Fiche technique : la coproculture

 Définition :
Est l’examen bactériologique des selles, le but de Prélèvement : Selles
Cet examen est de rechercher les bactéries Milieu de culture :

Pathogènes et de détecter les parasitoses Milieu SS / hektoen / campylo/Karmali/

CIN
Intestinales possibles. Germes : salmonelle ; shigelle ;
campylobacter ; yersinia ;
vibrio.cholerae .
 Démarche :
1- Prélèvement :
Les premières selles dans un récipient propre, en cas de constipation, on fait
un écouvillonnage rectal surtout chez les nourrissons.
2- Transport :
- ¿ 2H, si le laboratoire est loin : (12h- 24h) mettre les prélèvement à +4°C( si
on met à T° normal = PH ou = mort de bactéries.

3- Examen macroscopique :
- Préparer une suspension de selles : prendre une noisette à l’aide d’une anse
de platine dans 10ml d’eau physiologique stérile + agitation, l’écouvillon est
plongé dans le tube à eau physiologique.
- Il faut bien observer l’aspect des selles :
- Selles dysentérique : La diarrhée invasive : de cause bactérienne et
rarement parasitaire se caractérise par une diarrhée liquide sanglante,
accompagnée de douleurs abdominales, les germes responsables
pénètrent dans la paroi intestinal(Shigella, Salmonella, Campylobacter,
Yersinia, Escherichia coli entéro- invasifs (EIEC).

- Selles cholériforme : la diarrhée sécrétoire : eau de riz=liquide

de cause virale(rotavirus), bactérienne(vibrio cholera, Staphylococcus
E.coli entérotoxinogène (ETEC); parasitaire(Cryptosporidium)

4-Examen microscopique :

-Etat frais :
*Mobilité = vibrio très mobile +campylobactère (bâ tonnets très mobiles
dépassant le champ.
* Hématies
 *Appréciation de flore = 4/5 bacilles + 1/5 cocci (ceci est l’équilibre
normal).
*Levures : nombre ∓ + confusion avec les GR et GB.

-coloration :

a) bleu de méthylène : recherche des leucocytes

Présence de leucocytes = germe invasif (présence d’une inflammation)
Absence de leucocytes = germe entérotoxique (absence d’une
inflammation).

b)GRAM :
-Flore normale = 60-70% BGN / 30-40% BGP
-Apprécier toujours s’il ya un déséquilibre de la flore.

5- Mise en culture :
On peut orienter la mise en culture selon les différentes contestes
épidémio-cliniques :
Contexte Orientation étiologique
Adulte + enfant ¿ 2ans : context par Salmonella, Shigella, Campylobacte.
défaut ssp, Yersinia
Enfant ¿ 2ans EPEC(E.coli entéropathogène) +
bactéries précédentes
Notion de voyage récent on zone ETEC , V.Cholerae , Aeromonas.sp
tropicale et syndrome cholériforme
Malade sous Antibiothérapie Clostridium difficile+++
TIAC (des toxi-infection alimentaire *Incubation courte:
collective) S.aureus + B.cereus
*Incubation longue :
Salmonella.sp+ Yersinia enterotica+
Clostridium .perfringens

 La mise en culture des selles nécessite l’utilisation des milieux d’isolement

sélectifs+ des milieux d’enrichissement favorisant la poussée des germes
pathogène peu abondants.

Recherche de salmonelle / shiguelle :

 ⇨1er jour :
Suspension des selles

Isolement

Incubation 24h/ 35°C Sur Hektoen

Colonies verdâ tre avec ou sans

centre noir

Lac-/ Sach- / H2S +/-

⇨ 2ème jour :
⇩ Repiquage de colonies Lac(-) / H2S(+/-) sur milieu
urée-indol

Incuber 3H à 35°C

H2S+ H2S-

Urée (+) Urée (-) Urée (+) Urée (-)

Klebseilla LDC Proteus LDC

TSI TSI
TDA TDA

⇨ 3ème jour :
1/ Urée(-)+ TDA(-) + LDC(+) + Gaz(+) + H2S(+)
⇨Salmonella.paraB / Salmonella.mineure
2/ Urée(-)+ TDA(-) + LDC(+) + Gaz(+) + H2S(-)
⇨ Salmonelle. para A
3/ Urée(-)+ TDA(-) + LDC(+) + Gaz(-) + H2S(-/+)
⇨Salmonelle.Typhi
4/ Urée(-)+ TDA(-) + LDC(-) + Gaz(+) + H2S(-)
⇨ Shigella

Remarque: une coproculture positive de Salmonella para A, para B ou typhi d’être

obligatoirement confirmée par une hémoculture.

