Séminaire régional de formation sur le contrôle

bactériologique ,physico-chimique des aliments,

des eaux de boisson et eaux de baignade et sur
les techniques d’ échantillonnages
MOSTAGANEM 2017

TECHNIQUES D’ANAYSES
BACTERIOLOGIQUE DES EAUX

Présenté par:
GUERNAZ .M
Recherche et Dénombrement des
Microorganismes revivifiables.
Méthode par comptage des colonies
obtenues à 30°C

Recherche et Dénombrement des

Microorganismes revivifiables.
Méthode par comptage des colonies
obtenues à 22 et à 37°C, dans les
eaux minérales.

Recherche et Dénombrement des

Coliformes, CTT et Escherichia Coli
par filtration.

Recherche et Dénombrement des

Coliformes, CTT et E.Coli en milieu
liquide.
Recherche et Dénombrement des
Entérocoques intestinaux et S.
fécaux par filtration.

Recherche et Dénombrement des

Entérocoques intestinaux et S.
fécaux en milieu liquide

Recherche et Dénombrement de
Staphylocoques à coagulase + par
filtration.

Recherche et Dénombrement des

ASR par filtration par comptage des
colonies à 37°C et en gelose
profonde

Recherche des Salmonella par

filtration
 CONDITIONS DE
MANIPULATION DANS UN
LABORATOIRE

Les manipulations en bactériologie

doivent s’effectuer dans les conditions
d’asepsie les plus rigoureuses d’une
part pour ne pas contaminer le
manipulateur et d’autre part pour ne
pas contaminer le prélèvement à
examiner
Dans ce cas, il est impératif de
suivre les instructions suivantes:
Pour ne pas se contaminer
Port de blouse obligatoire

Bijoux dans les vestiaires

Couvrir les mains et les cheveux

(vernies, cheveux gênants)

Interdiction de manger ou de parler

pendant les manipulations

Ne pas se déplacer avec le matériel

contaminé (pipette, anse de
platine, tubes ouverts)
Ne pas déposer de documents sur
la paillasse pendant la
manipulation

Jeter les pipettes contaminées, les

lames et les lamelles dans les pots
d’eau de javel immédiatement
après leur utilisation

En cas d’accident (tubes

renversés, gouttes tombées sur la
paillasse ou sur la blouse)
décontaminer immédiatement à
l’eau javellisée
Nettoyer la paillasse à la fin de
chaque manipulation à l’aide d’un
chiffon imbibé d’eau javellisée

Ne pas porter ses mains à la

bouche ou à l’œil etc. , avant de
les avoir lavées

Se laver les mains au savon ou à

l’eau javellisée ou tout autre
désinfectant liquide approprié
avant de quitter le laboratoire
Pour ne pas contaminer le
prélèvement à examiner
Travailler au voisinage immédiat de
la flamme du bec bunsen(rayon de
20 cm)
Flamber rapidement l’orifice des
récipients à l’ouverture comme au
rebouchage
Ne jamais toucher avec les mains
la partie du bouchon ou du coton
qui pénètre dans le tube
Ne jamais déposer ce bouchon sur
la paillasses
Désinfecter les étuves au moins 1
fois par moi (sinon selon la charge
de
travail
Maintenir les récipients ouverts le
moins possible pour éviter les
dépôts de poussière
Flamber l’anse de platine avant et
après chaque usage
Passer plusieurs fois sur la
flamme, la pipette pasteur après en
avoir cassé l’extrémité,
immédiatement avant utilisation

s’il y’ à revivification respecter le
temps d’incubation

Le temps de la prise d’essai et les
incubations ne doit pas dépasser
20 minutes


Recherche et Dénombrement
des Microorganismes
revivifiables. Méthode par
comptage des colonies
obtenues à 22 et 37°C
 Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la
recherche et le dénombrement des
microorganismes dans les eaux
minérales embouteillées destinés à
la consommation humaine par
comptage
des colonies à 22° et à 37°C.
Définition.
Dans le sens de cette méthode,
on entend par microorganismes :
Bactéries, Levures, Moisissures se
développant en aérobiose, lorsque
l’essai est effectué selon la
Méthode spécifiée.
 Référentiels.
 Norme NF EN ISO 6222 : Dénombrement des
micro organismes revivifiables : comptage des
colonies par ensemencement dans un milieu de
culture nutritif gélosé.
 Norme NF V 08-010 : Règles générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
 Norme NF EN ISO 6887-1 : Suspension mère et
dilutions décimales ; 1. règles générales.
 Norme NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire
– Directives générales pour la préparation des
dilutions en vue de l’examen microbiologique.
 Norme XP V 08-102 :Règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des
résultats.
 Norme NF ISO 7218 :Règles générales pour les
examens microbiologiques.
 Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
 Mode Opératoire.
A partir de l’eau à analyser
(SM=1)et/ou des dilutions décimales
-1 -2
10 et 10 , porter aseptiquement 1
ml en double dans deux boites de
Pétri vides, numérotées et préparées
à cet usage Compléter ensuite avec
Environ 15 ml de gélose TGEA
fondue puis refroidie à 45±1°C
Le temps qui s’écoule entre le
Moment où l’on a distribué
l’inoculum dans la boite et celui où
le milieu est coulé ne doit pas
excéder 15 minutes.
Faire ensuite des mouvements
circulaires
et de va et vient en forme de « 8 »
pour permettre à l’inoculum de se
mélanger à la gélose, sur une surface
fraîche et horizontale.
Laisser solidifier les boites sur paillasse,
puis rajouter une 2eme couche d’environ
5 ml de la même gélose ou de gélose
blanche. Cette double couche a un
rôle protecteur contre les
contaminations
externes diverses.
Les boites seront partagées en deux
séries distinctes :
 La première série sera incubée à 22 ±
1°C pendant 70 ± 2 heures ,
 La seconde série sera incubée à 36 ±
1°C pendant 46 ± 2 heures.

