UNIVERSITE DE DOUALA FACULTE DES SCIENCES

Département de biochimie

TRAVAUX PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE BCH 336 (BC3)

Les consignes de sécurité:

1- Procéder à un lavage minutieux des mains, avec brossage des ongles avant et après les
manipulations, et avant toute sortie même momentanée de la salle de TP.
2- Éviter les ouvertures des fenêtres pendant les manipulations
3- Ouvrir avec précaution les récipients contenant des cultures microbiennes, afin d'éviter toute
projection.
4- Flamber, avant et après manipulations, les anses métalliques utilisées pour les prélèvements, en
commençant par chauffer la partie moyenne de l'instrument afin de dessécher les restes de culture
avant de porter l'extrémité dans la flamme, ceci pour éviter toute projection.
5- Prévenir immédiatement le responsable de TP en cas de bris d'un récipient contenant une
culture, en cas de contamination accidentelle d'un manipulateur ou tout incident dispersant le
matériel microbien.
6- Interdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les TP
7- Stériliser tout le matériel septique à la fin de la manipulation
8- Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise à l'abri des souches microbiennes ainsi
que leur destruction afin d'éviter toute contamination.

Matériel à prévoir par le manipulateur (par le groupe de TP)

- Deux paires de gants
- deux boîtes de mayonnaise propres avec couvercles (contenance maximale de 0,5 L)
- 1 L d’éthanol (alcool) 95° C
- 0,5 L d’eau de javel
- 01 sachet de détergent domestique
- Une mèche de coton pour lampes domestiques
- Un sachet de coton stérile
- Une boîte d’allumettes ou un briquet

TP N°1 : Préparation d’un milieu de culture bactérien ou fongique

Introduction

La croissance microbienne est hautement conditionnée par la présence d’aliments ; ainsi

une croissance exponentielle et optimale des microorganismes est obtenue lorsque le microbe
possède une qualité quasi-infinie d’aliments à disposition. En culture (In vitro), ces aliments leur
sont apportés au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux de culture. Pour permettre le
développement des microbes le milieu doit :

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- contenir tous les aliments nécessaires en quantité suffisante et en proportion relativement
convenable : le milieu doit être nutritif et équilibré.

- avoir un pH, une pression osmotique, une viscosité des caractéristiques physico-chimiques
compatibles avec la vie microbienne.

Comme les besoins nutritionnels des micro-organismes et les conditions de leurs

développements sont très variés il n'existe évidemment aucun milieu universel sur lequel tous les
microbes soient capables de se multiplier. Toutefois, certains milieux conviennent au
développement d'une grande variété de germes microbiens ; le choix de tels milieux repose sur la
connaissance de l'habitat naturel et de la physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on
désire cultiver.

Les milieux sont choisis sur la base:

de la nature du prélèvement : surfaces, pus, sécrétions, selles, organes, broyages ...

des buts de l'étude : identification, dénombrement, antibiogramme...
de la précision attendue : dans le cas de bactéries pathogènes par exemple,
des moyens à disposition du chercheur : matériel, temps, ...

D'une manière très générale, on peut distinguer:

1. Milieux synthétiques:

Préparés exclusivement avec des produits chimiques purs. Le milieu synthétique de

composition bien définie, constitue le milieu de culture idéal. Ce type de milieu permet d'obtenir
des résultats comparables et de déceler avec précision les modifications qu'il subit au cours du
développement microbien. Il n'en est généralement pas de même avec les milieux non
synthétiques qui sont constitués par des éléments complexes de composition variable. Les milieux
synthétiques conviennent surtout aux moisissures (champignons microscopiques) mais fort peu
aux bactéries.

2. Milieux complexes :

Milieu dont on ne connaît que partiellement la composition. Ces milieux de culture

peuvent contenir des extraits de levure (cellule de levure déshydratée et lysées) qui fournissent
une source d'acide aminé de vitamine et d'azote, des extraits de malt apportant une source de
carbone, des peptones (protéine animale, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique
qui intéresse les individus hétérotrophes. (Ex. bouillon nutritif, bouillon au soja.).

Parmi ces 2 types de milieu, il existe des milieux sélectifs : qui vont permettre de
sélectionner le type de microorganisme qui pourra cultiver dessus, alors que tous les autres micro-
organismes présents sont inhibés.

