvasement stérile
on fait renverser la moitié d’un bouillon nutritive dans un tube
stérile sans aucune contamination
Résultat: les deux milieux sont nettement claires sans aucun
présence de colonie bactérienne .

Application 3: méthode d’ensemencement

Dans une boite de pétri:
Dans une grande boite de pétri partagée en 4 et numéroté de 1 à 4 .
Avec une anse stérile on prend une suspension de bactérie et on fait
des stries dans (1,2) et on stérile l’anse un peu puis passant à la
partie (3) puis en tournant à la dernier partie(4) , les stries doivent
êtres de différentes direction dans toutes les parties .
Résultat: on a obtenu des colonies isolée dans les parties (3 ,4)
Dans une gélose inclinée :
on fait un ensemencement d’une façon spiralée commençant de
fond vers l’extérieure
Résultat: on a obtenu des bactéries isolée dans cette gélose
inclinée.
Application 4 : les contaminants des différents biotopes :
on a examiné des prélèvements de plusieurs milieux ( extérieurs ,
intérieurs , cheveux ,la peau , mains ..)
 Milieux extérieur Flore de la main Flore du cheveux

Résultat : On observé l’apparution des colonies après quelques jours , qui signifie que
ces milieux sont riches en microorganismes

Séance 2: UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURE

Application1: détermination de type respiratoire :

Le milieux viande foie est un milieux de culture , il est principalement utilisé en tube
profond pour la détermination du type respiratoire des microorganismes mais aussi
pour la culture des germes anaérobies
Mode opératoire :
1. régénéré le milieu 30 min à T=100°C
2. On ensemence avec une pipette par piger central jusqu’au fond du tube et
revenant tout droit ou en fourme spirale
3. On ajoute l’huile de paraffine pour empêcher l’enter de l’oxygéne
Application 2: métabolisme du glucose :
L’attaque des glucides aboutit à la formation d’acide facilement et mise en
évidence par un indicateur de ph , le changement de couleur entre ph
neutre initial et ph acide finale

Resultat: dans le 1er tube on a remarqué que la coloration devient jaune

après incubation cela indique l’utilisation de sucre
Dans le 2emme tube on a observé qu’il n’a pas changé de couleur et il reste
bleu
Application 3: recherche de catalase:
Cette méthode nous permet de identifier la bactérie gram +
 Mode opératoire: sur une lame on dispose une goutte d’eau oxygénée puis on
dispose une colonie isolée
Résultat: le dégagement gazeux indique la production d’o2 provient de la
dégradation d’H2O , alors il s’agit d’une souche catalase +

Application 4: recherche de l’urease:

Cette méthode nous permet de mise en évidence la présence de :
-l’uréase;
-Le tryptophanase
-Le tryptophane désaminase (TDA)
Mode d’emploi:
On ensemence 1 tube à hémolyse contenant l’urée avec une quantité très dense de
la bactérie étudié
Résultat:
On remarque que la coloration devient rose donc il s’agit de E.coli
Application5: recherche de la lipase
On flambe l’anse et on va mettre sur une boite de pétri qui contient E.Coli ensuite on
remplace l’anse sur une boite de pétri dont il ya de lipase
Résultat : la présence des bactéries développés signifie qu’il est lipase + il s’agit bien
de Ecoli
Les milieux nutritifs utilisée :

Gélose ordinaire

Gélose chapman
Gélose mac conckey
 Séance 3: : examen et identification microscopique ds micro
organisme après coloration
Application1: examen sans coloration
Examen à l’état frais:
Permet l’observation des microorganisme et des mettre en
évidence de la mobilité des cellules et leur mode de groupement
Mode opératoire:
1. à la surface d’une lame on pose un goute de suspension de
culture en milieu liquide
2. Mettre la lamelle sur la goute disposé de la paraffine au 4
points de lamelle 1.Flamber l’anse
Remarque: - éviter les bulbes d’aire les suspensions ne doit pas
déborder sur les côtés
-Pour observer la mobilité , on utilise l’objectif 40 2. Déposer
-On doit prendre garde à ne pas détruire les flagelles une goutte
Résultat on observe les bactéries sous fromes de cocci qui bougent de la
Examen après coloration : suspension
Se fait par 3 étapes: bactérienne
1. Réalisation des frottis
2. Coloration de gram
3. Observation au microscope
3. Recouvrir d'une lamelle
Permet de mettre en évidence la forme ou la présence de certains
organites comme noyau ,spores et flagelles ..
 Réalisation du frottis:C’est un étalement par monocouche
des bactéries sur la lame
-on étalent avec l’anse d’un mouvement circulaire de
façon a obtenir un étalement mince
-on le laisse sécher a proximité du Bee Bunsen
-enfin on effectue la coloration désirée
Coloration au bleu de méthylène
Cette coloration donne des informations concernant la
morphologie
-on versent le colorant, laisser coller(2min) on le lave par
l’eau, le sécher et on l’examine par microscope (×100)
RESULTAT
Cette coloration donne des bactéries colorées en bleu
sombre permet seulement l’étude des bactéries

RemarqueC’est nécessaire de la compléter par une coloration de

gram
Coloration de gram
C’est la base de l’identification ou d’une souche bactérienne elle
se fait en plusieurs étapes permet d’apprécier la bactérie Gram+
des bactéries Gram-
-on versent successivement en avant ou en arrière du frottis:-
violet de gentiane -lugol-décoloration(Alcool) -coloration a la
fushene
Résultat
Bactéries Gram- (E.C) Rose
Bactéries Gram+(S) Violet
Description on de la morphologie bactérienne après coloration
Selon la forme on distingue:
✓les cocci Gram+
✓Peuvent être isolée ou regroupés
✓Diplocoque
✓En chainettes
✓En amas
✓Conclusion
✓Les colorations usuel
Application2: Examen macroscopique et identification des microorganismes
-permet d’examiner les préparations a l’œil nu on cherchant les colonies isolées pour
identifier les microorganismes
-on peut avoir deux milieux d’études: liquide ou gélose
Dans un milieu liquide
On a 2 aspects
I. Milieu trouble (intensité -dépôt ou non au fond de tube)
II. Milieu clair (le fond de tube-comparaison avec milieu non ensemence)
Dans un milieu gélose
Il faut observe les colonies isolées ou utilisant soit la lumière soit avec appareil de
lecture de colonies ensuite on fait la description des colonies
Observation
•la taille: -D<1mm ---- »petite
1<D<3mm---- »moyenne
D>3mm ------ »grande
•la forme :les 4types de colonies qu’on peut rencontre en
géneral:
Ronde irrégulière en étoile envahissante

•Le relief: bombée-plat-ombiliqué-duveteux

•La surface :
•Couleur de pigment:
Lisse avec bord régulier: colonie type S
Variable en fonction de nature de
Rugueuse bord irrégulier : type R
bactérie et de milieu de culture
Muqueux : colonie type M
Conclusion du rapport : Afin de pouvoir identifier une Bactérie on doit suivre
toute une hiérarchie bien organisée :
- Faire d’abord une lecture macroscopique.
- Faire ensuite une lecture microscopique.
- Terminer avec les différents tests biochimiques.