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ANALYSE

BACTERIOLOGIQUE
D’UNE DENREE
ALIMENTAIRE
La prise d’essai:
A - cas de produit solide(exemple: viande).
B -cas de produit liquide(exemple: jus).
Références
• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
• Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspension
mère et dilutions décimales;1.règle générale.
• Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire -
Directives générales pour la préparation des
dilutions en vue de l’examen microbiologique.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales
pour le comptage des colonies et l’expression des
résultats.
• Norme NF ISO 7218 :règles générales pour les
examens microbiologiques.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
A- Cas de produit solide.
La 1ère pesée servira au
Peser dans un sachet contrôle bactériologique.
stérile 3× 25 gr du produit La seconde servira à la
à analyser aseptiquement. recherche des Salmonella et
des shigella.

25 gr
La troisième servira à la
recherche de Listéria.

BALANCE
La prise d’essai pour une analyse
bactériologique classique:
Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
à analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR TSE
DE TYPE 225
ml
STOMACHER
(suspension mère)
10ˉ¹
La prise d’essai pour la recherche
des Salmonella et des Listéria.
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillon
Fraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit
à analyser.
Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.
Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR
225 225
DE TYPE ml ml
Eau Peptonée Bouillon
STOMACHER tamponnée Fraser
B – Cas de produit liquide:
Faire un mélanger de 3 à 5 unités
du produit à analyser.

JUS
JUS
JUS
JUS
JUS

+1
Suspension mère
La prise d’essai pour les recherches
des Salmonella et des Listéria.
Prélever
25 ml 25 ml
2×25 ml de la 5
ml

Suspension
mère.

+1 FRASER
Eau
peptonnée

tamponnée

Listéria Salmonella
PREPARATION
DES DILUTIONS
DECIMALES
a - cas de produit solide.
b - cas de produit liquide.
a - Cas de produit solide:
Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.
1 ml 1 ml
1 ml

10ˉ² 9 ml de TSE 10ˉ³

10ˉ¹
Suspension
mère
b - Cas de produit liquide:
Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE.
Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans
9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et
l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.

1 ml 1 ml 1 ml

1 ml 9 ml de TSE 9 ml de TSE
10ˉ³
10ˉ¹ 10ˉ²

+1
suspension
Solution
mère mère
PARAMETRES RECHERCHES
• Recherche et dénombrement des microorganismes totaux
(Flore mésophile).
• Recherche et dénombrement des levures et moisissures.
• Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes
thermo tolérants et EscherichiaColi.
• Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito –
Réducteurs à 46°C.
• Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à
37°C.
• Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus.
• Recherche des salmonelles.
• Recherche de Listéria.
RECHERCHE ET
DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR
COMPTAGE DES COLONIES
OBTENUES A 30 °C,
DANS LES DENREES
ALIMENTAIRES.
Milieu utilisé:
Gélose PCA
Références
• Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro–
organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à
30°C.
• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des résultats.
• Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directives
générales pour les examens microbiologiques.
• Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives
générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examens
microbiologiques.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
Inoculer les boites de pétri avec 1 ml
des différentes dilutions.

1 1 1
ml ml ml

1 ml 1 ml 1 ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler la gélose PCA ≈ 15 ml
refroidie ≈ 45°C.
Mélanger et laisser solidifier.

PCA PCA

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler une deuxième
couche de gélose blanche ≈ 4 ml.
Laisser solidifier.
GELOSE GELOSE
BLANCHE BLANCHE

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Incuber les boites couvercle en bas
72 ±3h à 30°C.

Incuber 72h à 30°C


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

1ère Lecture après 24h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

2ème Lecture après 48h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


RECHERCHE ET DENOMREMENT DES
MICROORGANISMES PAR COMPTAGE
DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,
DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

3ème Lecture après 72h


d’incubation
Dénombrer les colonies de formes lenticulaires
qui poussent en masse et noter les dilutions
correspondantes.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux


Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus
fortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300.
Appliquer cette formule:
∑c
N 1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre de
1 ère 2 1
colonies de la 1 dilution et c = nombre
2
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boite
retenue.

N = nombre de
micro-organismes /gr ou ml
RECHERCHE DES
COLIFORMES PAR
COMPTAGE
DES COLONIES A 30°,35°
OU 37° C DANS LES
DENREES
ALIMENTAIRES.
Références
• Norme NF V 08-051:dénombrement des coliformes
par comptage des colonies,méthode de routine.
• Norme NF V 08-017:dénombrement des coliformes
fécaux et d’Eschérichia Coli(annexe NF V 08-015 et
NF V08-016).
• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les
examens microbiologiques.
• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
• Norme XP V 08-102:règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des
résultats:cas des dénombrements en milieu solide.
• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal
Violet et au Rouge neutre,
Biliée et Lactosée).
Inoculer la série de boites avec
1 ml des différentes dilutions.
1 1 1
1 ml ml
1 ml
ml
1 ml
ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,
refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.
Mélanger et laisser solidifier.

VRBL VRBL
Incuber la série de boites 24 ± 2 h à
30°,35° ou 37°C pour la recherche
des coliformes.

24 ± 2 h à 37°C 24 ± 2 h à 37°C 24 ± 2 h à 37°C


Dénombrer les colonies rouges qui poussent
en masse , noter la dilution correspondante.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 150.

Colonies rouges Colonies rouges


Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus
fortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150.
Appliquer cette formule:
∑c
N 1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre de
1 ère 2 1
colonies de la 1 dilution et c = nombre
2
de colonies de la 2ème dilution retenues).

d : le taux de dilution de la 1ère boite


retenue.

