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LA MICROBIOLOGIE
Gnralits: Rappel
LA MICROBIOLOGIE
LES DIFFERENTS MICROORGANISMES
LES MICROORGANISMES
EXEMPLES DE PATHOLOGIE :
Bactries :
Infections urinaires, Diarrhes Tuberculose, Diphtrie, Ttanos Mycoses, Teignes Sida, Hpatite C, Rubole Toxoplasmose, Paludisme, Tnia (ver solitaire)
LES MICROORGANISMES
Les Champignons :
Champignons filamenteux (dermatophytes, moisissures) Ex : Penicillium, Aspergillus Levures Ex : Levure de bire, levure de boulanger Ex : Candida, Cryptococcus Taille : 10 m
LES MICROORGANISMES
Les Virus :
Taille < 0.1 m ADN ou ARN Pas denzymes : besoin dune cellule hte Reproduction par replication
Les Bactries :
Taille : 1 m ADN et ARN Enzymes : biosynthses Reproduction par scissiparit
ETUDE DE LA BACTERIE
SON HABITAT
Dans lenvironnement :
Chez lhomme :
Saprophyte
SON HABITAT
DANS NOTRE ENVIRONNEMENT :
SON HABITAT
CHEZ LHOMME EN BONNE SANT
OUI Bouche Oreilles Voies respiratoires Intestins Voies gnitales Peau ....
NON
SA PATHOGENICITE
LHOMME MALADE :
Multiplication et dissmination dans lorganisme Rsistance au systme immunitaire Scrtion denzymes : lsions des tissus Parfois secrtions de toxines
SA PATHOGENICITE
Les bactries toxigniques
La bactrie ne quitte pas le lieu de l'infection et la toxine seule provoque la maladie en diffusant dans l'organisme Ex : - Clostridium tetani (ttanos) - Corynebacterium diphteriae (diphtrie)
Intoxinations alimentaires :
- Staphylococcus aureus - Clostridium botulinum
Botulisme : ingestion d'aliments dans lesquels C. botulinum a labor sa toxine (non dtruite dans le tube digestif) paralysies par atteinte neuro-musculaire
SA PATHOGENICITE
La bactrie pathogne par opportunisme :
Quelle bactrie ? Une bactrie saprophyte ou de la flore normale dont la prsence ne provoque habituellement pas de maladie Quand ? Lors dune dficience immunitaire de l'hte Lors dune rupture de la barrire naturelle
Ex : E. coli , prsent dans la flore normale et occasionnellement mis en cause dans des infections urinaires, des septicmies...
SA PATHOGENICITE : EXEMPLES
FLORE NORMALE BACTERIES PATHOGENES
CAVITE ORO-PHARINGEE : ORO Streptocoque
TUBE DIGESTIF :
Salmonella, Shigella E. coli, Yersinia, Campylobacter Vibrio cholerae Toxine : Clostridium, S. aureus
SA PATHOGENICITE : EXEMPLES
FLORE NORMALE
PEAU :
BACTERIES PATHOGENES
CAVITE GENITALE :
SA FORME
COQUES
BACILLE
COCCO-BACILLE
diplocoque
amas
chainettes
BACILLES
diplobacille
coccobacille
SA STRUCTURE
membrane cytoplasmique capsule (facultatif)
paroi
ribosomes
cytoplasme
flagelle (facultatif)
pili ou adhsine
ADN
SA MOBILITE
1- Pas de flagelle : Bactrie immobile 2- Un flagelle : Bactrie mobile Dplacement : 3- Plusieurs flagelles : Bactrie mobile Dplacement :
SON ALIMENTATION
Besoins lmentaires
Pour synthtiser les lments constitutifs de la bactrie C, N, O, H, sels minraux, ...
Besoins en sucre
Pour les dpenses nergtiques de la bactrie glucose , lactose
SA RESPIRATION
Besoin doxygne
Bactrie arobie
Besoin de moins doxygne Bactrie microarophile Absence doxygne Besoin de CO2 Bactrie anarobie Bactrie capnophile
SA MULTIPLICATION
Division toutes les 20 mn
SA MULTIPLICATION
La vitesse de multiplication dpend de la temprature : Vitesse
SON ROLE
COMMENT ?
