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Compte Rendu Du TP de
Microbiologie

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Compte rendu du stage de Tp de 

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Microbiologie 

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Année 2002-2003

Préparation des milieux et du matériel

L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des
méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations
nécessitent l’emploi de milieux de culture.

Principales caractéristiques d’un milieu de culture

Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments
chimiques les constituant, sous une forme appropriée.
Un bon milieu doit :
   Etre stérile
   Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la
croissance et l’entretien des microorganismes.
   Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien.
   Avoir un pH convenable.
Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes est dit milieu minimum.

Classification des milieux de culture

Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur utilisation.
a) Classification selon la composition.
1. Milieux naturels ou empiriques
Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande,
peptone), soit végétale (pomme de terre, levure).
2. Milieux synthétiques
Milieux composés de substances chimiques exactement définies
3. Milieux semi synthétiques
Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel
b) Classification selon l’utilisation
1. Milieu usuels = milieu de base
Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel
2. Milieu d’isolement
Les milieux d’isolement peuvent être :
   Des milieux de base
   Des milieux enrichis de produits biologiques
   Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettant
un développement particulièrement abondant de certains germes.
   Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux
dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci,
 judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des
bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux
permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un
mélange de germes.
3. Milieu d’identification
Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les
problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins.

c) Classification selon leur présentation

1. Milieux liquides
Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions
riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente.
La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie
par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme
se développe.
2. Milieux solides
Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Si
il y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide.
Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc.
La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de
l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se
multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie.

Préparation des milieux de culture

Sachant que de la préparation des milieux de culture dépend les résultats de l’analyse microbiologique,
un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc
apporter un grand soin à leur fabrication.
Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique :
- Le prêt à l’emploi
- Le prêt à couler
- En poudre
Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre coût, ce
sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la
dose à peser pour un volume final de milieu.
Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en :
- La pesée
- La dissolution des ingrédients
- La mesure du pH
- La répartition
- La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min)
Rq : L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la
mesure du pH.

Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation

Durant ce Tp nous avons utilisé :

Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN)
Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN)
Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA)
De l’eau physiologique

Gélose nutritive (GN):

Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une
grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération des
microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières.
Elle est constituée :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
- agar
Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlen
de 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreau
aimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait bien
dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments du
milieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure de
l’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu à
l’autoclave à 121°c pendant 20 min.

Bouillon nutritif (BN) :

Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le fait
qu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de :
- extrait de levure
- bouillon nutritif (nutrient broth)
- glucose
Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive.

Gélose EMB (éosine methylen bleu) :

La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblement
sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels que
les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose
positifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé.
Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eau
déminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20
min suivant le même protocole que précédemment.

Gélose Malt agar :

Elle est constituée :

- extrait de malt
- extrait de levure
- glucose
- agar
Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les
constituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pour
préparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuille
d’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tous
les constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée.
Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min.
La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicol

L’eau physiologique :

Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elle
constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la
différence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse.

Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les géloses
de façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen.

Familiarisation avec le monde microbien

Les Techniques de préparations microscopiques 

L’observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration.
Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme des
germes ; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration,
après fixation et desséchage des préparations, opérations tuant les germes.

Observation sans coloration : Etat frais

L’observation de l’état frais se réalise à l’objectif x40, le condenseur descendu, et le diaphragme

légèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit la
propriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants.

1) Technique opératoire

La technique opératoire consiste à préparer une lame propre dégraissée et sèche.

Homogénéiser la suspension à observer : prélever aseptiquement à la Pipette Pasteur une goutte de
culture : déposer cette goutte au centre de la lame.
Rq : Si on part d’un produit solide comme une colonie sur une boite de pétri par exemple, on déposera
d’abord une goutte d’eau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantité de la colonie à l’aide
de l’ose.
On recouvrira ensuite la goutte d’une lamelle tout en évitant les bulles d’air et les débordements de
liquide au-delà de la zone délimitée par la lamelle.
On observera sur fond clair avec l’objectif 40.

2) Interprétation

Cette préparation permet d’apprécier :

   Le nombre de bactéries contenues dans le prélèvement ; notion semi quantitative permettant de

dire s’il y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultérieurement pour choisir la
quantité d’inoculum convenable pour l’observation d’un bon isolement et d’une bonne culture).

   La forme des bactéries

   Coques ou cocci : éléments arrondis, sphériques.

   Bacilles : bâtonnets : éléments allongés de taille variable.

Bacilles de taille moyenne

Bacilles grêles

Gros bacilles trapus

Bacilles courts et arrondis : coccobacilles

   Le mode d’assemblage de bactéries

Isolés
Groupés par deux : diplocoques
Coques En grappe ( Staphylocoques )
En chaînettes ( Streptocoques )
En longue chaînes
Isolés
En courtes chaînettes
Bacilles
En chaînes
En palissades

   La mobilité

Les cellules peuvent être mobiles : la présence de cils ( non visibles à l’état frais) favorise le
déplacement qui ne doit pas être confondu avec le mouvement général du liquide ou avec le mouvement
brownien si la température du liquide est trop élevée (du fait de l’éclairage continu).
Un corps microbien est mobile lorsqu’un individu observé traverse le champ du microscope ou lorsque
deux individus se croisent.

