Institut Supérieur Des Professions Infirmières et des techniques de santé

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------

Option : LABORATOIRE

Réalisé par : Mme LAHLOU Iman

Année universitaire : 2019-2020

I. Introduction
Du fait de sa composition physico-chimique, le lait est un excellent substrat pour la croissance
microbienne. De ce fait on trouve que le lait comporte une flore originelle et une flore de
contamination.

Le lait contient peu de microorganismes lorsqu'il est prélevé dans de bonnes conditions, à
partir d'un animal sain (moins de 103germes /ml). Il s'agit essentiellement des germes
saprophytes de pis et des canaux galactophores : microcoques, streptocoques lactiques,
lactobacilles. Des germes pathogènes et dangereux du point de vue sanitaire peuvent être
présents, soit lorsque le lait est issu d'un animal malade (Streptocoque pyogène, des
staphylocoques,…) ou d’une contamination par des germes d'infection générale Salmonella,
Brucella, et exceptionnellement listeria monocytogene, mycobactérie, Bacillus anthracis et
quelque virus.

II. Sources de contaminations :

-Le Sol: Streptocoque, bactéries sporulés, spores de
champignons,…
-Fèces et téguments de l’animale: Coliformes, Bacillus,
Clostridium, Salmonella,…
-Litières et aliments: lactobacillus, flore banale,…
-Air et eau: Flores divers, bactéries sporulés
-Equipements de traite et de stockage du lait: flore
lactique, lactobacillus, pseudomonas, levures,…

-Manipulation: Staphylocoque, contamination fécale,…

III. Prélèvement :

L’échantillon prélevé, qu’il soit dans son emballage d’origine ou prélevé dans un flacon ou
une canette stérile, doit être immédiatement plongé dans la glace pilée ou tout autre moyen de
réfrigération, et maintenu jusqu’au moment de l’analyse, qui doit être effectuée dans les délais
les plus rapides (se conformer à la date limite d’utilisation éventuellement).

Retirer l’échantillon de ses emballages isothermes et agiter pendant au moins 10 secondes

Quelque soit le type de conditionnement, ouvrir aseptiquement, flamber au aseptiser à l’alcool

(cas des emballages en plastique)
II. Préparations des échantillons:

1. Prise d’essai :

Les laits étant des produits liquides constitueront d’emblée donc une solution mère.
Les produits laitiers (laits secs en poudre, yaourt, fromages, desserts lactés et autres étant des
produits solides, feront l’objet de dilutions décimales, mais au préalable il est nécessaire de
procéder à leur homogénéisation à l’aide de techniques et d’appareils appropries (Broyeurs
homogénéisateurs, Stomatcher..).
Les prises d’essai sont effectuées sur l’échantillon homogénéise en tenant compte de deux
facteurs essentiels à savoir :
- le nombre de pièces soumises a l’analyse d’une part,
- les opérations analytiques à conduire ...
Mais, en général, on prélève trois fois 25 ml ou 25 gr :
- les premiers serviront à l’analyse bactériologique courante,
- les seconds serviront à la recherche de Salmonella – Shigella,
- les troisièmes serviront à la recherche des Listeria.

2. Cas des produits liquides :

Dans le cas des produits liquides, le mélange de trois à cinq sachets de lait par exemple
constituera la solution mère (SM = 1).

Dilutions décimales :

· Introduire ensuite aseptiquement a l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1 ml de la

SM, dans un tube stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution est alors
au 1/10 ou 10-1.
· Introduire par la suite 1ml de la dilution 10-1 dans un tube stérile contenant au préalable 9ml
du même diluant : cette dilution est alors au 1/100 ou 10-2.
· Introduire ensuite aseptiquement a l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1 ml de la
dilution 10-2 dans un tube stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant ; cette dilution
est alors au 1/1000 ou 10-3.

3. Cas des produits solides.

Dans le cas des produits solides, introduire aseptiquement 25 grammes de produit à analyser
dans un bocal stérile préalablement taré ou dans un sachet stérile de type ‹‹Stomatcher››
contenant au préalable 225 ml de diluant soit le TSE (Tryptone Sel Eau). Homogénéiser.
Cette suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond donc à la dilution 1/10
ou 10-1.

Effectuer des dilutions décimales :

Ces dilutions serviront à la recherche des germes suivants :

· Germes aérobies mésophiles totaux
· Coliformes totaux et fécaux
· Staphylococcus aureus
· Levures et Moisissures.

Remarques:
1. Au moment de la réalisation des dilutions décimales, il est impératif de changer de pipettes
entre chaque dilution.
2. Contrairement à cela, lors de l’ensemencement il est recommandé de commencer par la
plus forte dilution à savoir 10-3 dans le but justement de ne pas changer de pipettes. On
travaillera alors à l’aide d’une pipette graduée en verre stérile de 5 ml.

III. Méthodes d’analyse Bactériologique :

1- Recherche et dénombrement en milieu solide par incorporation, ou par

ensemencement à la surface
2- Dénombrement en milieu liquide par NPP

3- Contrôle enzymatique du chauffage :

 a. Epreuve de la phosphatase alcaline:

Tout lait correctement pasteurisé ne doit plus posséder d'activité phosphatasique.

La détermination de cette activité constitue donc un moyen de contrôle de la pasteurisation.

En effet, la destruction de la flore pathogène du lait se fait habituellement par pasteurisation,

c'est-à-dire par chauffage à 72 °C, pendant quelques secondes. A cette température
l'inactivation de la phosphatase est totale.

Une mesure de l'activité de la phosphatase alcaline du lait peut se pratiquer de la manière

suivante :

Dans un tube à essai, on introduit : 5 ml de solution tamponnée de substrat : le nitro-4-

phénylphosphate disodique ou PNPP à 0,15%

On place le tube au bain thermostaté à 37 °C, pendant 2-5 minutes, puis on ajoute 1 ml de lait
à tester ;

On agite et, après incubation de 30 minutes à 37 °C, Faire une lecture à 30min puis à 2 heures.

Lecture :
 b. Epreuve de la peroxydase :

Les peroxydases sont des enzymes du lait détruites par l’action d’une température supérieure
à 75°C (ou quelques secondes à 80°C).

Mettre dans un tube propre et sec :

2 ml de lait à examiner
2 ml de solution saturée de gaïacol
1 goutte d’eau oxygénée
- Agiter et garder le tube dans la main (20-30°C)
- Observer après 1 minute
Lecture :

I V. Analyse bactériologique du lait pasteurisé :

1-Définition :

Le lait pasteurisé est un lait dans lesquels la plupart des micro-organismes,

pathogènes ou non pathogènes, ont été tués. Les lipases (responsables de la lipolyse) sont
inactivées mais les protéases, responsables de la protéolyse, restent actives. D'où une
conservation limitée

2- Préparation de l’échantillon :

Retirer l’échantillon de ses emballages isothermes et agiter pendant au moins 10 secondes.

Quelques soit le type de conditionnement, ouvrir aseptiquement, flamber au aseptiser à
l’alcool (cas de l’emballage en plastiques).

Micro-organismes Milieu de culture - Incubation Quantité-dilution

Coliformes Totaux Milieu désoxycholate à 37°C pdt 1ml, 10-1
24H (Incorporation)
Coliformes Fécaux Milieu désoxycholate à 44°C pdt 1ml, 10-1
24H (Incorporation)
Germes aérobies mésophiles Milieu PCA à 37°C pdt 24 à 48H 1ml, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4
(Incorporation)
Staphylocoque aureus Baird Parker à 37°C pdt 24 à 48H 0,1ml
(Ensemensement par pipette rateau)
-Giolitti et Cantonni 15ml en tube 1ml
Salmonella Bouillon de selenite de sodium 2fois 25ml
concentré
Milieu SS ou Hektoen Une oese
 V. Analyse bactériologique du Yaourt :
1-Définition :

Le yaourt, est un lait fermenté par le développement des seules bactéries lactiques
thermophiles Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus qui doivent être
ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le produit fini

2-Préparation d’une suspension au 1/3 :

A l’aide d’une cuillère aseptisée à l’alcool et flambée, on prélève 45g de yaourt et les
introduire dans une fiole stérile taré de 200 à 250 ml + verser 90g de phosphate dipotassique
K2HPO4 (pH= 7,4 à 7,6) préchauffée à 45°C.

→ Homogénéiser

→ Réaliser des dilutions décimales de cette suspension au 1/3 en solution tryptone-sel

Micro-organismes Milieu de culture - Incubation Quantité-dilution

Coliformes Totaux Milieu désoxycholate à 37°C pdt 1ml, 0,1ml en double
24H (Incorporation)
Coliformes Fécaux Milieu désoxycholate à 44°C pdt 1ml, 0,1ml en double
24H (Incorporation)
Staphylocoque aureus Baird Parker à 37°C pdt 24 à 48H 1ml, 0,1ml en double
(Ensemensement par pipette rateau)
Salmonella Bouillon de selenite de sodium 2fois 25g dans 25ml
concentré
Milieu SS ou Hektoen Une oese
Levures – Moisissures OGA 5jours à 20 -25°C 1ml, 10-2

V. Analyse bactériologique du Fromage :

1-Définition :

