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BEKARA A Génie Biochimique M1 Biochimie appliquée

Chapitre II : Les procédés Biotechnologiques.

1. La Fermentation :

La fermentation Industrielle : désigne l’ensemble des métabolites aérobies et anaérobies issus

des micro-organismes.

1.1.Les étapes de la fermentation :

 Fabrication et stérilisation de milieu de culture
 Stérilisation du bioréacteur et ses équipements
 Préparation de l’inoculum qui représente la charge microbienne initiale
 Production en bioréacteur d’ensemencement qui permet d’optimiser les conditions
opératoires
 Transfert vers un bioréacteur de production proprement dit dont la capacité est beaucoup
plus élevé
 Séparation entre la phase la phase solide qui représente la biomasse et la phase liquide
qui contient le produit recherché
 Extraction et purification de produit recherché.

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Figure 07 : Les étapes d’un procédé de fermentation.

1.2.Les types de procédé de fermentation (Voir chapitre 4) :
 Fermentation Discontinue (Batch),
 Fermentation Semi-Continue (Fed-Batch),
 Fermentation Continue.

1.3.Types de Bioréacteurs :

Sont classés selon le volume comme suit :

Bioréacteur de laboratoire stérilisable à l’autoclavage (1-10 l)

Bioréacteur stérilisable in situ (30 L-300L) semi industriel

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Bioréacteur industriel (500.00 L)

1.4.Types de fermentation :
 Alcoolique (levures) : production d’alcool et d’éthanol.
 Homolactique (Streptococcus, lactobacillus) : production agroalimentaire (acide
lactique)
 Acétonobutylique (butyribacterium) : production des carburants
 Méthanogène : production des carburants ; traitement des eaux.

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Exemple :

Les sous-produits de sucreries : betterave et canne à sucre

Broyage

Déchets
(alimentation Séparation
des bétails)

Jus

Fermentation par
Saccharomyces (levure)

Transformation de sucre en
Ethanol

Bioéthanol

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1.5.La courbe de croissance :

La courbe donne la quantité de biomasse (X) en fonction du temps : X=F(t)

La courbe de croissance est caractérisée par 04 phases :

 Phase de latence :
Correspond à l’adaptation de l’inoculum au milieu. Ce phénomène est marqué par des
modifications de l’activité enzymatique .En effet ; le temps de latence mesure l’influence du
milieu de culture sur la croissance microbienne.

 Phase Exponentielle :

Correspond à l’augmentation de la concentration de la biomasse qui est proportionnelle au

temps et aux cellules présentes dans le milieu.

 Phase stationnaire :

Elle se traduit par un ralentissement de croissance où la division cellulaire donne une cellule
mort née sur 02 cellules. De plus, certaines bactéries prennent des formes involutives ou
dormantes. Cette phase apparue suite à la consommation des nutriments

 Phase de déclin :

Elle correspond à la lyse cellulaire dont la concentration en biomasse suive une exponentielle
décroissance. Cette phase est due à l’épuisement des nutriments et l’accumulation des déchets
bactériostatiques et bactéricides.

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Figure 08 : Courbe de croissance cellulaire.

1.6.Choix de procédés de séparation :

La séparation de produit recherché dépend de :

 Propriétés physico-chimique de molécule d’intérêt dans son environnement (taille,

hydrophobicité, charge ….)
 Qualité attendue de la biomolécules (pureté, activité)
 Coût et impacts environnementaux

2. Extraction :
C’est une opération qui consiste à séparer certains composés d’un organisme (animal, végétal
ou microbien) selon divers techniques. On trouve deux grands types d’extraction : Extraction
Liquide-Liquide, et extraction Solide-Liquide.

Intérêt : Isoler une ou plusieurs molécules à partir d’un organisme.

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2.1.Techniques d’extraction :

2.1.1. Extraction par Solvants : solubiliser les substances à extraire dans un solvant
organique : éthanol, cyclohexane, éther de pétrole ….etc.
2.2.Les étapes de l’extraction :
 Mise en contact de la substance à extraire avec le solvant.
 Décantation pour séparer la phase organique de la phase aqueuse.
 Séchage et Filtration par l’ajout d’un agent déshydratant pour récupérer la phase
organique.

Figure 09 : Extraction liquide -liquide par ampoule à décanter.

2.3.Choix de Solvant :

 État physique (Liquide),

 Miscibilité,
 Solubilité,
 Densité,
 Facile à éliminer,
 Inerte chimiquement
 Peu toxique.

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Remarque :
Il existe une panoplie de techniques d’extraction qui différent selon la nature de la substance
à extraire dont on peut citer : l’Hydrodistillation et l’entrainement à la vapeur d’eau (pour
extraire les huiles essentielles) , l’expression à froids (pour extraire les essences des agrumes),
l’enfleurage à chaud et à froids (pour extraire les absolus-production des parfums), décoction,
infusion et macération (pour extraire les principes actifs), extraction par microondes , par
sonication et par fluide supercritiques (représentes les techniques innovantes dans ce
domaine).