 Lecture et interprétation.
Après la période d’ incubation;
procéder au comptage des colonies en
tête d’épingle
Une boite est considérée comme
lisible si la population est inférieure à
300 colonies.
Sinon, effectuer le comptage sur les
boites où l'échantillon a été dilué. Au
niveau de deux dilutions successives. Il
faudrait qu’une boite renferme au moins
15 colonies.
 Lecture et interprétation.
Calculer ensuite la valeur du
nombre N, de microorganismes
revivifiables à 22±1°C à part et celle du
nombre N de Microorganismes
revivifiables à 36±1°C à part, en tant
que moyenne pondérée, à l’aide de
l’équation suivante :
 N = 1,1 xΣ dc
Σ c : est la somme des colonies
dénombrées sur deux boites de dilutions
successives retenues.
d : est le taux de dilution correspondant à la
première dilution retenue .
Arrondir les résultats calculés à deux
chiffres significatifs après la virgule.
Le résultat final de microorganismes
revivifiables dénombrés à 22°C et à 37°C
par ml d’eau est noté par un nombre
compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x où
x est la puissance appropriée de 10.
Exemple :

Un dénombrement de
microorganismes à 37°C a donné les
résultats suivants
-2
 à la première dilution retenue 10 :
on a dénombré 120 colonies.
 à la seconde dilution retenue 10-3 : on
a dénombré 18 N colonies.
= 1,1
Σ cx d
Σ c = 120 + 18 =138
1,1 x d = 1,1 x 10-2 = 0.011
N= 138/0.011 = 1254.45
Arrondir à deux chiffres significatifs,
soit 1250 ou mieux encore :
N=1,25 x 103 UFC / ml d’eau à
37°C
 Schémas protocole recherche et
dénombrement des Microorganismes
revivifiables à 22 et à 37°C dans les eaux
minérales embouteillées

Eau à
Analyser 10-1 10-2

1 ml 1 ml 1 ml

sur
Ajouter
paillasse
environ
, ajouter
15ml5 de
ml
heures
gélose
puis incuber
TGEA 22
laisser
± 1°C,
solidifier
70 ± 2

1 ml
1 ml 1 ml

paillasse
Ajouter
,ajouter
environ5 15ml gélose36
ml puisdeincuber ± 1°C,
TGEA 46 ±solidifier
Laisser 2 heures sur

