L3 Microbiologie

Module microbiologie de l’environnement

TP n°2: Analyse microbiologique du

sol
Isolement des actinomycètes
 Les actinomycètes (Actinobacteria) sont un groupe d'eubactéries
Gram-positives.

 La plupart d'entre elles se trouvent dans le sol, y jouant un rôle

important dans la décomposition des matières organiques.

 C'est le regroupement des bactéries sous forme d'« arbre » qui utilise
ses cystes (fruits), ici des endospores, afin de résister à un milieu
nutritif défavorable (par exemple, présence de myxomycètes dans le
milieu).

 Le groupe des actinomycètes et Nocardia a souvent été présenté

comme à cheval entre bactéries et champignons. Il se rapproche en fait
des champignons essentiellement par l'existence de filaments ramifiés,
ressemblance morphologique assez superficielle.
 La phylogénie moléculaire a montré sans appel l'appartenance du
groupe aux Eubactéries ; cette phylogénie est soutenue
morphologiquement par la finesse de ces filaments (maximum 1
micron, les filaments mycéliens allant de 2 à 5 microns) et par le
fait que, en culture surtout, ces filaments se fragmentent au point
de ressembler beaucoup à des bacilles (aspect similaire à celui des
corynaebactéries). Par ailleurs, la composition de leur paroi et
corrélativement leur sensibilité aux antibiotiques les rapprochent
des eubactéries.

 La majorité des espèces sont saprophytes ou commensales ;

quelques-unes peuvent être pathogènes chez des individus à
résistance affaiblie.
Echantillonnage du sol rhizosphérique
 Des plantes sont prélevées du sol et leur racines sont
secouées doucement pour éliminer le sol de la zone racinaire.
 Les échantillons sont collectés dans des flacons en verre
stériles et étiquetés.
 Les échantillons de sol sont séchés à l’air à température
ambiante pendant 7 jours et conservés à température
ambiante jusqu’à utilisation.
Prétraitement du sol rhizosphèrique
Il existe plusieurs méthodes de prétraitements:
 Prétraitement du sol avec 1,5% du phénol
 Prétraitement du sol avec le CaCO3
 Prétraitement du sol par la chaleur: 2g du sol de chaque
échantillon sont chauffé à 50°C pendant une heure
Isolement
 Six milieux d’isolement sélectives peuvent être utiliser:
 La gélose acide humique vitamine
 Le milieu amidon-caseine à pH 7
 Le milieu gélose à l’extrait de levure et de l’extrait de malt
 Le milieu Bennett…
 Ces milieux sont additionnés d’antifongiques et d’antibiotiques
(anti-bactéries à Gram-).
 Les boites sont incubées à 28°C pendant 4 semaines. Les boites
de Pétri sont alors observés après 2, 3 et 4 semaines d’incubation

 A l’aide d’un microscope photonique, les colonies des

actinomycètes sont repérées d’après leur aspect microscopique
caractéristique
Identification préliminaire
 Les colonies suspectes d’être des actinomycètes sont ensuite
purifier par repiquage en strie

 L’étude macroscopique et microscopique permet de révéler

plusieurs morphotypes d’actinomycètes

 Par les aspect culturaux; les colonies d’actinomycètes sont

en générale des colonies ronde parfois bombées présentant
souvent des traits circulaires concentriques difficile à prélever
présentant différentes couleur avec une odeur caractéristique (la
géosmine)
Principaux genres

 Arthrobacter
 Corynebacterium
 Frankia
 Micrococcus
 Micromonospora
 Mycobacterium
 Nocardia
 Propionibacterium
 Streptomyces
 Actinomycètes isolés du sol

Actinomycètes isolés de plantes

Micromonospora sp
 Par microscope optique:
Sans coloration: afin de mettre en évidence l’aspect
filamenteux caractéristiques des actinomycètes. Toutes des les
colonies isolées sont observées sous microscope
En générale, toute colonie présentant des filaments courts
autour d’elle est retenue (GrX10)
Coloration de GRAM
Préparation des frottis + coloration au violet de gentiane +
rinçage au lugol + lavage avec mélange éthanol et acétone +
lavage à l’eau de robinet + coloration à la fuschine de Ziehl
+ rinçage à l’eau + sécher et examiner sous microscope
optique à l’aide de l’objectif (X100)
Morphologie
 On ne trouve l‘Actinomyces que dans les grains. Ceux-ci,
écrasés entre lame et lamelle, se révèlent constitués d'un
feutrage de fins filaments ramifiés se terminant en périphérie
par des renflements en massue.
 Au Gram, les filaments sont Gram positifs, les massues Gram
négatives.
 Dans les préparations faites à partir des cultures, on trouve
des fragments de filaments de longueurs très variables,
beaucoup de formes bacillaires et on recherche les formes
bifurquées.
Morphologie de Streptomyces sp.
colonie (a) and mycélium (b)
Structure en chaîne des spores de Streptomyces rochei
(a) Phase contrast microscope x100
(b) Phase contrast microscope x400
  Mycelium aérien et chaîne de spores de Streptomyces
toxytricini observés au Microscope éléctronique(×10,000)
Purification et conservation
 Des colonies individuelles sont ensemencées sur milieu
gélosé ISP-2, exempt d’antifongique et d’antibactérien, puis
incubation à 28°C.

 Les colonies ainsi purifiées sont conservées d’une part dans

des tubes contenant le milieu Hickey-Tresner ou GLM
incliné ou sur les même milieux d’isolement et d’autre part
conservée dans 20% du glycérol à -20°C (V/V)
 QUESTION?
Quels sont les antifongiques et les antibiotiques les
plus utilisés pour l’isolement des Actinomycètes?