2.4.Extraction des protéines :

2.4.1. Méthodes enzymatiques :

Se fait par l’utilisation des enzymes qui dégradent la membrane cellulaire tout en libérant son
contenu dans le milieu. Exemple : Lysozyme (blanc d’œuf de poule) ou Lyticase (S.aureus).

Avantage :

 Technique efficace et rapide

 Rendement élevé
 Qualité améliorée de produit.

Inconvénient : Coût élevé

2.4.2. Méthode non enzymatique :

2.4.2.1. Congélation décongélation :

Des cycles de congélations (-20°C) et de décongélation (+37°C) permettent de détruire les

membranes plasmiques des cellules surtout s’il s’agit d’extraire d’une protéine ou enzyme
bactérienne. Durant la congélation les cristaux de glace formés provoquent la désintégration de
la membrane cellulaire.

Inconvénients :
 N’est pas applicable pour toutes les cellules.
 Rendement faible.

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2.4.2.2. Lyse par choc osmotique :

Cette technique consiste à incuber les cellules fragiles dans une solution hypotonique ce qui
permet à l’eau de rentrer dans la cellule qui se gonfle jusqu’à éclatement et libère ainsi son
contenu dans le milieu.

Inconvénient : technique agressive.

3. La clarification :
3.1. Généralités :

C’est un terme général qui désigne de rendre un liquide contenant des particules en suspension
limpide.

Dans le traitement des eaux : c’est l’opération qui permet de séparer par décantation l’eau des
bactéries qui forment des boues.

En agroalimentaire : c’est la transformation des fruits en jus claires par l’utilisation des
enzymes qui assurent la dépectination tout en diminuant la viscosité et améliorant la

filtrabilité. Cette viscosité est due à la présence des pectines ; pour cela on distingue :

Fruit Composition enzymes

Fruits à chair blanche Concentration élevée en Pectinases et amylases
(pomme, poires ….) amidon et en pectines
Fruits rouges (framboise, Concentration élevée en Pectinases
fraise…) pectines
Fruits tropicaux (fruits de Concentration élevée en Pectinases et cellulases
passion ….) fibres et colloïdes*
Légumes Riches en Fibres Cellulases et pectinases
Agrumes Concentration élevée en pectinases
pectines

Colloïdes : Mélange d’un liquide et des particules en suspension qui se répartissent de façon
homogène.

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3.2.Techniques de clarification :
3.2.1. Enzymatique :

C’est une technique très utilisée dans le domaine agro-alimentaire, ainsi elle se fait par
l’utilisation des enzymes qui assurent la dégradation des pectines comme :

 Des-estérification : réalisée par « la Pectinestérase », une enzyme naturellement

présente dans la pomme et le moût.
 Enzymes Dépolymérisantes : capables de couper les chaines pectiques telle que :
« polygalacturonase » et « pectine lyase » qui sont apportées par les moisissures
(pommes pourris) ou par les levures en pleine de fermentation.

3.2.2. Osmose inverse :

C’est un procédé de séparation en phase liquide par perméabilité à travers des membranes semi
sélectives sous l’effet d’un gradient de pression.

Figure 10 : Principe de l’Osmose inverse

3.2.3. Evaporation osmotique :

C’est le même principe que l’osmose normale dont la migration de l’eau se fait de milieu
le moins concentré vers le milieu le plus concentré à travers une membrane semi perméable
mais sous forme de vapeur . Cette technique permet de concentrer une solution aqueuse dans
une température ambiante et dans une pression atmosphérique.

Utilité : concentration des arômes, des vitamines ……..

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3.2.4. Electro- flottation :

Un courant électrique est appliqué sur les électrodes placées au fond de la cuve qui contient le
liquide à clarifier. Ce courant brise les molécules d’eau en deux , il se forme donc à la surface
des électrodes des minuscules bulles d’hydrogène et d’oxygène entrainant avec elles des
particules à la surface ce qui rend facile d’éliminer la croûte formée à la surface de la cuve .

Figure 11 : Principe de l’électro-flottation.

4. Purification :

C’est l’élimination des impuretés (Déchets) d’une substance donnée.

4.1.Filtration :

C’est une technique de séparation qui se fait selon le diamètre des particules solides de
différentes tailles qui sont dispersées dans un liquide. La différence de la pression force le
liquide à passer à travers le filtre alors que les particules solides restent à la surface.

02 phénomènes accompagnent la filtration :

 Le colmatage
 Adsorption
4.1.1. Types de Filtres :
4.1.1.1.Filtre d’épaisseur : retiennent les particules dans un réseau de fibres tel que :
 Papier filtre
 Textiles : gaze, coton, laine
 Les fibres : laine de verre, amiante

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 Les terres : argiles

Figure 12 : