Microbiologie alimentaire 2023-2024 Dr Masmi.

Analyse microbiologique des aliments

I. Introduction
Les produits alimentaires sont pour la plupart non stériles et susceptibles d’être un support de
croissance des microorganismes. Certains de ces microorganismes contaminants peuvent altérer la
qualité ou la sécurité des produits alimentaires.

II. Origine des microorganismes dans les aliments

 Environnement : eau, sol et l’air.

 L’aliment lui-même exp : microorganismes présents naturellement dans la peau et le tube
digestif des animaux.
 Aliments transformés : conditions de transformation dans l’usine (environnement ;
personnel ; surfaces, matériels), conditions de stockage, de transport et de la
commercialisation des produits.

III. Principaux facteurs de contrôle de la prolifération des microorganismes

Facteurs Le pH - Facteur très important.
intrinsèques - À un pH faible, le développement des levures et des
moisissures est favorisé.
- A un pH neutre ou alcalin, ce sont les bactéries qui
prédominent.
L’activité de l’eau Plus l’eau est disponible en grande quantité, plus il sera facile de
(AW) coloniser un aliment
Le potentiel Les microorganismes sont classés en fonction de leurs exigences
d’oxydoréduction en oxygène en :
- Aérobies stricts → se développent qu’en présence d’O2.
- Aérobies facultatifs →peuvent se développer en présence
ou en absence d’O2.
- Anaérobies stricts → se développent en absence d’O2.
La structure - La pelure des fruits et des légumes agit comme une barrière.
physique - Le broyage ou le hachage des aliments augmente la surface de
la nourriture des germes.
Présence de Inhibent la croissance de certains micro-organismes exp :
substances l’allicine dans l’ail, l’eugénol dans le clou de girofle.
inhibitrices
Facteurs L’humidité Offre aux microorganismes un environnement favorable à
extrinsèques relative du milieu leur croissance.
La température - Facteurs le plus important. On distingue :
 Psychrotrophes et les psychrophiles (0°C à 20°C).
 Mésophiles (20°C à 45°C).
 Thermophiles (45°C à 65°C).
La présence de gaz Un excès de CO2 permet d’abaisser le pH ce qui limite la
croissance des agents microbiens.

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IV. Les principaux groupes microbiens d’importance alimentaire

Il existe quatre catégories de microorganismes importants dans les aliments :
 Microorganismes utiles : sont ajoutés à un produit lors de sa fabrication (exp : yaourt,
fromage...) pour apporter des propriétés organoleptiques (ex : arômes, acidité, texture)

 Microorganismes d’altération : germes qui dégradent les propriétés organoleptiques de

l'aliment (aspect, texture, consistance, flaveur) et diminuent la durée de sa conservation.

 Microorganismes indicateurs d’hygiène : indiquent le degré de la contamination des

aliments.

 Micro-organismes pathogènes : capables de provoquer une maladie chez le consommateur.

V. Contrôle microbiologique des aliments

V.1. Objectifs
La qualité hygiénique et technologique des aliments font l’objet du contrôle microbiologique afin de
garantir, au consommateur, des produits alimentaires sains et stables.
 Qualité hygiénique : Le contrôle microbiologique vise à éviter la présence de
microorganismes pathogènes dans le produit alimentaire.

 Qualité technologique (marchande) : Le contrôle microbiologique vise à détecter la

présence de microorganismes d’altérations.

V.2. Techniques de prélèvements :

 Conditions : - Respecter des règles d’aseptise et de représentativité.
- 500 g de produits est nécessaire ; soit cinq fois 100g.
- Ces 100g peuvent être fournis par une ou plusieurs pièces.

 Traitements des échantillons :

1. Cas des produits solides :

- Solution mère : 25 grammes du produit à analyser sont introduite aseptiquement dans un
bocal stérile préalablement taré contenant au préalable 225 ml de diluant soit le TSE (Tryptone
Sel Eau). Cette suspension est broyée et homogénéisée. Elle constitue la dilution mère (DM)
qui correspond donc à la dilution 1/10 ou 10-1.
- Dilutions décimales : 1ml de la DM sont introduites aseptiquement, dans un tube à vis stérile
contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution sera alors au 1/100 ou 10-2… etc.

25 gr dans 225 ml TSE 1ml de DM 1ml de 10-2 1ml de 10-3

+ 9ml de TSE + 9ml de TSE + 9ml de TSE

DM= 1/10 ou 10-1 D= 1/100 ou 10-2 D= 1/1000 ou 10-3 D= 1/10000 ou 10-4

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2. Cas des produits liquides :

- Solution mère : le mélange de trois à cinq sachets constituera la solution mère (SM).
- Dilutions décimales : 1 ml de la SM introduite aseptiquement dans un tube à vis stérile
contenant au préalable 9 ml du TSE (Tryptone sel eau) : cette dilution est alors au 1/10 ou 10-
1
. 1ml de la dilution 10-1 sont introduit dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml
du même diluant : cette dilution est alors au 1/100 ou 10-2 ….etc.

1ml de SM 1ml de 10-1 1ml de 10-2

+ 9ml de TSE + 9ml de TSE + 9ml de TSE

Dilution 1/10 ou 10-1 Dilution 1/100 ou 10-2 Dilution 1/1000 ou 10-3

V.3. Recherche microbiologique

Deux grands types de germes sont recherchés dans les aliments :

1. Germes indicateurs de contamination ou d’hygiène.
2. Germes pathogènes.

V.3.1. Recherche des germes indicateurs d’hygiène

A. Recherche et dénombrement des germes aérobie mésophiles totaux

(G.A.M.T) :

 Intérêt : indiquent sur le degré de la contamination globale des aliments.

