TP V : Observation microscopique des bactéries après coloration L2

Université de Saida Dr MOULAY Tahar

Département de biologie Année universitaire 2022-2023

L2 Module : Microbiologie

TP V : OBSERVATION MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES APRÈS COLORATION

Objectif
La coloration des bactéries est un moyen d’augmenter leur contraste de
manière à mieux les observer en microscope à fond clair. Dans les conditions
normales, les procaryotes ont en général un pH intracellulaire neutre et une surface
cellulaire globalement chargée négativement. Ceci explique l’efficacité des colorants
basiques pour l’observation de la morphologie bactérienne.
La coloration peut s’appliquer :
-soit sur des cellules vivantes en utilisant des colorants dilués ;
-soit sur des cellules tuées par FIXATION en utilisant des colorants concentrés.
Toutes les techniques de coloration sur des
bactéries tuées requièrent trois étapes principales :
- La préparation du frottis
- La fixation
- La coloration proprement dite :
-Coloration simple (un seul colorant). Coloration
différentielle type Gram (deux colorants). Colorations
spéciales des structures bactériennes (capsules, spores,
flagelles….).
Matériel et cultures microbiennes :
En plus des colorants, de l’eau et de l’alcool Vous
disposez de trois cultures : de Lactococcus, E. coli et de
Saccharomyces. Les manipulations suivantes vont être
réalisées pour les trois microorganismes.
1. Réalisation des frottis
a. Étalement
L'étalement doit se faire en couche mince, sur une
lame dégraissée soit par un mouvement régulier et
circulaire à l'aide d'une anse de platine (figure n° 3), soit
en tirant de façon uniforme l'effilure d'une pipette
Pasteur (figure n° 4).
b. Séchage
Le séchage de la lame doit se faire autant que
possible à la température du laboratoire, ou en la
maintenant dans l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un
bec Bunsen (figure n° 5).

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TP V : Observation microscopique des bactéries après coloration L2

Il faut éviter un séchage trop brutal, à une température trop élevée (altération
de certains constituants, en particulier la paroi bactérienne).
c. Fixation
Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame
opposée à l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement
(figure n° 6).
On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool
méthylique versées directement sur le prélèvement.
À ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.
1.1. Coloration de GRAM.

a. Déposer quelques gouttes de Violet de gentiane.

b. Laisser agir une minute.
c. Égoutter puis rincer la lame avec de l'eau par un jet de pissette.
d. Déposer quelques gouttes de Lugol.
e. Laisser agir une minute.
f. Égoutter puis rincer la lame avec de l'eau.
g. Faire couler sur la lame incliné (pas sur l'étalement) l'Alcool. Jusqu'à disparition du Violet
(5 à 10 secondes).
h. Rincer avec de l'eau.
i. Laisser agir quelques gouttes de Fuchsine 25 secondes.
j. Rincer avec de l'eau.
k. Sécher la lame entre deux feuilles de papier joseph, papier filtre ou en la maintenant dans
l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un bec Bunsen.

L'examen au microscope sera effectué avec un objectif 100 en présence d'huile

d'immersion.
1.2. Coloration simple
Sur le frottis fixé et refroidi, faire couler la solution de bleu de méthylène
jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte et laisser agir 1 minute.
Rincer abondamment la lame avec un jet d'eau distillée, ou avec de l'eau du
robinet jusqu'à élimination de l'excès de colorants puis sécher à l'air ou sécher
doucement entre deux feuilles de papier joseph, sans frotter. L'examen au
microscope sera effectué avec un objectif 100 en présence d'huile d'immersion.

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