1 RAPPORT DU TP MICROBIOLOGIE

École Supérieure de Technologie - Salé

Département Génie Urbain
Filière ETE
1ère année

Rapport du TP de Microbiologie

Réaliser par : Binômes 2

ABDELILLAH BECHARI n°09
ABDELALI ATTOCHE n°06

Notre Professeur :
Mme E.CHERKAOUI

Année universitaire :
2017 / 2018
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Plan

 L’encemencementau milieux solides et

liquides

 Observation macroscopiques, tests

biochimiques

 Coloration de Gram
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I. L’encemencementau milieux solides et

liquides :

1. L’encemencementau milieux solides :

 DEFINITION L'ENSEMENCEMENT :

En microbiologie : l’ensemencement est l’étape de

transport entre votre milieu ou bactéries recherchées
(repiquage, bouillon, …) et votre milieu de culture.

 Définition de milieu de culture :

Un milieu de culture est un support qui permet la

culture de cellules,de bactéries, de levures
de moissures afin de permettre leur étude.

 Encemencement par inclusion :

Manipulation : On met 1ml des eaux usées dans une boite

pétrie vide stérile apres ajouter le contenant d’un tube gélosé
encore liquide dans la zone de stérilité de bec de Bunsen et on
mélange doucement .

 Encemencement a la surface :

Manipulation : On met 0.1 ml des eaux usées a l’aide d’une

micropipette à la surface d’une boite pétrie contenant la
gulosenutrétif.
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2. L’ensemencement aux milieux liquides :

-A l’état initial on à 2 tubes : un tube de Bouillon nutritif et un

tube de l’eau usée .

Manipulation : On prend a l’aide de l’anse (Nikel) 1ml de

l’eau usée et on l’a met dans tube de Bouillon nutritif, après
on stérilise l’anse et le tube avant de le refermer.

- On attend une péride (Temps d’incubation) environ 24h , et

on observe les phases de Bactéries .

3. L’Isolement à partir d’un mélange Bactérien :

Cette Manipulation se réalise dans un milieu sélectif.

 Définition du milieu séléctif :

-Un milieu sélectif est une milieu qui permet de sélectionner le

type de bactéries qui pourront pousser sur celui-ci, alors que
tous les autres micro-organismes présents sont inhibés. Un
milieu de culture est rendu sélectif pour une espèce
microbienne lorsque sont seules satisfaites les exigences
nutritives et les conditions de développement particulières à
cette espèce

Manipulation : Pour faire l’Isolement on suit les étapes

suivantes :
5 RAPPORT DU TP MICROBIOLOGIE

1. Préparer une boite de pétrie de milieu complet (dans

le tp on a eu la boite contenant le milieu DCL prête) ainsi que
le tube conteneantl’échantillon .

2. Avant de prendre notre colonie , on stérilise l’anse .

3. Diviser la boite à pétrie en secteurs égaux (2 / 4 / 7…) à

l’aide d’un marqueur (en Tp j’ai divisé la boite en 4 sécteurs
égaux)

4. Préleveler une colonie avec l’anse qu’on a déjà stérilisé et

refermer la boite à pétrie .

5. On passe l’extrémité de l’anse en zig-zag dans le premier

secteur de la périphérie vers le centre de la boite, mais avant
de faire l’anse on le fait refroidir .

6. On a stérilisé une lance et on a mis la tête de la lance quand

te tube a essaye qui contiens le B.N + eau usé (qui étaient
laisse dans un incubateur pour plus de 24h dans une
température de 37°C) et on a raillé avec la tête de la lance le
premier ¼ du Chapman.

7. On stérilise la lance et on met sa tête sur une partie du

premier ¼ et on raille avec le second ¼ , Et ainsi de suite
pour compléter toute la boite.

8. On place notre boite à pétrie à l’étuve (25-30) degré, posée à

l’envers .
6 RAPPORT DU TP MICROBIOLOGIE

II. L’observation macroscopique, tests

biochimiques :
1. Observation microscopique :

-Apres avoir ouvrit une boite pétrie qui contient le gélose nutritif
la première séance pendant 1 H et avoir incuber pendant
environ 36 heures on a observé les résultats
macroscopiquement :

Formes : Nombre /u Taille(cm) Couleur

Circulaire 40 0.4 Verte
Irregulaire 24 1.5 Jaune
filamenteux 4 0.5 Jaune

 Résultat de l’isolement :
Il ya pas l’apparition de Colonies dans le Milieu DCL
7 RAPPORT DU TP MICROBIOLOGIE

Hypothése : Peut-être j’ai brulé la colonie dès de début .