 Technique de recherche : dénombrement en milieu solide.

Introduire 1 ml de chaque dilution décimales dans une boite de Pétri

vide
Ajouter 20 ml de la gélose PCA (Plate Count Agar)
Faire des mouvements circulaires et en forme de « 8 » pour
permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose.

Laisser solidifier, Puis ajouter 5 ml de la même gélose.

Incubation couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures

Boite positive : Colonies sous forme 3/8

lenticulaire en masse.
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B. Recherche et dénombrement des coliformes Totaux (CT) et Fécaux (CF) :

 Intérêt : indicateurs de contamination fécale et de mauvaises conditions hygiéniques.

 Technique de recherche : La recherche se fait en milieu liquide par la technique du nombre

le plus probable (NPP).
 La recherche présomptive des coliformes totaux (CT).
 La recherche confirmative des coliformes fécaux ou thermo-tolérants (CF).

 Milieu de culture utilisé : bouillon lactosé et bilié au vert brillant (BLBVB) munie d’une
cloche de DURHAM.

Test de Solution mère (SM) Dilutions décimales (10-1,10-2…)

présomption 10ml
1ml
1ml

D[] S[] S[]

Incubation 24h à 37°C

Tubes positifs :
- Trouble microbien.
- Virage du milieu au jaune
(fermentation du lactose)
- Dégagement gazeux.

Repiquage des tubes +

BLBVB avec cloche Eau peptonée (EPT)

+ Réactif de Kovacs
Test de confirmation
(Test de Mac KENZIE)

Incubation à 44°C pendant 48h

Gaz (+)
indole (+)

Présence d’E.
coli.
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C. Recherche et Dénombrement des Streptocoques Fécaux

 Intérêt : Témoins de contamination fécale.

 Techniques de recherche : dénombrement. La recherche se fait en milieu liquide par la

technique du nombre le plus probable (NPP). Elle se fait en deux étapes :

 Test présomptif : réalisée sur milieu ROTHE, ce milieu contient de l’azide de

sodium (NaN3) qui inhibe la plupart des microorganismes.
 Test confirmatif : réalisée sur milieu LITSKY, ce milieu est le milieu de Rothe
additionné de 0,5 mg d’éthyl violet par litre.

Test de Solution mère (SM) Dilutions décimales (10-1,10-2…)

présomption 10ml
1ml
1ml

D[] S[] S[]

Incubation à 37°C pendant 24h à 48h

Tubes positifs : Trouble microbien.

Test de confirmation On ensemence quelques gouttes du milieu ROTHE (+) dans

(Test de Mac KENZIE) le milieu LITSKY et on incube à 37°C pendant 24 à 48h.

Tubes positifs :
- Trouble microbien.
- Apparition d’une pastille violette au
fond du tube.

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D. Recherche et dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs :

 Intérêt : indicateurs de contamination fécale et tellurique.
 Technique de recherche : La recherche se fait sur milieu viande-foie sulfité (additionnée de
sulfite et de sel de fer).

Solution mère (SM) Dilutions décimales (10-1,10-2…)

1ml
5ml

Porter à 80°C au BM pendant l0min

(destruction des formes végétatives).
Laisser refroidir

Sel de fer Sulfite de fer

Gélose Viande foie

Incubation à 37°C et lecture après 16, 24,48 et 72h.

Tubes positifs : Colonies de grandes

tailles noires.

E. Recherche et dénombrement des Levures et moisissures

 Intérêt : indicateurs de contamination et des conditions de stockage.
 Technique de recherche : L’isolement des champignons est réalisé par l’emploi de milieux
sélectifs. Le plus utilisé est le milieu peptone glucose de Sabouraud (le développement des
bactéries est inhibé dans ce milieu par l’adjonction de chloramphénicol 0,5 mg/ml).

1ml 1ml
1ml

Répartir sur toute la surface et incuber les boites retournées pendant 5 jours à 20-25°C.

Après 48h d’incubation, repérer chaque jours les colonies sur les boites.

- Les champignons se présentent sous forme de grandes bulles veloutées.

- Les levures sont ovoïdes et de taille de quelques microns.

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V.3.2. Recherche des germes pathogènes

A. Recherche et dénombrement de Salmonella spp

 Technique de recherche : La recherche comporte quatre étapes

25g d’aliments + 225ml EPT

Pré-enrichissement

Broyer cette suspension → Incuber à 37°C pendant 16 à 20h.

Ensemencement 10ml
0.1ml
Enrichissement

Rappaport Sélénite -
Vassiliadis Cysteïné

Incuber à 37°C pendant 24h Incuber à 37°C pendant 24h.

XLD: xylose lysine

Isolement désoxycholate
Ensemencement

Gélose Gélose Gélose Gélose

Hektoen XLD Hektoen XLD

Incubation à 37°C pendant 24 h.

Lecture

Colonies à centre noir entourée d'un halo rouge sur XLD.

Colonies bleu verdâtres à centre noir sur gélose Hektoen.

Confirmation par l’identification morphologique, biochimique et antigénique.

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B. Recherche et dénombrement des Staphylocoques

 Technique de recherche :

1ml (SM)

15 ml de gélose Ensemencement
Baird-Parker
additionné de jaune
d'œuf et de tellurite
de potassium
Incuber 24 à 48 heures à 37°C.

Boite positive : colonies noires, brillantes, convexes, entourées d'une zone claire.

Confirmation se fait par le test de coagulase sur plasma de lapin.

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