Isoler la bactrie responsable de l'infection Identifier cette bactrie Tester sa rsistance envers diffrents antibiotiques
LE PRELEVEMENT
LE PRELEVEMENT
PRELEVEMENT Urine MODE DE PRELEVEMENT PATHOLOGIES Infections urinaires
Selles
Infections intestinales, Intoxications alimentaires Ecouvillon Vaginite, cervicite, prostatite, urthrite, MST... Abcs, Liquide pritonal , plaie superficielle
Prlvement gnital
Suppuration
Ecouvillon ou seringue
LE PRELEVEMENT
PRELEVEMENT Prlvement de gorge Expectorations MODE DE PRELEVEMENT Ecouvillon PATHOLOGIES Infections ORL, angines.. Infections pulmonaires, pneumonies ... Septicmie
Sang
LCR
Ponction lombaire
Mningite
LE PRELEVEMENT
digestifs vaginaux, urtraux des voies respiratoires ... On observe plusieurs bactries
LE PRELEVEMENT
Conditions de prlvement
Matriel de prlvement strile. Dsinfecter autour de la zone de prlvement avant de prlever
LE TRANSPORT DU PRELEVEMENT
Ensemencer immdiatement le prlvement ou Utiliser un milieu de transport
POURQUOI ?
Ce sont des organimes vivants ! il faut : 1- les garder vivants 2- viter leur multiplication
QUAND ? labo loign du site de prlvement :
LE TRANSPORT DU PRELEVEMENT
Si le prlvement doit attendre avant inoculation sur milieu de culture, Conditions de conservation :
4C Urine, selles
37 37C et/ou Milieu de transport
?
Pas de multiplication bactrienne souhaite Possibilit de germes fragiles Possibilit de germes anarobies
LEXAMEN MICROSCOPIQUE
Poste de Tri des chantillons - vrifier la concordance: nom / chantillon - vrifier la quantit et la qualit - rtention ou rejet de lchantillon - si rejet: rdaction de la fiche de non conformit - remise dun exemplaire au demandeur avant son dpart
Phase analytique:
Traitement des chantillons
- ranger les chantillons dans lordre croissant - ralisation des frottis - fixer les frottis - colorer les frottis - procder la lecture des lames - rendre les rsultats
Phase post-analytique postStockage des chantillons et conservation des lames - stockage jusquau rendu des rsultats - conservation * +4C ou temprature ambiante +4 * 80C (biopsies) 80 * les frottis positif * 1/10 frottis ngatif
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :
Premire tape
INTERET :
Prsence et abondance des bactries Morphologie et mode de groupement Mobilit Cytologie : observation des cellules ex : Leucocytes (tmoins de linfection)
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :
2 - LE GRAM
Coloration la plus utilise en bactriologie Permet de faire une classification des bactries
Gram + Gram -
Violet Rose
LEXAMEN MICROSCOPIQUE :
Coloration de Gram : Principe
Repose sur la diffrence de permabilit de la paroi bactrienne
4 - La fuchsine ou la safranine
Coloration des bactries Gram (-) en rose
L EXAMEN MICROSCOPIQUE :
3 - Autres Colorations
Coloration au bleu de mthylne pour visualiser les bactries intra-leucocytaires ex : gonocoques Coloration de Giemsa pour les parasites sanguins et intra-cellulaires Coloration de Ziehl - Neelsen pour les Mycobactries Acridine orange Fluorescence pour les prlvements faible concentration bactrienne
LA CULTURE
LA CULTURE
Pour obtenir une croissance bactrienne, il faut : Rpondre aux exigences de la bactrie :
LA CULTURE
?
Milieu de base ?
Milieu chromogne ?
Milieu riche ?
Milieu slectif ?
LA CULTURE
Les diffrents types de milieux de culture milieu enrichi : milieu de base + sang, facteurs de
croissance...
Les milieux peuvent tre la fois slectifs et enrichis, ou slectifs et chromognes ...