Un milieu de culture est rendu sélectif pour une espèce microbienne lorsque sont seules
satisfaites les exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce
Les principaux facteurs de sélection microbienne utilisés seuls ou en association sont :

- la température d’incubation

- Le pH du milieu

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- La faculté d’utiliser une source nutritive déterminée (carbone, azote).

- La résistance à l’action bactéricide d’un antiseptique ou d’un antibiotique.

Un milieu minimum est un milieu comportant les éléments chimiques strictement

nécessaires à la croissance du microorganisme, sous une forme utilisable par des microorganismes
n'ayant pas d'exigence particulière. Ils contiennent Une source de carbone et d'énergie,
généralement le glucose. Une ou plusieurs sources de macrominéraux, d’oligoéléments, une
source d'eau, indispensable à toute forme de vie, un tampon pH: il permet de maintenir un pH
correct voire optimum. En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent
pas, car elles ne peuvent synthétiser ces produits. C'est l'adjonction de facteur(s) de croissance
approprié(s) qui permet à des bactéries exigeantes de se développer : on parle alors de milieu
enrichi (Ex. milieu au sang frais, au sang cuit)

Les milieux sont soit liquides (bouillons), soit solides (géloses). On utilise fréquemment la
gélose ou agar-agar un polymère de sucre tiré d'une algue rouge. Elle ne constitue qu'un support
du milieu de culture. Capable d'absorber 200 à 250 fois son poids d'eau, la gélose forme une gelée
qui se liquéfie à 65-70° en refroidissant, cette gelée demeure en surfusion jusqu'à 40-45° et prend
une masse aux températures inférieures. La gélose est généralement incorporée aux milieux
liquides à la dose de 10 à 20%.

Les milieux solides présentent un grand intérêt en Microbiologie. Ils permettent, lorsque la
technique d'ensemencement est convenable, le développement des germes en colonies apparentes,
isolées les unes des autres, provenant en principe, de la multiplication d'un seul germe (clone) et à
partir desquelles peuvent être obtenues des cultures pures.

Mode opératoire

Matériels :

- 3 béchers de 500 ml, thermomètre, agitateur, bec bunsen, trépied et sa grille, boites de pétri, des
tubes à vis ou cotonnés stériles, pince en bois ou gants.

Produits :

- Bouillons nutritif (BN) et Géloses Nutritives (GN) du PCA et de Mc Conkey, en poudre,

- Eau distillée,

Protocole :

- Peser la masse nécessaire de poudre GN pour 250 ml d'eau distillée (tel que décrit sur le
protocole inscrit sur le contenant) ;

- Dissoudre la poudre dans le diluant à l'aide de l'agitateur ;

- Chauffer au bec bunsen jusqu'à l'ébullition ;

- Laisser refroidir la préparation dans le cône stérile du bec bunsen ;

- Lorsque la préparation a atteint une température inférieure à 60°C couler la GN dans des boites
de pétri et le BN dans des tubes à vis stériles ;