Dénombrer les colonies en tête

d’épingle ayant poussées en masse
dans chacune des boites puis calculer
N à 22°C et 37 °C
22
 Recherche et dénombrement des
Coliformes totaux , Coliformes thermo
tolérant et Escherichia coli
par Méthode par filtration
 Objet et domaine d’application.
Il s’agit là d’une méthode de référence qui
consiste en la recherche et le
dénombrement des bactéries Coliformes et
des Escherichia coli Éventuellement présents
dans les eaux destinées à la consommation
humaine, par comptage des colonies
obtenues en milieu solide après 24 à 48
heures d’incubation en aérobiose à37±1°C
pour les CT et à 44±1°C pour les CTT.
La présente méthode est recommandée
pour les eaux peu contaminées.
 Définitions.
Au sens de cette méthode, on entend par
Coliformes des bacilles à Gram négatifs,
Aéro-anaérobies facultatifs, non sporulés,
ne possédant pas d’oxydase, capables de se
multiplier en présence de sels biliaires et
capables de fermenter le lactose avec
production d’acide et de gaz en 24 à 48 H
à une T° comprise entre 36 et 38°C.
Les CTT ont les mêmes propriétés que les
coliformes mais à 44±1°C .
E Coli sont des CTT ayant la particularité de
produire de l’indole à partir du tryptophane
présent dans le milieu à 44 ± 1°C.
 Référentiels.
 Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et
dénombrement des E.coli et des bactéries Coliformes partie
1. Méthode par filtration sur membrane.
 Norme NF T90-413 : Recherche et dénombrement des
coliformes et des CTT. Méthode générale par
ensemencement en milieu liquide (NPP).
 Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par
comptage des colonies, méthode de routine.
 Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux
et d'Escherichia coli (annexe à NF V 08-015 et NF V 08-
016).
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens
microbiologiques.
 Norme XP V 08-102 :Règles générales pour le comptage
des colonies et l’expression des résultats : cas des
dénombrements en milieu solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant
la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
L’entonnoir est passée à la flamme à la fois
à l’ intérieur et à sa base qui va être en contact avec la
membrane de filtration
Le fritté est aussi passé à la flamme puisqu’il va recevoir la
partie inferieur de la membrane
On touche pas l’ intérieur de ‘entonnoir
La pince qui va saisir la membrane est passée à
la flamme de façon à éléminer d’ eventuel
Germes Refroidie dans de l’eau stérile
La membrane est déposée sur le fritté
Recouvert de l’entonnoir
L’ echantillon est homogénéisé ouvert dans la zone stérile à
proximité de la flamme.
On verse jusqu’au trait qui représente 100 ml
Le vide est effectué en ouvrant le robinet et en activant la
pompe. L’eau est ainsi évacuée. Fermer rapidement le
robinet de la rampe et éteindre la pompe.
Les éventuelles bactéries vont rester sur la membrane, la
saisir en dehors de la zone de filtration pour ne pas les
écraser.
Déposer la membrane sur le milieu de culture approprié en
évitant d’ effectuer des bulles entre la membrane et le
milieu de culture
Le milieu de culture sera incuber à l’envers à la T° désirée
 Mode opératoire.
La recherche des bactéries coliformes et
CTT par filtration sur membrane nécessite
une préparation au préalable, qui se
déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir
gradué en acier inoxydable ainsi que le
fritté à l’aide de la flamme du bec bunsen
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau
à analyser si on en dispose en quantité
suffisante ou bien avec de l’eau distillée
stérile.
Mettre en place de façon aseptique une
membrane de porosité nominale de
0,45 µ entre le fritté et l’entonnoir à
l’aide d’une pince stérile. Fixer ce
dispositif .
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou
250 ml d’eau à analyser, selon les
types d’eaux à analyser,
Actionner ensuite la pompe à vide pour
absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir puis transférer
immédiatement et aseptiquement la
membrane en la saisissant en dehors
de la zone de filtration à l’aide d’une
pince à bouts aplati stérile, sur la
surface d’une plaque de gélose TTC
TERGITOL préalablement préparée.
Cette dernière sera incubée couvercle
En bas à 36±1°C pendant 22±2 H
voire 44±4 H et servira à la recherche
des bactéries coliformes
Pour le protocole de recherche des
CTT même procédé mais la boite sera
incubée à 44°C pendant 22±2H voir
44±4H et servira à la recherche des CTT
suivie de l’identification biochimique des E,Coli
 Lecture et interprétation.
Coliformes totaux 37°C
Après la période d’incubation , dénombrer
les colonies caractéristiques de Coliformes
qui
se présentent sous forme de petites colonies
lisses légèrement bombées à contours
réguliers et pigmentés en jaune orangé ou
en jaune(lactose positives). Porter le
nombre
trouvé sur la feuille du résultat

CTT 44°C
Repiquer de façon aléatoire 3 ou 5 colonies
caractéristiques à des fins de confirmation
basée Sur l’aspect du TSI d’une part et la
production d’indole d’autre part.
Test à l’indole.

Parmi les 3 colonies prises transférer de

chacune d’elle la moitie dans un tube de
bouillon au tryptophane. Bien triturer la
colonie dans le milieu incuber ce dernier à
44±0,5°C pendant 21±3 heures puis
rechercher la production d’indole en ajoutant
2 à 4 gouttes du réactif de Kovacs. La
présence d’une coloration rouge à la surface
du bouillon conclue la production d’indole à
partir du tryptophane présent dans le milieu.
le résultat final sera exprimé selon
l’équation suivante :
b
a= * C
A
b : nbre de colonies caractéristiques
présumées dans la boite
A: nbre de colonies repiquées
C: nbre total de colonies trouvées dans la
boite

a = nbre UFC de CTT/100 ml

 Gélose lactosée au TTC et à l’heptadécylsulfate
de sodium :
Milieu de base.
Lactose Peptone
Extrait de Levure
Extrait de viande
Bleu de bromothymol
Agar agar
Eau distillée

Solution TTC.
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)
Eau distillée stérile

Solution d’heptadécylsulfate de sodium.

Heptadécylsulfate de sodium(Tergitol7)
Eau distillée stérile
Milieu complet.
 Milieu de base
 Solution TTC 5 ml
 Solution d’ heptadécylsulfate de sodium 5 ml
Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du
milieu à raison de 225 ml par fLacon. pH final après
stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
 schémas de protocole de recherche et
dénombrement des coliformes et des CTT, Méthode
par filtration

Filtration de 1OO ml d’eau

Eau à analyser

Entonnoir
Membrane 0,45 µ
Rampe
De filtration
A
Pompe

CT CTT sur milieu TTC TERGITOL

36 ± 1°C/22 ± 2 H voir 44 ± 4 H 43 ± 1°C / 22 ± 2 H voir 44 ± 4 H

CT CTT 1 colonie

Compter les B.Tryp

colonies caract 21 ± 44°C
3 heures - +

Test à l’indole
 schémas de protocole de recherche et
dénombrement des coliformes et des CTT, Méthode
par filtration
Echantillon d’eau
100 ml
3

CTT
CT milieu TTC
36 TERGITOL
H ± 1°C/22 ± 2 H voir 44 ± 4 H 43 ± 1°C / 22 ± 2 H voir 44 ± 4

37°C/24H
TSI

1 colonie

B. Tryptophane
44°C
heures
/22 ± 2
- +
Test indole
Compter les
colonies
 BOUILLON
TRYPTOPHANE

- +
TSI SUSPECT D ’E,COLI
 Recherche et dénombrement des
Coliformes, CTT et Escherichia coli en
milieu liquide

Objet et domaine d’application.