LA CULTURE : Exemples
Urine :
CPS ID 2 Glose sang
Selles :
Selenite Hektoen BCP Yersinia CIN Campylosel
Prlvement gnital :
Chocolat
Sang ANC
Candida ID
Mac Conkey
LA CULTURE
LA CULTURE
LA CULTURE
1 - Bactries arobies strictes
Ne peuvent vivre qu'en prsence d'oxygne tirent leur nergie en utilisant l'oxygne de l'air : C'est la respiration (mtabolisme oxydatif) ex : Pseudomonas, Mycobactries
2 - Aro-anarobies facultatives AroSe dveloppent avec ou sans air, mais la majorit de l'nergie produite provient de la fermentation ex : Entrobactries
LA CULTURE
3 - Anarobies strictes
Ne se dveloppent qu'en l'absence d'air. L'oxygne leur est toxique. La totalit de l'nergie est produite par fermentation (mtabolisme fermentatif). ex : Fusobacterium, Eubacterium
4 - Microarophiles
Prfrent une pression partielle d'O2 infrieure celle de l'air. ex : Campylobacter, Mycoplasmes
5 - Bactries capnophiles
Certains germes prfrent une atmosphre enrichie en CO2,elle est indispensable d'autres. ex : Neisseria gonorrhoeae
LA CULTURE
Choisir la bonne atmosphre :
Bactrie arobie Bactrie aro-anarobie Bactrie -arophile Bactrie anarobie Bactrie capnophile
Pas de gnrateur Jarre
Gnrateur microaer
LA CULTURE
Croissance en milieu solide :
Sur boite de Ptri Une bactrie dpose la surface d'une glose nutritive, se multiplie et forme 1 amas visible l'oeil nu : la colonie = 1 million de bactries = 20 gnrations
POUR LISOLEMENT
LA CULTURE
LA CULTURE
Courbe de croissance
bactrienne
Quantit de bactries
3 2
LA CULTURE
1 - Phase de latence Mtabolisme rduit : adaptation de la population bactrienne aux nouvelles conditions de culture. 2 - Phase de croissance exponentielle Multiplication bactrienne trs active. 3 - Phase de ralentissement et phase stationnaire Epuisement des lments nutritifs, accumulation de produits toxiques dans le milieu. 4 - Phase de dclin Mortalit par autolyse des bactries
LIDENTIFICATION
L IDENTIFICATION BACTERIENNE La condition : Obtenir une culture pure (si prlvement polymicrobien)
1 bactrie
1 colonie
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
L'isolement
1 2
3 4
3 4
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Les bactries sont classes par : Famille Genre Espce exemple : Micrococcaceae Staphylococcus aureus exemple : Enterobacteriaceae Escherichia coli
S. aureus
E. coli
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Lexamen microscopique : Coques ou bacilles Mode de groupement Gram + ou Gram Observation des colonies sur botes de Ptri :
Taille, couleur, aspect, odeur (!) Prsence d'une hmolyse sur milieu au sang (Streptocoques... )
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
LHEMOLYSE
Hmolyse E : hmolyse partielle (halo verdtre sous la colonie) Ex : Pneumocoque Hmolyse F : hmolyse totale (halo clair sous la colonie) Ex : Streptocoque groupe A, B ... Hmolyse H : pas d'hmolyse Ex : Enterococcus faecalis, faecium
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Tests d'orientation :
recherche des enzymes "respiratoires"
2 H2O2
catalase
Oxydase :
TMPD
incolore oxydase
TMPD oxyd
rose carmin
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Les rsultats des tests d'orientation : - Morphologie : Gram Catalase, oxydase permettent de dfinir la famille ou le genre, et donc de choisir les tests ou galeries d'identification Exemples : Cocci, Gram +, Catalase + Staphylocoques Cocci, Gram +, Catalase Streptocoques Bacilles, Gram -, Oxydase Entrobactries
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Etude des caractres biochimiques :
Etude du mtabolisme de la bactrie (enzymes...) Exemple :
Glucose Enzyme Glucose ferment Production dacide pH
TEST (+)
Pas denzyme
TEST (-)
4 - IDENTIFICATION BACTERIENNE
LES TESTS BIOCHIMIQUES
Mtabolisme glucidique :
oxydation ou fermentation dun sucre : glucose , lactose, saccharose, arabinose...
Mtabolisme protique
Protines : glatine, lait, sang ... protases, urase, dsaminases, dcarboxylases
Mtabolisme lipidique
lipase, lcithinase ...
Galeries d'identification
26 27 28 29 30 21 22 23 24 25 16 17 18 19 20 11 12 13 14 15 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5
ex :
ID 32,
cartes
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
- partir de colonies isoles - ou directement partir des prlvements. Avantage : rapidit ( raction immdiate)
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Identification sur milieux chromognes : Permet didentifier la bactrie la couleur de sa colonie sur la boite
Pour
les prlvements frquents Et pour les bactries les plus frquemment rencontres Ex : CPS ID 2 Urine (E.coli, Proteus, Strepto. D) Intrt : gain de temps et dargent
L IDENTIFICATION BACTERIENNE
Identification par biologie molculaire :
Permet didentifier la bactrie par un fragment spcifique de son ADN
A partir des colonies Ou directement partir du prlvement
Ex : Gen Probe
L ANTIBIOGRAMME
L ANTIBIOGRAMME
Gurir rapidement
BUT :
Trouver un traitement efficace pour le malade
L ANTIBIOGRAMME
Etudier in vitro l'activit des antibiotiques sur la bactrie isole
A raliser uniquement sur l'agent pathogne (pas sur la flore normale)
Interprter l'activit de l'antibiotique in vivo : Risques potentiels de succs ou d'chec pour le traitement
L ANTIBIOGRAMME
LES ANTIBIOTIQUES
agents antibactriens
L ANTIBIOGRAMME
LES ANTIBIOTIQUES Origine :
- biologique : labors par des micro-organismes : champignons, bactries - chimique : produits par synthse
L ANTIBIOGRAMME
S R I
LANTIBIOGRAMME
LES RESULTATS
Bactrie sensible : S
La bactrie ne pousse pas en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un succs
Bactrie rsistante : R
La bactrie pousse en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un chec
Bactrie intermdiaire : I
Rsultat intermdiare
L ANTIBIOGRAMME
Rsistance bactrienne
Naturelle :
Rsistance toujours retrouve chez une mme bactrie : Cest un comportement normal et connu
Ex : Proteus mirabilis rsistant la Ttracycline
Acquise :
Rsistance nouvelle acquise par mutation gntique : Cest un comportement anormal Cette rsistance peut apparatre puis disparatre
A cause des rsistances acquises (donc surprises), il faut faire un antibiogramme pour chaque bactrie identifie
L ANTIBIOGRAMME
Etude de la CMI :
CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE Plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la souche tudie. Mthode de dilution en milieu liquide
Ex : CMI = 1g/ml
0,5
L ANTIBIOGRAMME
LES DIFFERENTES TECHNIQUES
L ANTIBIOGRAMME
inoculation de toute la surface de la glose avec la suspension bactrienne. les disques sont placs sur la surface de la bote. les antibiotiques vont alors diffuser dans la glose.
Aprs 20 heures d'incubation, une zone d'inhibition apparat autour du disque. La taille de la zone est proportionnelle la valeur de la CMI.
L ANTIBIOGRAMME
B
Mesure du diamtre
Ce diamtre
correspond la CMI report en S, R, I en fonction des diamtres officiels donns par les comits dexperts
Ce diamtre est
F E D
L ANTIBIOGRAMME
L ANTIBIOGRAMME
Galeries ATB :
On teste chaque antibiotique (A,B,C,D...) 2 concentrations diffrentes (c et C)
= Pas de croissance bactrienne = Croissance bactrienne
c 0 A B C D
C
Tmoin de croissance
S R I S
L ANTIBIOGRAMME
Les concentrations critiques
Pour chaque antibiotique, les diffrents comits de l'antibiogramme fixent un intervalle critique permettant de savoir si l'antibiotique sera efficace in vivo (aux doses thrapeutiques) C : concentration critique suprieure c : concentration critique infrieure Concentrations dtermines en fonction de la pharmacocintique : - fixation sur les protines,
- pntration dans certains sites, - absorption, mtabolisme et excrtion.
L ANTIBIOGRAMME
Souche sensible : CMI < c
L'antibiotique test est actif sur la souche bactrienne.
L ANTIBIOGRAMME
Mthodes automatises :
Etude de la croissance bactrienne dans un milieu liquide ou semi-liquide en prsence d'une ou plusieurs concentrations d'antibiotiques - ATB Expression - mini API
26 27 28 29 30
21 22 23 24 25
16 17 18 19 20
11 12 13 14 15
6 7 8 9 10
1 2
- VITEK
3 4 5
EN RESUME
1- PRELEVEMENT
2 - EXAMEN MICROSCOPIQUE Etat frais Gram 3 - CULTURE 4 - TESTS D'ORIENTATION Catalase Oxydase 5 - IDENTIFICATION Manuelle : Galerie API Semi-automate : ATB Expression - mini API Semi Automate complet : VITEK 6 - ANTIBIOGRAMME Diffusion en milieu glos (disques) Milieu semi-glos (galeries ATB) semi Milieu liquide (cartes VITEK)