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 - Laisser refroidir jusqu’à température ambiante et solidification de la gélose puis la laisser
reposer en position retournée pendant 24h avant utilisation. Cette position évite que l’eau de
condensation dans les boîtes de Pétri perturbe la surface du milieu gélosé.
Exemples de milieux de culture microbiens
Milieu Description
Sabouraud Isolement des fungi (moisissures et
levures), son pH faible inhibe la
croissance de bactéries
Mueller- Cette gélose standardisée est la gélose
Hinton permettant de tester l'action des
antibiotiques sur les bactéries.
PCA Milieu utilisé pour le dénombrement des
standard (Plate microorganismes aérobies revivifiables.
Count Agar) C'est un milieu nutritif sans inhibiteurs,
dont l'intérêt est de favoriser le
développement à 30 °C de tous les micro-
organismes qu'on y a déposés.
Chapman Milieu sélectif des bactéries halophiles et
plus particulièrement fermentant le
(gélose au
mannitol et au sel) mannitol. Il est utilisé pour l’isolement
des Staphylococcus.
L’EMB (gélose Ce milieu sert à l'isolement des
éosine bleu de bacilles Gram négatif.
méthylène ou mili
eu de Lévine)
Drigalski Isolement
des bacilles et colibacilles Gram- de
culture facile (enterobactéries).
Hektoen milieu de culture servant à isoler
les Salmonella, Shigella, Yersinia
Mc Conkey La gélose Mac Conkey est un milieu
d’isolement ordinaire, lactosé et sélectif
des bacilles à Gram négatif non exigeants.
Isolement des bacilles Gram –
Au cétrimide
Isolement de Pseudomonas aeruginosa.
L'antiseptique cétrimide ainsi que
l'antibiotique qui est l'acide nalidixique
inhibent de très nombreuses bactéries.
Cœur-cervelle Milieu polyvalent riche utilisé pour la
recherche de la coagulase libre (enzyme
thermostable des Staphylococcus
permettant la formation de caillots de
fibrine, coagulation) et la DNAse
thermostable des Staphylococcus. Il peut
aussi servir dans la recherche
de Streptoccocus résistant,
et Enteroccocus
pH Type Caractéristiques/Microorganismes
6 Synthétique Additionné de chloramphénicol à 0,5 g/l ou
de gentamicine à 0,04 g/l, elle empêche la
croissance des bactéries
7,4 Semi- Elle peut être additionnée de sang (pour les
Synthétique Streptococcus), d'extrait globulaire (pour
Haemophilus), Elle doit être coulée en boîte
de façon à obtenir une épaisseur de 4 mm.
Il existe un bouillon équivalent.
7,0 Semi- On observe sur le milieu des colonies
Synthétique bactériennes et parfois des levures et des
moisissures. Chaque colonie provient d'une
UFC
7,4 Semi-
Micrococcaceae et quelques autres
synthétique (Bacillus, Enterococcus) et même très
rarement des bacilles gram-négatifs y sont
cultivés. Tous de caractère halophile
6,8 Synthétique Escherichia coli probable ;
Klebsiella (parfois Enterobacter) probables
Citrobacter probables
Entérobactéries
Salmonella ou Shigella probables
levures, Candida albicans probables
7,4- Semi- Les colonies sont des colonies de bacilles
7,5 Synthétique Gram - . Colonies jaunes : lactose +
Colonies vertes ou bleues : lactose –
7,6 Synthétique
E.coli, Klebsiella, Citrobacter,
Enterobacter, Serratia, P. Vulgaris, P.
mirabilis, Salmonella, Shigella, Morganella
morganii, Providencia, Pseudomonas
7,1 Synthétique colonies rouges : lactose +
colonies jaunes ou incolores : lactose -
Seuls les bacilles Gram - cultivent sur ce
milieu en raison des sels biliaires no 3
plus inhibiteurs que les no 2 et qui
permettent d'éliminer les Enterococcus.
7,1 Synthétique
L'obtention de colonies présentant une
pigmentation caractéristique bleue ou bleu-
vert et une fluorescence sous ultraviolets à
254 nm oriente vers Pseudomonas
aeruginosa.
7,4 Complexe
Utilisé uniquement pour la croissance des
bactéries, il n'a que peu d'effet sélectif.
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TP N°2 : Techniques d’ensemencement des milieux de culture
Introduction