Cette méthode de routine, consiste en la

rechercheet le dénombrement des bactéries
coliformes CTT et des Escherichia coli dans
les eaux destinées à la consommation
humaine, en milieu liquide par la technique du
nombre le plus probable(NPP).
Définitions
Au sens de cette méthode, on entend
par Coliformes des bacilles à Gram négatifs,
aérobies ou anaérobies facultatifs, non
sporulés ne possédant pas d’oxydase,
capables de se multiplier en présence Des
sels biliaires et capables de fermenter le
lactose avec production d’acide et de gaz en
24à48 heures à une température comprise
entre 36 et 37°C

 Les CTT ont les mêmes propriétés que les

coliformes mais à 42 ± 2°C.
 Les Escherichia coli sont des CTT
ayant la particularité de produire de l’indole
à partir du tryptophane présent dans le milieu
à 42±2°C.
 Référentiels.
 Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et
dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries Coliformes partie 1. Méthode par
filtration sur membrane.
 Norme NF T90-413 : Recherche et
dénombrement des coliformes et des Coliformes
thermo tolérants. Méthode générale par
ensemencement en milieu liquide (NPP).
 Norme NF V 08-051 : Dénombrement des
Coliformes par comptage des colonies,
méthode de routine.
 Norme NF V 08-017 : Dénombrement des
Coliformes fécaux et d'Escherichia coli
(annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour
les examens microbiologiques.
 Norme XP V 08-102 :Règles générales pour
le comptage des colonies et l’expression des
résultats : cas des dénombrements en milieu
solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions
générales concernant la compétence des
laboratoires D’étalonnage et d’essais
 Mode opératoire.
La recherche et le dénombrement des
bactéries coliformes, coliformes thermo
tolérants et des Escherichia coli dans
les eaux, en milieu liquide par la
technique du NPP, se fait en deux
étapes consécutives :
le test de présomption : réservé à la
recherche des Coliformes,
Le test de confirmation : réservé à la
recherche des CTT et Escherichia coli.
Test de présomption.

Pour une eau de consommation

traitée
A partir de l’échantillon à analyser,
porter aseptiquement :
1 x 50 ml dans un flacon contenant 50
ml de milieu BCPL D/C muni d’une
cloche de Durham
5 x 10 ml dans 5 tubes contenant 10ml
de milieu BCPL D/C muni d’une cloche
de Durham
5 x 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml
de milieu BCPL S/C muni d’une cloche
de Durham,
Test de présomption.
Pour une eau de baignade
au préalable préparer des dilutions afin
d’appliquer la technique de
3tubes/dilution

1ml 1ml 1ml 1ml

9ml H2OD 9ml 9ml 9ml

dilution 10-1 10-2 10-3 10-4

A partir de l’échantillon à analyser ,porter

aseptiquement:
3x10ml dans des tubes de BCPL D/C

A partir de la dilution 10-1,porter aseptiquement:

3x1ml dans des tubes de BCPL S/C

A partir de la dilution 10-2,porter aseptiquement:

3x1ml dans des tubes de BCPL S/C

A partir de la dilution 10-3,porter aseptiquement:

 Chassez l’air éventuellement présent
dans la cloche de Durham et bien mélanger
le milieu et l’inoculum. L’incubation se fait à
37°C pendant 24 à 48 heures.
Lecture :
Seront considérés comme positifs , les
tubes présentant à la fois :
 un dégagement de gaz (supérieur au
1/10é de la hauteur de la cloche),
 un trouble microbien accompagné d’un
virage du milieu au jaune (ce qui constitue
le témoin de la fermentation du lactose
présent dans le milieu).
Ces deux caractères étant témoins de la
fermentation du lactose dans les conditions
opératoires décrites.
La lecture finale se fait selon les
prescriptions de la table du NPP .
 INOCULUM TEST
PRESEMPTIF
1 X 50 + 1
+
+
5 X 10 + 5
+
+

+
+
5X1 - 2
-
-

Le nombre caractéristique est donc «152» ;

ce qui correspond sur la table NPP au
nombre 54. On considère alors qu’il y a 54
Coliformes par 100 ml d’eau à analyser

Le résultat est donné : 54 UFC 100 ml

Test de confirmation.

 Le test de confirmation est basé sur

la recherche de Coliformes thermo
tolérants parmi lesquels on redoute
surtout la présence d’Escherichia coli.

 Les CTT ont les mêmes propriétés de

fermentation que les coliformes mais
à 44°C.

 Escherichia coli est un CTT qui entre

autre produit de l’indole à partir du
tryptophane présent dans le milieu à
44°C,
Test de confirmation.
 Les tubes de BCPL trouvés positifs
lors du dénombrement des Coliformes
feront l’objet d’un repiquage à l’aide
d’une öse bouclée dans tube contenant
le milieu Schubert muni d’une cloche
de Durham,
 Chasser l’air éventuellement présent
dans les Cloches de Durham et bien
mélanger le milieu et l’inoculum.
L’incubation se fait cette fois-ci
à 44°C pendant 24 heures.
 Lecture
 Seront considérés comme positifs, les
tubes présentant à la fois :
 un dégagement gazeux, et

 un anneau rouge cerise en surface:

témoin de la production d’indole par

Escherichia coli après adjonction de 2
à 4 gouttes du réactif de kovacs.
 La lecture finale s’effectue également
selon les prescriptions de la table du
NPP en tenant compte du fait que
Escherichia Coli est à la fois producteur
de gaz et d’indole à 44°C.
 Schémas protocole de recherche et
dénombrement des CT dans les eaux de baignade