N = nombre de
RECHERCHE ET
DENOMBREMENT DES
COLIFORMES
THERMOTOLERANTS
ET ESCERICHIA COLI
DANS LES DENREES
ALIMENTAIRES.
Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal
Violet et au Rouge neutre,
Biliée et Lactosée).
Inoculer la série de boites avec
1 ml des différentes dilutions.
1 1 1
1 ml ml
1 ml
ml
1 ml
ml

10ˉ¹ 10ˉ² 10ˉ³


Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,
refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.
Mélanger et laisser solidifier.

VRBL VRBL
Incuber la série de boites
24 ± 2 h à 44°C.

24 ± 2 h à 44°C 24 ± 2 h à 44°C 24 ± 2 h à 44°C


Dénombrer les colonies rouges qui poussent
en masse , noter la dilution correspondante.
Tenir compte des boites ayant un nombre
compris entre 15 et 150.

Colonies rouges Colonies rouges


LECTURE ET
INTERPRETATION

Comptage des
coliformes
termotholérants.
Retenir 2 dilutions successives ( plus
fortes dilutions) oū le nombre de colonies
dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150.
Appliquer cette formule:
∑c
N 1,1 x d
∑c : c + c (c = nombre de
1 ère 2 1
colonies de la 1 dilution et c = nombre
2
de colonies de la 2ème dilution ).
d : le taux de dilution de la 1ère boite
retenue.

N = nombre de coliformes
termotholérants /gr ou ml.
Recherche et
dénombrement
d’Escerichia Coli:
Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur le
milieu Urée Indole.
Ensemencer le milieu Urée Indole.
Incuber le milieu Urée Indole
ensemencé 24 h à 37°C.

UREE
Lecture du milieu Urée Indole.
Production d’indole
= formation
KOVACS KOVACS
indole -
d’un anneau rouge.

indole + E.Coli: urée -


Indole +
Lecture et interprétation.
b x c
Formule: a =
A
b : Nombre de colonies caractéristiques indole +
c : Nombre total de colonies caractéristiques sur
la boite.

A : Nombre de colonies caractéristiques


repiqués.
a : Nombre d’Escherichia Coli identifiés.
Retenir 2 dilutions successives
( plus fortes dilutions) oū le nombre
de colonies dénombrées soit : 15
≤ c ≤ 150.
Appliquer cette formule:
∑ a
N
1,1 x d
∑a= Nombre d’Escherichia Coli identifiés.
d : le taux de dilution correspondant à la 1ére
dilution retenue.

N = nombre d’Escherichia Coli /gr ou ml.


CHERCHE DES SALMONELL
DANS LES DENREES
ALIMENTAIRES.
Références
• Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthode
de routine pour la recherche des Salmonella.
• Norme EN 12824 relative à la recherche des
Salmonella.
• Norme NF ISO 17025 relative aux
prescriptions générales concernant la
compétence des laboratoires d’étalonnage et
d’essais.
A - Cas de produit solide:
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile
contenant 25 gr de produit.
Broyer l’aliment.
Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

Eau

BROYEUR peptonnée

tamponnée
DE TYPE
STOMACHER flacon
de
225 ml
B - Cas de produit liquide.

25 ml
1
ml Introduire dans
Prélever 225 ml d’Eau Peptonée
25 ml de la Tamponnée
Suspension
mère
Eau
(+1) peptonnée

tamponnée

+1
Étape de pré enrichissement:
Incuber la solution ensemencée
d’Eau Peptonée Tamponnée
16-20h à 37°C.

Eau
peptonnée
tamponnée

INCUBER 16- 20h à 37°C


Étape d’enrichissement:
Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et
de sélénite à partir de la solution pré enrichie.

0,1 ml 2 ml

Bouillon Bouillon
Rappaport sélénite
Vassiliadis RAPPA-
PORT
SFB
S/C

Eau
peptonnée
Incuber 18- 24h à 42°C tamponnée Incuber 18- 24h à 37°C

Solution pré enrichie


Étape d’isolement:

Milieux utilisés:
Gélose Hektoen
Gélose au Vert
Brillant et au Rouge
de Phénol.
Isoler par des stries :
a- Ensemencer une boite de gélose
Hektoen à partir du tube SFB.
b- Ensemencer une boite de gélose
au Vert Brillant et au rouge de phénol
à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.

Anse de platine

SFB RAPPA-
PORT
S/C

37°C 42°C
18-24 h à 37°C
Repiquer 5 colonies typiques de
Salmonella sur le milieu TSI.
Colonies ayant un contour régulier.
Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou
sans centre noir sur la gélose Hektoen.
Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

. .
.
Repiquer 5 colonies typiques de
Salmonella sur le milieu TSI.

Stries
Anse de platine

faire une
Isoler par
piqûre centrale.
des stries

Incuber 24h à 37°C


Aspect d’un TSI de Salmonella.

H2S + H2S
TSI TSI Gaz TSI Gaz +
H2S + Pente Pente Pente
Gaz + Rouge Rouge Rouge

Culot Culot Culot


Noir Jaune Jaune

Autres Salmonella S.Typhi S.Paratyphi A


Ensemencer une galerie
biochimique.
CITRATE DE SIMMONS

CLARK ET
LUBS

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN


Lecture de la
CLARK ET
galerie biochimique. LUBS
Citrate de SIMMONS +
KOVACS
RM VP2
VP1

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN


+ - -
Lecture de l’indole et de la TDA.

1 goutte de
UREE réactif TDA

2 gouttes
de réactif Pas de Pas de
KOVACS formation virage.
d’anneau
rouge.

INDOLE - TDA -