La plupart des souches bactériennes ou fongiques peuvent être cultivées sur un milieu
solide ou liquide afin de déterminer leurs caractères culturaux. Le milieu de culture utilisé doit
satisfaire les besoins nutritifs et énergétiques de la souche à cultiver. Cependant, les germes se
trouvent souvent dans la nature sous forme de mélange de plusieurs espèces.
Isoler c'est séparer les divers micro-organismes contenus dans le prélèvement initial. Un isolement
peut être envisagé pour :
- Séparer des micro-organismes différents au sein d'un mélange (prélèvement par exemple)
- Purifier une souche contaminée ou contrôler sa pureté.
Les milieux solides coulés en boîtes de pétri sont ensemencés avec une technique
particulière d’ensemencement qui peut se faire en stries (stries parallèles, stries radiaires ou stries
en quadrant) pour l’isolement des différentes espèces microbiennes constitutives d’un échantillon
supposé pathologique, ou l’ensemencement par étalement (pour les dénombrements des
bactéries), ou encore l’ensemencement par inondation ou en masse (pour la réalisation des
antibiogrammes et autres encore…).
L'isolement peut être réalisé par épuisement de la semence en étalant le produit initial à la
surface d'un milieu solide approprié. Pendant l'incubation, chaque micro-organisme déposé se
multiplie pour donner un clone de cellules identiques. Lorsque les microorganismes déposés sont
suffisamment éloignés, le clone se développe abondamment pour produire une colonie (amas de
cellules identiques). L'objectif de l'isolement est donc d'obtenir pour chaque micro-organisme
différent des colonies distinctes. Les colonies obtenues, en étalant une souche pure, doivent toutes
présenter les mêmes caractères. A l'opposé, l'isolement d'un mélange donnera autant de colonies
différentes que de micro-organismes différents contenus dans ce mélange. Ainsi la méthode
d’ensemencement utilisée sera choisie en fonction du but recherché et donc du type d’échantillon
dont dispose le microbiologiste.
- Ensemencement par stries : un petit volume (5 à 50 L) d’inoculum est déposé en un point à
la surface du milieu gélifié et étalé en stries organisées à l’aide d’une anse de platine.
- Ensemencement en masse (de profondeur): prendre 1 mL de l’inoculum que l’on dépose en
gouttes au fond de la boîte de pétri vide et ensuite y ajouter 15 mL de gélose en surfusion
(45° C)
- Ensemencement par étalement : 100 à 500 L d’inoculum sont déposés à la surface du milieu
gélifié et étalés uniformément sur toute la surface du gel à l’aide d’une anse de platine ou
d’un étaleur (râteau).
Ensemencement et incubation
Les étudiants disposeront de deux boîtes de pétri contenant des milieux de culture
préalablement préparés et équilibrés ainsi qu’in tube contenant du bouillon. Il s’agira dans la boîte
A de la gélose de culture du milieu sélectif Mc Conkey et la boîte B contenant le milieu minimum
commun PCA. La souche bactérienne utilisée pour préparer l’inoculum sera Escherichia coli
(ATCC 11775), réactivée à partie d’une culture préexistante et cultivée sur 24 h. L’inoculum sera
préparé par dilution des colonies bactériennes dans de l’eau physiologique suivant l’indice de
turbidité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland ( 1,5 x 108 cellules/mL).
Préparation de l’inoculum bactérien

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 Pour les colonies bien séparées et d’aspects différents ou colonies distinctes, les isoler de
la façon suivante:
A l’aide d’une anse de platine stérile, prélever une colonie et la transférer dans de l’eau
physiologique dans un tube, homogénéiser et ajouter si nécessaire de l’eau physiologique suivant
l’indice 0,5 sur l’échelle de Mac Farland.
- stériliser l’anse de platine et reposer celle-ci dans le verre à pied.

Culture sur bouillon

- A l’aide d’une anse de platine stérile, prélever une colonie et la transférer dans un tube de
bouillon (maintenu ouvert et oblique autour de la flamme du bec bunsen).
- homogénéiser le bouillon par mouvement de rotation du poignet ou au vortex.

Procédure expérimentale Boîte A :

- Tracer sur le fond extérieur de la boite de Pétri (préparée à la manipulation précédente)
deux diamètres perpendiculaires séparant la boite en quatre secteurs ou quadrants
(conformément au schéma).
- Prélever à l'anse (stérile) la suspension et déposer à un coin de la boîte dans le quadrant 1.
- Avec la main gauche maintenir entrouverte la boite dans le cône stérile et étaler le
prélèvement par stries très serrées dans une moitié de quadrants (quadrant 1 et 2)
- Flamber l'anse et laisser refroidir
- Etaler à nouveau le prélèvement par stries serrées dans la moitié correspondante aux
quadrants 2 et 3.
- Flamber l'anse et laisser refroidir.
- Répéter une dernière fois l'étalement en stries serrées dans la moitié correspondante aux
quadrants 3 et 4.

Procédure expérimentale Boîte B:

- Déposer à l’aide d’une micropipette 500 L d’inoculum à la surface de la gélose et par des
mouvements circulaires de la main, faire roter la boîte jusqu’à ce que le liquide
(inoculum) ait touché tous les recoins de la surface du milieu (étalement par pseudo-
inondation), si nécessaire utiliser un étaleur (reprendre le surplus de liquide à la pipette s’il
en reste après l’étalement).

Laisser reposer les boîtes de pétri A et B pendant 5 à 10 min à la température ambiante

Porter le tube de bouillon et les boîtes de Pétri ainsi préparées à incubation en position
renversée à 37°C pendant 24 h.

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 Après incubation, observer les colonies à la surface de la gélose dans les boîtes de Pétri, et
noter quelques éléments caractéristiques tels que la taille, la forme, l’aspect de la surface,
l’opacité, la consistance, la couleur. Juger de la pureté de la culture obtenue.
Noter l’aspect de la pousse dans le milieu liquide (turbidité).