3X10ml
3*1m

INCUBATION 37°C/24 à 48h

 Schémas protocole de recherche et
dénombrement des CT et CTT

Test de présomption
5 X 10 ml

1 X 50 ml 5 X 1 ml

INCUBATION 37°C/24 à 48h

- + ++ -
+
- + - - -

1 3 1
 Test de confirmation

+ + +
+
+

Repiquage sur milieu Schubert + cloche

Incubation 44°C /24H

A chaque tube de schubert positif
Ajouter 2à4 gouttes de réactif de
Kovacs mélangé avec précaution
l'apparition d'une coloration rouge
cerise en surface en moins d’une
minute après indique la présence
d’indole

+
 EAUX DE BAIGNADE
N° of tubes giving positive MPN
reaction out of 95%
Confide
nce
Llimits
INDEX
PER

3/10 ml 3/1 ml 3/0,1ml 100 ml Lowe Upper

r
0 0 0 <3
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13

1 0 0 4 0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 3 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 >2400
 EAUX TRAITEE
1 F/50 ML 5T D /10ML 5T S/1 ML INDICE
N P P
0 0 1 1%
0 0 2 2%
0 1 0 1%
0 1 1 2%
0 1 2 3%
0 2 0 2%
0 3 0 3%
0 3 1 5%
0 4 0 5%

1 0 0 1%
1 0 1 3%
1 0 2 4%
1 0 3 6%
1 1 0 3%
1 1 1 5%
1 1 2 7%
1 1 3 9%

1 2 0 5%
1 3 0 8%
1 3 1 11%
1 3 2 14%
1 3 3 18%
1 3 4 21%

1 4 0 13%
1 4 1 17%
1 4 2 22%
1 4 3 28%
1 4 4 35%
1 4 5 43%

1 5 0 24%
1 5 1 35%
1 5 2 54%
1 5 3 92%
1 5 4 161%
1 5 5 >240%
 denrées alimentaires
2 tubes / dilution 3 tubes / dilution

nbre nbre
caracterist cellules
ique

000 0,0
001 0,5
010 0,5
011 0,9
020 0,9

100 0,6
101 1,2
110 1,3
111 2,0

120 2,0

121 3,0

200 2,5
 Recherche et dénombrement des
Entérocoques intestinaux méthode par
filtration sur membrane.

Objet et domaine d’application.

Cette méthode de référence, consiste
en la recherche et le dénombrement des
entérocoques intestinaux ou Streptocoques
du groupe « D » de la classification de Lance
Field, ou encore Streptocoques fécaux dans
les eaux destinées à la consommation
humaine, par filtration sur membrane.
Définition
Au sens de cette méthode, on entend
par entérocoques intestinaux des bactéries
qui se présentent sous forme de cocci à
Gram positive, sphériques ou ovoïdes
formant des chaînettes, ne possédant pas
de catalase mais possédant l’antigène du
groupe D. Ils sont capables de se
développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un
milieu sélectif à l’azoture de sodium en
donnant des colonies caractéristiques
réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent
l’esculine en 2 heures à 44°C après
repiquage d’une colonie sur une gélose
biliée à l’esculine et à l’azoture.
Référentiels.
 Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416.
Recherche et dénombrement des entérocoques
intestinaux. méthode par filtration sur membrane.
 Norme NF T 90-411. Recherche et dénombrement
des Streptocoques du groupe D. Méthode
générale par ensemencement en milieu liquide
(NPP).
 Norme NF V 08-051 : Dénombrement des
Coliformes par comptage des colonies, méthode
de routine.
 Norme XP V 08-102 :Règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des
résultats : cas des dénombrements en milieu
solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires
d’étalonnage et d’essais.
Mode opératoire.
La recherche des entérocoques intestinaux ou
Streptocoques du groupe « D » par filtration sur
membrane nécessite une préparation au préalable,
qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir
gradué en acier inoxydable ainsi que la membrane
poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
 Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à
analyser si on en dispose en quantité suffisante ou
bien avec de l’eau distillée stérile.
 Mettre en place de façon aseptique une

membrane de porosité nominale de 0,45 µ entre la

membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince
stérile.
 fixer ce dispositif avec la pince correspondante
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou

50 ml d’eau à analyser, selon les types

d’eaux à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour

absorber l’eau à travers la membrane.

Retirer l’entonnoir puis transférer
immédiatement et aseptiquement la
membrane à l’aide d’une pince à bouts
arrondis stérile, à la surface d’une plaque
de gélose SLANETZ et BARTLEY
préalablement préparée.
Cette dernière sera incubée couvercle en

bas à 36±1°C pendant 44±4 heures.

Milieu de SLANETZ et BARTLEY. Milieu
de base

Tryptose :20,0g

extrait de levure:5,0g

Glucose:2,0 g

Phosphate dipotassique:4,0 g

Azide de sodium :0,4 g

Agar agar bactériologique:.10,0 g

Solution TTC

Chlorure de 2, 3, 5 triphényltétrazolium:0,1 g

pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.