Il ne faut pas oublier que dans un échantillon, il y a le plus souvent plusieurs types de bactéries, l’état
frais permet de savoir combien de types différents sont présents. Dans d’autres cas, cette observation
permet de vérifier la pureté d’une culture. Il ne faut jamais oublier que les bactéries sont vivantes.
L’observation de l’état frais est une étape indispensable et très importante, qui apporte de nombreux
renseignements et oriente déjà le diagnostic et permet de passer à l’étape suivante : l’observation de
préparations colorées.

Observation après coloration

Les observations après coloration se font à l’objectif 100 à l’immersion, le condenseur relevé à fond, et
le diaphragme ouvert entièrement.

Avant tout examen d’un frottis coloré, il faut dans un premier temps réaliser le frottis.

1) Préparation d’un frottis

On dépose une goutte de culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte d’eau au centre
d’une lame.
On étale la préparation avec l’oese de façon à obtenir une couche mince
On sèche la lame.
On fixe la préparation en écrasant la flamme du bec 2 à 3 fois avec la lame.

2) Colorations

Les colorants simples que l’on emploie sont des colorants acides qui colorent uniformément les cellules,
et des colorants basiques à affinité pour le cytoplasme (fushine, violet de gentiane)

Durant ce Tp nous avons réalisé :

Un examen après coloration différentielle d’un frottis, c’est la coloration de Gram.

2.1) Coloration de Gram

C’est la coloration la plus utilisée en microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de
microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est basée sur la différence de structure des parois
mise en évidence par la double coloration.
La lecture se fait avec l’objectif à immersion. La coloration de Gram permet de classer les bactéries en
deux grandes catégories :
- Les bactéries à Gram positif qui gardent la coloration violette après action de l’alcool
- Les bactéries à Gram négatif qui sont décolorées par l’alcool et teintées en rose plus ou moins vif
par la fushine.

Cette distinction, base de toute la taxonomie bactérienne repose sur une variation dans la structure de
la paroi des bactéries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactéries à Gram négatif permet à
l’alcool de traverser cette paroi et de dissoudre le composé coloré, fixé dans le cytoplasme, résultat de
l’action conjointe du violet de gentiane et du lugol.
Par contre, la paroi des Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est imperméable à
l’alcool et par conséquent garde le complexe coloré violet.

2.2) La coloration des spores

La coloration de spore permet de mettre en évidence les spores ou endospores, qui constituent les
formes de résistances de deux classes de bactérie :
- Les Bacillus (aérobie)
- Les Clostridie (anaérobie)
La spore est résistante à la chaleur, à la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en évidence il
faut réaliser une coloration à chaud faisant intervenir du vert de Malachite, rincer à l’alcool, et faire une
contre coloration à la safranine.

Endospore

Les spores seront colorées en vert et le cytoplasme des bactéries en rose.

2.3) Coloration à la nigrosine :

La nigrosine est un colorant qui peut permettre la mise en évidence des cicatrices des bourgeonnements
des levures. Sinon on l’utilise lors d’état frais pour augmenter le contraste de la préparation.

2.4) Coloration à l’encre de chine :

L’encre de chine est obtenue à partir d’une suspension de particules de charbon. Du fait de la taille
élevée des particules, celles-ci ne pénètrent pas dans la cellule. On observe donc des cellules non
colorées sur un fond noir. Cette technique est une coloration négative, puisqu’on ne colore pas les
cellules, ainsi on peut mettre en évidence la présence de capsules qui apparaissent blanchâtre autour de
la cellule qui elle est réfringente.
La technique consiste à placer sur une lamelle une goutte de la préparation et une goutte de colorant
côte à côte.

Et de déposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mélangeront, et on observera au grossissement
x40.

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Observation d’un mou de raisins

Le mou de raisin est un mélange en solution aqueuse de raisins écrasés. Afin d’observer les différentes
catégories de germes présents, nous avons réaliser des techniques microscopiques d’observation.

Coloration de Coloration à
Techniques
  Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) spore l’encre de chine
d’observation
(G x100) (G x 40)
On observe des
bactéries et des
On observe des
levures. Les
  Onobserve des bactéries en forme de bactéries roses en
bactéries ne
bâtonnet qui ne possèdent pas de forme de bâtonnet
Observations possèdent pas
mobilité. ne présentant pas
d’halo blanc
 On observe également des levures de spores, et des
caractérisant la
levures roses.
présence de
capsule.

On peut donc constater que le raisin possède plusieurs flores microbiennes : une d’origine bactérienne et
l’autre de type levure. Ces deux flores sont nécessaires à la fabrication du vin.

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Observation d’un jus de radis

Coloration de Coloration à
Techniques
  Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) spore l’encre de chine
d’observation
(G x100) (G x 40)
  On
observe des protozoaires.
  On
observe des arthrospores. On observe
Observations
 On observe également du quelques capsules.
pseudomycélium.

Sélection des bactéries formants des endospores dans la suspension de radis

Les spores sont des formes de résistances, afin de les mettre en évidence nous allons mettre dans des
conditions de stress un aliquote de notre solution de jus de radis à 90°C pendant 20 min.
Cette étape à pour but de tuer toutes les formes végétatives, et de sélectionner uniquement les formes
sporulantes.
Par étalement sur un milieu GN de notre aliquote chauffé et après incubation, on a obtenu des colonies
correspondantes aux bactéries sporulées.
Nous avons ainsi confirmé la présence de spores et isolé les bactéries sporulantes.

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