RECHERCHE DE CAMPYLOBACTER
Les Campylobacter doivent être recherchés systématiquement en cas de diarrhée, au
même titre que les Salmonella.
Ces bactéries sont sensibles au dioxygène, les selles sont conservées à +4°C ou
acheminées rapidement au laboratoire.

⇨1er jour :

Suspension des selles

Isolement sur

Incubation en atmosphère microaérobie à 35°C/24h

Milieu Campylosel : Milieu Karmali :

Colonies grises à reflet Colonies grises, humides,
métallique, plates plates et qui ont tendance à
s’étaler.

⇨ 2ème / 3ème jour :

a/Repérage des colonies suspectes :

Les Campylobacter donnent de petites colonies luisantes (1 à 2 mm de diamètre),

non hémolytiques, grisâ tres ou
translucides selon les espèces, rondes,
lisses, bombées ou plates, ayant tendance
à l’envahissement.
 Culture de Campylobacter – 48h à 37°C en
microaérobie sur milieu Campylosel

b/Réaliser un Gram, un état frais, un test oxydase :

Les Campylobacter sont caractérisés par leur morphologie en « vol de mouette »,

leur mobilité grâ ce à une ciliature polaire et un test oxydase +.

c/Identification des Campylobacter sp :

L’utilisation d’une galerie API Campy (bioMérieux) :

Profil sur API Campy d’une souche de Campylobacter jejuni

d/ Antibiogramme :
-Préparer une suspension bactérienne à 0,5 McF, à l’aide d’une oese stérile .
Ensemencer par écouvillonnage sur gélose MH au sang de cheval défibriné et
additionnée de β-NAD (MH-F) .

-Déposer sur la boîte les disques d’antibiotiques (Ampicilline (10µg),

Amoxicilline/Ac. clavulanique (20/10µg), Ciprofloxacine (5µg), Tétracycline
(30µg), Erythromycine (15µg), Gentamicine (10µg), et incuber 24 heures en
atmosphère microaérobie à 35°C.

Lecture :
Recherche de Yersinia
Les Yersinia ont la particularité de se développer plus lentement que les autres
entérobactéries et d’avoir une température optimale de croissance inférieure
(28°C au lieu de 37°C).

Dans un produit poly-microbien comme les selles et dans les conditions de

culture classiques (24h à 37°C), ces bactéries sont le plus souvent masquées par
la flore digestive.

L’utilisation systématique d’un milieu sélectif incubé à 28°C a permis d’améliorer

leur repérage.

⇨1er jour :

Suspension des selles

Ensemencement sur le
milieu sélectif
Incubation 24h à 28°C
Yersinia CIN
(Température optimale de croissance

des Yersinia).

⇨ 2ème jour :

Après 24 h d’incubation, les colonies de Yersinia apparaissent petites (1 mm de

diamètre) translucides à centre rouge ou entièrement rouges (mannitol +). La
taille des colonies est supérieure après 48 h d’incubation.

Remarque : malgré la sélectivité élevée de ce milieu, certaines souches, par

exemple de Citrobacter et d’Enterobacter, peuvent cultiver sur ce milieu
cependant elles forment après 24h d’incubation des colonies rouges plus grosses
(2 à 3 mm) que celles des Yersinia (1 mm).
 Y. enterocolitica sur CIN après Y. enterocolitica sur CIN après
24H à 28°C 48H à 28°C

La réalisation d’unn test uréase rapide est discutable.