 GELOSE B.E.A

Bio-Trypcase 17
Bio-Thione 3
Extrait de levure 5
Bile de bœuf 10
Chlorure de sodium 5
Citrate de sodium 1
Esculine 1
Citrate de fer ammoniacal 0.5
Azide de sodium 0.25
Agar 13.5

pH = 7,1
schémas de protocole de recherche et
dénombrement des entérocoques
intestinaux , Méthode par filtration

Filtration de 50 ml d’eau

analyser
Eau à

Entonnoir
Membrane 0,45 µ Rampe
de
3Filtration
postes
à
A
Pompe

sur milieu SLANETZ

BEA

transfert de la
membrane sur

44°C 2H
dénombrer les
colonies noires
 schémas de protocole de recherche et
dénombrement des entérocoques intestinaux ,
Méthode par filtration
Echantillon d’eau
50 ML
2

3
4

36 ± 1°C/44+4
-
milieu TTC SLANETZ
Si colonie
carac

transfert de la
membrane sur
BEA
dénombrer les
44°C 2H colonies noires
 Recherche et dénombrement des
Entérocoques intestinaux. Méthode générale
par ensemencement en milieu liquide (NPP).

Objet et domaine d’application.

Cette méthode de référence, consiste
en la recherche et le dénombrement des
entérocoques intestinaux ou Streptocoques
du groupe « D » de la classification de
Lance Field, ou encore Streptocoques
fécaux dans les eaux destinées à la
consommation humaine, en milieu liquide
La recherche et le dénombrement des
Streptocoques du groupe « D » dans les
eaux, en milieu liquide par la technique du
NPP, se fait en deux étapes consécutives :
le test de présomption : réservé à la
recherche présomptive des
Streptocoques.
le test de confirmation : réservé à la
confirmation réelle des Streptocoques du
groupe « D ».
Test de présomption.
A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement
:
1X50ml dans un flacon ROTHE D/C.
5X10ml dans 5 tubes ROTHE D/C
5X1ml dans 5 ROTHE S/C.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum.
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 H.
Lecture :

Seront considérés comme présomptifs les

tubes présentant un trouble microbien ;
seulement ces derniers :ne doivent en
aucun cas faire l’objet de
dénombrement doivent par contre,
absolument faire l’objet d’un repiquage sur
milieu EVALITSKY dans le but d’être
Test de confirmation..
Le test de confirmation est basé sur la
confirmation des Streptocoques du groupe
« D » éventuellement présents dans le test de
présomption.
Les tubes de ROTHE trouvés positifs feront
donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse
bouclée dans tube contenant le milieu LITSKY
EVA.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum.
L’incubation se fait cette fois-ci à 37°C, pendant
24 heures.

Lecture :
Seront considérés comme positifs, les
tubes présentant à la fois :
un trouble microbien, et
une pastille violette (blanchâtre) au fond
 Schémas de protocole de
recherche et dénombrement des
entérocoques
Test de
présomption
Analyser
Eau à

1 X 50ml 5 X 10ml 5 X 1ml

ROTHE D/C ROTHE D/C ROTHE S/C

37°C, 24 à 48 heures

ROTHE PRESENTE UN TROUBLE

ALORS REPIQUAGE SUR MILIEU EVA LITSKY
POUR LE TEST DE CONFIRMATION
INCUBATION 37°C/24H
 + + + ++ ++

Les tubes d’EVA présentant une formation

d’une pastille violette ou blanchâtre au
fond du tube seront considéré comme positif
 Recherche et dénombrement des
Spores de bactéries anaérobies
sulfito- réductrices et de Clostridium
sulfito- réducteurs. Méthode par
incorporation en gélose en tubes
profonds
Cette méthode consiste en la
recherche et le dénombrement des
spores des bactéries anaérobies
sulfito-réductrices et de Clostridium
sulfito-réducteurs dans les eaux
destinées à la consommation
humaine, par incorporation en gélose
en tubes profonds.
Définition
 Au sens de cette méthode, on entend par
bactéries anaérobies sulfito-réductrices des
bactéries qui se présentent sous forme de
bacilles à Gram positif et qui en se
développant à température de 36±1°C en 24
à 48 heures en gélose profonde de type
gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou
Tryptose Sulfite Néomycine ou encore
gélose Viande Foie, donnent des colonies
caractéristiques qui sont de couleur blanche
entourées d’une auréole noire. Cette
dernière est le témoin de la réduction du
sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve
dans le milieu, en sulfure qui en présence de
Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de
couleur noire.
 La présence de spores de bactéries ASR
dans les eaux, sans flore
d’accompagnement, constitue
généralement un véritable indice de
contamination ancienne.
Référentiel
 Norme NF T 90-415. Recherche et dénombrement
des spores de bactéries anaérobies sulfito-
réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs.
Méthode générale par incorporation en gélose en
tubes profonds.
 Norme NF T 90-417. Recherche et
dénombrement des spores de microorganismes
anaérobies sulfito-réducteurs et de Clostridium.
Méthode par filtration sur membrane.
 Norme ISO 6461 – 2. Recherche et
dénombrement des spores de micro- organismes
anaérobies sulfito-réducteurs Clostridia. Méthode
par filtration.
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les
examens microbiologiques.
 Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des
résultats : cas des dénombrements en milieu
solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires
d’étalonnage et d’essais.
 Mode opératoire.
 A partir de l’eau à analyser :
 Transférer environ 22 ml dans un tube stérile,
qui sera par la suite soumis à un chauffage
de l’ordre de 80°C pendant 10minutes, dans
le but de détruire toutes les formes
végétatives des bactéries ASR éventuellement
présentes.
 Après chauffage, refroidir immédiatement le
flacon destiné à l’analyse, sous l’eau de
robinet.
 Répartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4
tubes différents et stériles, à raison de 5 ml
par tube.
 Ajouter environ 15 ml de gélose Viande Foie,
fondue puis refroidie à 46°C, additionnée d’1
ampoule alun de fer et 1ampoule sulfite de
sodium
 Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en
évitant d’introduire des bulles d’air et de
l’oxygène.
 Laisser solidifier sur paillasse pendant 30
minutes environ, puis incuber à :
o 36 ± 1°C, pendant 44 ± 4 heures,
 Lecture et interprétation.
 La première lecture doit absolument être faite à
16 heures car très souvent les spores des
bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont
envahissantes auquel cas on se trouvera en face
d’un tube complètement noir rendant ainsi
l’interprétation difficile voire impossible et
l’analyse sera à refaire en utilisant des di lutions
décimales de 10-1 voire 10-2, la deuxième lecture
se fera à 24 heures et la troisième et dernière à
44±4 heures.
 Dénombrer toute colonie noire de 0,5 mm de
diamètre, ayant poussé en masse et rapporter le
nombre total des colonies dans les quatre tubes à
20 ml d’eau à analyser.
jarre anaérobie
 22 ml d’eau à
analyser