Le fromage est un aliment obtenu à partir de lait coagulé ou de produits laitiers, comme la
crème, puis d'un égouttage suivi ou non de fermentation et éventuellement d'affinage
(fromages affinés). Le fromage est fabriqué à partir de lait de vache principalement, mais
aussi de brebis, de chèvre, de bufflonne ou d'autres mammifères. Le lait est acidifié,
généralement à l'aide d'une culture bactérienne. Une enzyme, la présure (coagulant), ou un
substitut comme de l'acide acétique ou du vinaigre, est ensuite adjointe afin de provoquer la
coagulation.
2- Préparation de l’échantillon :
Opérer sur la totalité du fromage, c'est-à-dire sans enlever la croûte à l’aide d’un couteau
aseptisé à l’alcool et flambé, prélevé à partir de deux secteurs opposés, les introduire dans un
bol d’un mixeur stérile.
Verser aseptiquement 50g de solution stérile à 2% de phosphate dipotassique pH 7,4

Préchauffée à 45°C.
Mixer pendant 30 secondes à 1 minute. Réaliser des dilutions en tryptone sel.

Micro-organismes Milieu de culture - Incubation Quantité-dilution

Coliformes Totaux Milieu désoxycholate à 37°C pdt 1ml ⁄ 10-1, 10-2, 10-3
24H à 48H (Incorporation)
Coliformes Fécaux Milieu désoxycholate à 44°C pdt 1ml ⁄ 10-1, 10-2, 10-3
24H à 48H (Incorporation)
Staphylocoque aureus Baird Parker à 37°C pdt 24 à 48H 0,1ml ou 0,2ml
(Ensemensement par pipette rateau)
Salmonella Bouillon de selenite de sodium 2fois 25g
concentré
Milieu SS ou Hektoen Une oese
Listéria monocytogène Bouillon d’enrichissement sélectif
(EB)
Gélose sélective Mac-Bride Modifié -----------
(MMA)
Gélose au sang
Gélose à l’esculine

V. Analyse bactériologique du Beurre :

1- définition:

Le beurre est produit laitier de type émulsion d’eau dans la matière grasse obtenue par
procédés physiques, et dont les constituants sont d’origine laitière

2-Prise d’essai :

Prélever 25g dans un godet de centrifugation stérile et taré.

Ajouter 25ml de trypton sel stérile, placer le godet dans un bain d’eau à 45°C jusqu'à fusion
de la matière grasse.

Centrifuger 2 minutes à 2000 tours/minute, et on sépare la phase grasse de celle aqueuse,

l’analyse portera sur la phase aqueuse.
Le produit de la phase aqueuse obtenue (25ml) contient les microorganismes présents dans
25g du produit initial.
 1ml de la phase aqueuse : 1g de produit → Effectuer des dilutions décimales en trypton sel.

Micro-organismes Milieu de culture - Incubation Quantité-dilution

Germes mésophiles
Bactéries Coliformes
Germes indologènes
Levures-moisissures
Germes caséolytiques*
Germes lipolytiques*
PCA 72H à 37°C 1ml,10-2 à 10-5 en double
VBBL 48H à 37°C 1ml au 1⁄6, 10-1, 10-2 en
triple
Ou DL 24H à 37°C 1ml au 1⁄6 et 10-1
Eau peptonée exempte d’indole Repiquage des
coliformes lactose+ en
eau peptonée
Milieu OGA ou gélose au malt 1ml, 10-2, 10-3 en double
5 jours à 20-25°C
Gélose caseine 24H à 48H 10-1, 10-2, 10-3
Gélose à la tributynine oxoid 1ml au 1⁄6
Milieu spirit bleu agar BBL

-Germes caséolytique : microorganismes capables de sécréter des protéases exocellulaires pouvant

hydrolyser la caséine du lait et des produits laitiers, (exemple: Pseudomonas, Bacillus)

-Germes lipolytiques: microorganismes possédant des enzymes qui hydrolysent la matière grasse
(exemple: Pseudomonas, Serratia, Micrococcus).

VI. Interprétation des résultats:

1-Recherche et dénombrement des coliformes:

Se fait sur milieu DL, dénombrer les colonies rouges à l’intérieur de la gélose et exprimer les
résultats par UFC/g ou UFC/ml.

2-Recherche et dénombrement des germes mésophiles:

Se fait sur milieu PCA, dénombrer les colonies blanchâtres à l’intérieur de la gélose
Exprimer les résultats par UFC/g ou UFC/ml.

3-Recherche et dénombrement du Staphylocoque aureus:

Se fait soit sur le milieu Baird Parker ou Chapman

Dénombrer les colonies noires, brillantes, convexes, de 1 à 2 mm de diamètre, entourées d'un
halo clair.
Exprimer les résultats par UFC/g ou UFC/ml.

4-Recherche des salmonelles:

Signaler la présence ou l’absence des Salmonelles dans l’échantillon.

5-Les Normes: (voir Tableau Annexe)

 DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES AEROBIS

(MESOPHILES)

1ml de la solution mère et des dilutions

Boites de pétri stériles

+ 15 ml de gélose pour dénombrement (PCA)

fondue et ramenée à 47°C

Mélanger l’inoculum au milieu et laisser solidifier

Couvrir d’une 2ème couche de gélose blanche ou PCA

(Couche protectrice)

Incuber les boites à 30°C pendant 72H

Dénombrer les boites contenant entre 30 et 300 colonies (colonies blanchâtres)

Et exprimer les résultats par gramme ou millilitre de l’échantillon
 DENOMBREMENT DES COLIFORMES
(METHODE D’INCORPORATION EN MILIEU SOLIDE)

1ml de la solution mère et des dilutions

Boites de pétri stériles

+ 15 ml de gélose au désoxycholate-lactose
fondue et ramenée à 47°C

Mélanger l’inoculum au milieu et laisser solidifier

Recouvrir d’une 2ème couche de gélose DL

(Couche protectrice)
Laisser Solidifier

Incuber à 37°C ====> Coliformes totaux

Incuber à 44°C ====> Coliformes Fécaux

Dénombrer les colonies rouges foncées

Expression des résultats par gramme ou millilitre de l’échantillon
 DENOMBREMENT DES STAPHYLOCOQUES
PATHOGENES (STAPHYLOCOCCUS AUREUS)

0,1ml de la solution mère et des dilutions

Etaler sur la surface du milieu Baird-Parker

Ou le milieu Chapman-Mannité (avec une pipette en rateau)

Incuber les boites à 37°C pendant 24 à 48H

- Dénombrer les colonies caractéristiques (Colonies noir avec halo clair

sur BP) ou (Colonies jaunes entourés d’un halo jaune sur Chapman)
- Repiquer 5 colonies sur le Bouillon BHI (bouillon cervelle-cœur)

Incuber à 37°C pendant 24H

Test de coagulase (0,5ml de culture de BHI + 0,5ml du plasma de lapin)

Lecture après 1H, 2H, 3H, …24H

Test (+) Test (-)

Caillot ferme Pas de formation de Caillot

Staphylocoque aureus
 DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES

25g de l’échantillon + 225ml de dilution

Homogéinisation

Ensemencer 0,1ml de la suspension sur milieu gélosé spécifique

(Sabouraud, Potato)(OGA)

Incuber à 37°C le milieu (Sabouraud, Potato) 24 à 72H

Incuber à 25°C le milieu (OGA) 24 à 72H

Dénombrer les colonies développées

 RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES
STREPTOCOQUES FECAUX

Dans les laits et produits laitiers, les Streptocoques du groupe D ou Streptocoques fécaux sont
recherchés et dénombrés en milieu liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable).
La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :
-Le test de présomption : réservé à la recherche des Streptocoques sur milieu de Rothe,
-Le test de confirmation : réservé à la confirmation proprement dite sur milieu EVA Lytski,
des tubes trouvés positifs au niveau des tests de présomption.

Solution mère

Milieu Rothe

Milieu Lytski
 RECHERCHE DE SALMONELLE

25g de produit + 225ml d’eau peptonée tamponée

Incubation à 37°C pendant 18 à 24H

Enrichissement Sélectif

0,1ml de culture 2ml de culture

+ 10ml de bouillon + 20ml de bouillon au

Rappaport vassiliadis Sélénite -cystine

Incubation à 24°C pendant 18 à 24H Incubation à 37°C pendant 18 à 24H

Isolement sur le milieu Hektoen Isolement sur le milieu SS

Incubation à 37°C pendant 18 à 24H Incubation à 37°C pendant 18 à 24H

Colonies grisâtres souvent à centre noir Colonies incolores ou à centre noir

Repiquage sur Kligler

Galerie biochimique Confirmation sérologique

 RECHERCHEDE
RECHERCHE DELISTERIA
LISTERIAMONCYTOGENES
MONCYTOGENES
(Fromage)
(Fromage)

Listeria = Petits BGP, Mobilile à 22°C, AAF, Catalase +, Oxydase –, Nitrate –, Glucose +, H2S –, Gaz-,

Esculine +, Indole –, Urée –, TDA–, VP +, RM + et β hémolytique

0,1 ml/10ml bouillon

Fraser

Relecture Palcam

Repiquer TSAYE (colonies bleues)