Après la manipulation, tout le matériel et les milieux souillés doivent être rassemblés dans
les récipients prévus à cet effet en vue de leur décontamination (trempage dans l’eau de javel
pendant au moins 1 h pour le matériel non recyclable ou autoclavage pour le matériel et les
milieux).

TP N°3 : Evaluation de la densité microbienne d’un échantillon par

comptage des colonies
Introduction

La numération des cellules viables après culture est une technique de référence et d’usage
courant pour l’étude de la qualité microbiologique de certains produits de croissance ou de
destruction des micro-organismes ainsi que de l’écologie microbienne. Plusieurs méthodes
permettent le dénombrement des microorganismes et peuvent être rangées en deux groupes :

- Les méthodes de culture sur milieux nutritifs ou méthodes indirectes

- Les méthodes microscopiques ou méthodes directes

Dénombrement après culture en milieu gélosé

Le dénombrement cellulaire dans une solution mère de concentration inconnue repose sur
la technique des dilutions successives et l’expérience est conduite en condition stérile sous poste
de sécurité microbien. On considère que les colonies sont dénombrables si leur nombre est
compris entre 30 et 300. Au-dessus de 300 elles sont indénombrables et en dessous de 30 on
considère qu’elles sont trop rares pour être dénombrées. On ne peut cependant pas être assuré
qu’une colonie résulte du développement d’un seul microorganisme. En effet, les amas
(agglomérats) microbiens en croissance donnent une seule colonie et plusieurs microorganismes
déposés par hasard à proximité les uns des autres peuvent également donner naissance à une seule
et même colonie. Pour cette raison, les résultats du comptage ne sont pas donnés en termes de
nombres de cellules mais plutôt en unités formant colonies (UFC). Ainsi, pour se rassurer que le
nombre d’UFC se rapproche du nombre de cellules, on procède à des dilutions du milieu initial
afin de séparer les probables amas cellulaires et individualiser les microorganismes.

Principe :
Un échantillon à analyser, étalé à la surface ou mélangé à un milieu de culture solide laisse
apparaitre après incubation des colonies sur / dans le milieu provenant de la multiplication des
microorganismes initiaux. Chaque colonie provenant théoriquement d’un seul microorganisme, on
peut à partir du nombre de colonies formées et du volume de la prise d’essai exprimer le nombre
d’unités génératrices de colonies (microbes individuels) présentes dans l’échantillon étudié.
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Trois méthodes peuvent fondamentalement être utilisées pour le dénombrement sur milieu solide.
Il s’agit de :

- L’ensemencement en profondeur (en masse) : Il consiste à mélanger l’échantillon à analyser

au milieu en surfusion à une température proche de la température de solidification (pour ne
pas risquer de tuer les microbes à la chaleur). Après incubation, les colonies qui se sont
formées dans la masse et à la surface de la gélose sont dénombrées.
- L’ensemencement en surface après filtration sur membrane : il consiste à filtrer un
échantillon de grand volume mais peu concentré en microorganismes à travers une membrane
capable de les retenir. Puis la membrane est déposée à la surface du milieu gélosé et les
colonies sont dénombrées à la surface de la membrane après incubation
- L’ensemencement par étalement en surface : il consiste à étaler l’échantillon à analyser à la
surface du milieu gélosé solidifié et à dénombrer après incubation les colonies qui se sont
formées en surface. C’est cette technique qui fera l’objet de la présente manipulation.

Matériel :

Echantillon à analyser (inoculum bactérien), boîtes de petri, tubes à essai stériles, pipettes
graduées stériles de 1 à 10 mL, portoir, poire, pipette pasteur curvée, alcool 70°, 95°, eau de javel,
gélose PCA , eau physiologique, plaque chauffante, agitateur vortex, bec bunsen, incubateur.