Chauffage à 80°C, 10 minutes Refroidissement

brutal sous l’eau de robinet Répartir à raison de 5
ml par tube dans 4 tubes

Ajouter environ 15 ml de gélose VF fondue

puis refroidie à 46±1°C
Laisser solidifier puis incuber 37°C

1ere lecture après

16h

2eme lecture après

24h

3eme lecture après

48h

80
 Recherche et Salmonella dans les
eaux. Méthode par filtration.

Objet et domaine d’application.

Cette méthode consiste en la recherche et

l’identification des Salmonella présentes dans les
eaux destinées à la consommation humaine, par
filtration.

Définition.

Au sens de cette méthode, on entend par

Salmonella, des bactéries qui se présentent sous
forme de bacilles à Gram négatif et qui en se
développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48
heures, sur milieu Hektoen, forment de petites
colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en
vert ou en bleu vert à centre noir.
Les Salmonella se divisent en deux grands groupes
: les mineures et les majeures qui sont hautement
pathogènes
Référentiels.

 Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et

dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries Coliformes partie 1. Méthode par
filtration sur membrane.
 Norme NF T90-413 : Recherche et
dénombrement des coliformes et des coliformes
thermo tolérants. Méthode générale par
ensemencement en milieu liquide (NPP).
 Norme NF V 08-051 : Dénombrement des
Coliformes par comptage des colonies, méthode
de routine.
 Norme NF V 08-017 : Dénombrement des
Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annexe
à NF V 08-015 et NF V 08-016).
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les
examens microbiologiques.
 Norme XP V 08-102 : Règles générales pour
le comptage des colonies et l’expression des
résultats : cas des dénombrements en milieu
solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires
d’étalonnage et d’essais
Mode opératoire.
 La recherche des Salmonella par filtration sur
membrane nécessite une préparation au
préalable, qui se déroule selon les étapes
suivantes :
 Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir
gradué en acier inoxydable ainsi que la membrane
poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
 Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à
analyser si on en dispose en quantité suffisante ou
bien avec de l’eau distillée stérile.
 Mettre en place de façon aseptique une
membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse
et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.
 Fixer ce dispositif la pince correspondante.
 Déposer ensuite 250 ml, 500 ml ou plus selon
disponibilité jusqu’à 1 voire 5 litres d’eau à
analyser, devant un bec bunsen.
 Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber
 Retirer la membrane à l’aide d’une pince stérile
puis la placer dans un flacon contenant le milieu
Eau Peptonée Tamponnée.
 Bien mélanger le filtre dans le milieu, puis incuber
ce dernier à 36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures. Cette
étape constitue l’enrichissement primaire.
 Après incubation, procéder à un enrichissement
secondaire en transférant 1 ml de l’enrichissement
primaire sur le milieu Rappapport Vassiliadis.
 Bien mélanger le milieu et l’inoculum, puis incuber
ce dernier à 42 ± 0,5°C pendant 20 ± 4 heures voire
44 ± 4 heures.
 Après l’incubation, procéder à l’isolement sur
milieu Hektoen ou XLD à incuber à 36 ± 2°C
pendant 20 ± 2 heures
Lecture et interprétation.

 Repérer les colonies caractéristiques.