 Résultat de milieu : Bouillon nutritif

Le milieu est devenu trouble , donc il y a la présence de
bactéries aerobie strict et anaerobie facultative .

 Résultat de gélose nutritive :

Apres le temps d’incubtion (environ 36 heures) j’au observé :

Formes : Nombre Taille(cm) Couleur

Points + 0.1 Jaune
Circulaire + 0.3 Jaune
Filamenteux + 4 Jaune
Irreguliaire + 1 Jaune

2)Tests biochimiques :
a. L’encemencement au milieu de citrate de simons :
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Ce milieu permetde mettre en évidence l’utilisation du citrate

comme seule source de carbonne et d’énergie , et ce
caractère est essentiel pour identifier les bactéries .
 Si le milieu reste vert : Le milieu de présente aucune
culture . La bactérie n’utilise pas la citrate comme source
de carbone (Citrate -)

 Si le milieu devient Bleu :(Virage de l’indicateur coloré) , la

bactérie utilise la citrate comme seule source de carbone
et (citrate+)

Manipulation :
1. Faire une srie centrale avec une suspension en eau
physiologique sur la pente .

2. Incuber 24h-37h avec le bouchon légérement dévissé.

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b. L’encemencement au milieu de ClarckLubs :

-On étudie dans le milieu deux réactions : la réaction de

rouge de méthyle et la réaction de VP.

Donc on va diviser le Clark Lubs entre 2 tubes parce que on a 2

réactions . Pour savoir si la bactérie produit le Pandole et le
Butanodiol .

c. L’encemencement au milieu de Klygler :

Le milieu Klygler est un milieu qui permet la recherches

de plusieurs caractères biochimiques .
Manipulation :

:
Il permet de :
 Précipité noir de sulfure ferrique :Production d’H2S par les
Bactéries
 Pas de précipité noir :Ilny a pas de production d’H2S par
les Bactéries
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 Présence de bulbes dans le gélose : Les bactéries

produisent de Gaz pendant leurs fermentation : (Gaz +)

d. L’encemencement sur l’eau peptonnée :

-L'eau peptonée est unmilieu de culture, il est utilisé pour
la recherche d’Indole .
-Manipulation : Mettre un anse de culture dans un tube
d’eau peptonnée. Apres Incubation on ajoute le Kovaks s’il ya
l’apparition d’anneau rouge , les bactéries produit de ‘indole
sinon les bactéries ne produissent pas l’indole .

III. Observation et Coloration de Gram :

Observation :
-L’eau péptonnée : -Apres avoir ajouter kovacs on regarde
l’apparition de l’anneau rouge donc la bactéries produit l’Indole .
-ClarckLubs : -Dans le premier tube on regarde une coloration
rouge donc (Positif).
-Dans le deuxieme tube apres de 30 min on
regarde la coloration rouge (Positif)
-Klygler : -On regarde que la couleur du milieu a changer du
rouge au noir donc on a la production de H2S par les Bactéries
et on a pas un dégagement de Gaz .
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-Citrates de Simons :On a un changement de couleur de milieu

du vert au bleu donc on constate que la bactérie utilise la citrate
comme seule source de carbone.

Coloration de Gram :
Pour classifier les Bactéries selon la Paroi il faut faire la
coloration de Gram, pour faire la derniere il faut suivre les
étapes suivantes :

 Réaliser un frottis et le fixer à la flamme.

 Verser le violet de Gentiane sur la lame ; laisser le
contact 1 minute
 Verser le Pandole pendant 1 minute
 Laver la lame avec une pissete
 Ajouter pour la deuxième fois de Pandole et le laver
avec la pissete
 Ajouter de l’alchool et laisser le contatct pendant 20
secondes
 Verser du Fichine, et laisser le contact pendant 35
secondes et laver la lame a l’aide d’une pissette.
 Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen.
 A l'aide de microscope on peut déterminer le couleur
des bactérie leur forme ainsi que leur taille

Résultat :
-Des bactéries colorées en rose ou rouge
pâle ; elles ont perdu le violet, ‘le Gram elles sont
dites ‘gram négatif’. Pas d’espèce