Méthode :

- Bien homogéniser l’échantillon à analyser pour obtenir une répartition homogène des
microorganismes à l’aide du vortex
- Réaliser les dilutions décimales de l’échantillon suivant la figure 2 ci-dessous
Pour cela il est nécessaire de poser sur un portoir 6 tubes à essai stériles vides étiquetés 10-1 à
10-6, à l’aide d’une pipette de 10 mL et en respectant les conditions de stérilité, introduire 9
mL d’eau physiologique dans chacun des tubes. A l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer 1
mL d’inoculum dans le premier tube (10-1), homogéniser au vortex, puis prélever 1 mL de ce
tube et le transférer dans le deuxième tube (10-2). Répéter l’opération pour le tube N°3 (10-3)
en y introduisant 1 mL du tube N°2. Continuer cette procédure jusqu’au tube N°6 (10-6).
N.B. Le pipetage se fait avec des pipettes stériles différentes. Toutefois, la même pipette
pourra être utilisée lors de l’ensemencement, à condition de commencer par la plus faible
dilution (10-6)

- Pipeter 200 L de chaque solution et les déposer à la surface de la gélose précédemment

coulée et solidifiée dans les boîtes de pétri,
- Plonger la pipete Pasteur curvée dans une solution d’alcool à 70° et la passer quelques
instants sous la flamme du bec bunsen puis laisser refroidir et ensuite l’utiliser pour étaler

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 chaque dépôt fait à la surface des boîtes tout en prenant soin de reprendre la stérilisation à
chaque nouvel étalement.
- Laisser reposer les différentes boîtes pendant 5 à 10 min à température ambiante
- Porter les boîtes de Pétri ainsi préparées à incubation en position renversée à 37°C pendant
24 h.
- Dénombrer les colonies formées après incubation et calculer la charge microbienne de
l’inoculum de départ.
N.B.
- Ne sont retenues pour le comptage que des boîtes dont le nombre de colonies est compris
entre 30 et 300 et la charge microbienne dans ces conditions peut être la valeur moyenne
des différentes dilutions ensemencées répondant à cette exigence, exprimée en unités
formant colonies / mL (UFC/mL).
- Les étudiants se présenteront au laboratoire pour la prise des résultats 24 h après la mise
en culture, en blouse, munis d’une caméra de bonne résolution d’image pour prendre des
photographies de chacune des dilutions de leur groupe ou sous-groupe dont ils associeront
deux de leur choix au compte rendu (les photographies devront être annotées et les figures
intitulées et munies d’une légende descriptive).
Après la manipulation, tout le matériel et les milieux souillés doivent être rassemblés dans
les récipients prévus à cet effet en vue de leur décontamination (trempage dans l’eau de javel
pendant au moins 1 h pour le matériel non recyclable ou autoclavage pour le matériel et les
milieux).

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 Fiche de compte rendu des manipulations
N.B Les étudiants rédigeront le compte rendu sur formats A4, sur un maximum de 5 pages remis
48h au plus tard après la prise des résultats dans une chemise cartonnée portant le code de l’UE
et l’intitulé du TP, les noms, prénoms, matricules, signatures, groupes et sous-groupes, date,
tranche horaire, nom de(s) encadreur(s)

I- Brève introduction + objectifs des manipulations 2 pt

II- Matériel (les étudiants donneront la liste quasi exhaustive du matériel utilisé durant les
manipulations) 1,5 pt
III- Méthode 3 pts
De façon schématique, les étudiants présenteront la méthodologie employée lors de chacune des
manipulations du jour.
IV- Résultats et discussion
Les étudiants donneront des réponses aux questions suivantes dans cette rubrique :
1- Quelle différence fondamentale y’a-t-il entre un bouillon et une gélose ? Quelle est la nécessité
de ces deux types de milieu en microbiologie ? 1 pt
2- Quel avantage présente la conception d’un milieu complexe par rapport à celle d’un milieu
synthétique, justifier l’utilisation des milieux semi-synthétiques 1,5 pt
3- Justifiez sur la base de vos résultats le choix de la technique d’ensemencement par stries (en
quadrant) durant la deuxième manipulation, par comparaison à l’ensemencement par étalement
1pt
4- Décrire, photographies à l’appui l’aspect des colonies dans les boîtes de Pétri, en notant : la
taille, la forme, l’aspect de la surface, l’opacité, la consistance, la couleur. 2,5 pts
5- La culture sur gélose a-t-elle été pure ? Sinon, relever la nature des contaminants observés. 1 pt
6- Avez-vous observé une croissance dans le bouillon cultivé ? Comparer au bouillon non
ensemencé (photo à l’appui). 1 pt
7- Calculer la charge bactérienne de l’échantillon utilisé durant la manipulation N° 3 (inoculum)
4 pts
8- En vous basant sur la valeur obtenue par calcul, dire si celle-ci confirme la justesse de l’échelle
utilisée (Mc Farland 0,5) 0,5 pt

V- Conclusion 1 pt

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