 Faire une identification biochimique basée
essentiellement sur ONPG, TSI, Urée - Indole,
LDC…
 Si nécessaire faire une identification antigénique
basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide
des sérums de groupe OMA et OMB ou bien
s’adresser à un laboratoire compétent en vue d’une
confirmation.
Remarque :

Au cas où la quantité d’eau à analyser n’est pas

très suffisante, transférer 10 ml directement sur
Milieu Eau Peptonée Tamponnée à incuber à 36 ±
2°C pendant 20
± 2 heures. Cette étape constitue l’enrichissement
primaire. Poursuivre les autres étapes comme décrit
ci-dessus
RECHERCHE SALMONELLE DANS
LES EAUX PAR FILTRATION

Filtration de 250 mlà 5 litres d’eau Analyser

Eau à

Entonnoir
Membrane 0,45µ

Rampe de

Filtration

Pompe à 3 postes

Milieu RV

42 ± 0,5°C pendant 20 ± 4 heures

voire 44 ± 4 heures

Gélose Hektoen ou XLD

36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures.
ONPG, TSI, Urée Indole, LDC,
COLONIES SUSPECTE DE SALMONELLE
 Recherche et dénombrement des
staphylocoques à coagulase positive
dans les eaux par filtration
*Objet et domaine d’application.
 Cette méthode de référence, consiste en la
recherche et le dénombrement des
Staphylocoques à coagulase positive dans les
eaux destinées à la consommation humaine, par
filtration sur membrane.
Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par
Staphylocoques à coagulase positive, bactéries
qui se présentent sous forme de cocci à Gram
positive, sphériques, isolées ou regroupées
formant ainsi des grappes de raisin, possédant
l’enzyme catalase et la coagulase. Ils sont
capables de se développer en 24 à 48 heures à 36
± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol.
 L’espèce type du genre est Staphylococcus
aureus, elle est pathogène et la plus redoutée.
Référentiels.

 Norme NF T 90 421. Recherche et

dénombrement des Staphylocoques à coagulase
positive dans les eaux destinées à la
consommation humaine. Méthode par filtration.
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les
examens microbiologiques.
 Norme XP V 08-102 :Règles générales pour le
comptage des colonies et l’expression des
résultats : cas des dénombrements en milieu
solide.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires
d’étalonnage et d’essais.
Mode opératoire
La recherche des Staphylocoques à coagulase
positive ou plus particulièrement Staphylococcus
aureus, par filtration sur membrane nécessite une
préparation au préalable, qui se déroule selon les
étapes suivantes :
 Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué
en acier inoxydable ainsi que la membrane
poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
 Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à
analyser si on en dispose en quantité suffisante ou
bien avec de l’eau distillée stérile.
 Mettre en place de façon aseptique une membrane
de porosité nominale de 0,45 µ entre la membrane
poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.
 Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
 Déposer ensuite aseptiquement 100 ml d’eau à
analyser, selon les types d’eaux à analyser, devant
un bec bunsen.
 Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber
l’eau à travers la membrane.
 Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et
aseptiquement la membrane à l’aide d’une pince à
bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de
gélose Chapman au mannitol préalablement
préparée.
 Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36
± 2°C pendant 44 ± 4 heures
 Après la période d’incubation spécifiée, les
Staphylocoques à coagulase positive ou plus
particulièrement Staphylococcus aureus,
apparaissent sous forme de petites colonies lisses
légèrement bombées à contours réguliers et
pigmentées en soit en jaune ( fermentation du
mannitol) ou en blanc.
 Prendre 3 à 5 colonies au hasard, une demi
colonie servira au test à la catalase, l’autre demi
sera triturer dans un tube contenant du bouillon
BHIB,à incuber à36 ± 2°Cpendant 20 ±4 heures.
 Staphylococcus aureus, possède ces deux enzymes.

 Test à la catalase.
 Placer séparément deux gouttes d’une solution
de peroxyde d’hydrogène à 20volumes sur une
lame de microscope. Prélever une demi colonie
avec une tige de verre (pipette Pasteur) ou en
plastique (surtout pas de fil métallique) et
l’émulsionner doucement dans une des deux
 Observer immédiatement et après 5 minutes s’il
y a apparition (catalase positive) ou absence
(catalase négative) de bulles d’oxygène. Dans le
cas où il y a doute, recouvrir chacune des gouttes
avec lamelle de microscope et comparer
l’apparition des bulles sous les deux lamelles. Les
observations peuvent se faire
macroscopiquement ou à l’aide d’un microscope à
faible grossissement.
 Test à la coagulase libre.
 Après incubation du bouillon BHIB, ajouter
stérilement 0,1 ml de cette culture à 0,3 ml de
plasma de lapin contenu dans un tube stérile à
hémolyse, et inc uber de nouveau à 36 ± 2°C
pendant 2 à 6 heures.
 Examiner la coagulation du plasma de lapin
sinon ré-incuber et examiner de nouveau à 20 ± 4
heures.
 Considérer que la réaction à la coagulase est
 Le tableau suivant résume quelques
caractères biochimiques de différentes
espèces de Staphylocoques.
ue
Staphylocoq aureus intermedius saprophyticus epidermitis

Catalase + + + +

Coagulase + + - -

Mannitol en
anaérobie + - - -

Résistance
(5
Novobiocine
la Micro-gr )à

S S R S

Coagulas
e
 Recherche de Staphylocoques à
coagulase positive dans les eaux destinées à la
consommation humaine. Méthode par filtration sur
membrane

Filtration de 100 mld’eau Analyser

Eau à

Entonnoir
Membrane 0,45µ
Filtration
3
Rampe
postes
de
à

Pompe

Incuber
caractéristiques
àGélose
36 ±Distinguer
2°C,
Chapman
20 ± 4les
hau
puis
colonies
mannitol
44 ± 4 heures

Catalase Coagulase
Merci pour votre
intention
avez vous des
questions

guernazlhw@live,fr