S’il est positif, il conforte une orientation vers l’espèce Yersinia enterocolitica

Mais s’il est négatif, il ne permet pas d’exclure pour autant cette espèce.

L’identification des colonies suspectes peut être réalisée sur API 20 E. La galerie
est ensemencée directement avec les colonies suspectes ; incubation à 37°C.

3ème jour :
Si une souche de Yersinia enterocolitica est identifiée, il faut faire un biotypage, un
sérotypage et un lysotypage.
Le biotypage permet de déterminer si la souche appartient à un biotype
pathogène, en effet les biotypes 1B, 2, 3, 4 et 5 sont entéropathogènes alors que
les souches du biotype 1A sont considérées comme non pathogènes.
Le sérotypage des souches, est complémentaire car il existe une forte corrélation
entre biotypes pathogènes et sérotypes : le biotype 4 est toujours associé au
sérotype O:3, le biotype 2 aux sérotypes O:9, O:5,27 et le biotype 3 aux sérotypes
O:5,27 et O:3.
La détermination du biotype des souches de Yersinia pseudotuberculosis n’est pas
utile car toutes les souches de cette espèce sont entéropathogènes.

Recherche des Vibrio cholera

On recherche Vibrio cholerae chez les malades présentant une diarrhée au retour d’un voyage en.

Les selles des patients atteints de choléra sont fécaloïdes pendant les premières heures
de la maladie puis liquides et dans les cas extrêmes aqueuses avec des grains
riziformes.

V. cholerae étant sensible à la dessiccation et au froid, il faut placer le prélèvement

dans un milieu de transport ou dans un tube plastique avec quelques gouttes de sérum
physiologique et est toujours conservé à température ambiante (ne jamais réfrigérer ou
congeler).

⇨1er jour :
Suspension des selles

Isolement sur milieu

TCBS (Thiosulfate-Citrate-
Incubation 24H à 37°C
Bile-Saccharose)

Remarque :

 Chez les sujets porteurs sains ou présentant une forme atténuée de choléra, les Vibrio
cholerae sont présents en petite quantité dans les selles.
  Il est dès lors nécessaire d’enrichir les selles en V. cholerae.
 L’enrichissement s’obtient en ensemençant une eau peptonée salée alcaline (pH=9).

 Effectuer une succession de cultures en eau peptonée alcaline (EPA)

ou hypersalée alcaline (EPSA) pour sélectionner le vibrion cholérique. Dès qu'un
tube est trouble, repiquer dans un nouveau tube d'EPA et isolée sur une gélose
nutritive alcaline (GNA) et de type TCBS. Prélever sous la surface de l'eau
peptonée, sans remuer le tube.

 La forte concentration en NaCl (30 g/L) et le pH alcalin de ce milieu donne un avantage

sélectif à la plupart des espèces de vibrions halophiles ou halotolérants en favorisant
leur croissance par rapport à d’autres micro-organismes présents habituellement dans
lesselles.
L’incubation de l’eau peptonée alcaline ne doit pas dépasser 6 heures, car au-delà la
multiplication des bactéries associées aux Vibrio diminuerait l’efficacité de
l’enrichissement.

⇨ 2ème jour :
Les colonies suspectes isolées sur TCBS (arrondies, bombées
et jaunes, car saccharose +).
 Croissance de culture bactérienne (Vibrio chholera) sur gélose TCBS

Il est important de déterminer rapidement si les colonies suspectes sont celles de l’agent du choléra
(donc d’une souche de V. cholerae ) afin d’alerter immédiatement les autorités sanitaires.

Identification :

Ensemencement d’une galerie API20E, on prépare l’inoculum en eau physiologique.

La galerie API 20E comprend davantage de caractères utiles à l’identification des Vibrio, elle est
préférable à la galerie API20NE. Comme certains Vibrio sont halophiles.

Galerie API20E pour Vibrio Cholera

3ème jour :
Antibiogramme : Ensemencement par écouvillonnage sur milieu Muller Hinton .

L'antibiogramme devra inclure les antibiotiques suivants : amoxicilline, tétracycline,

sulfamides, co-trimoxazole.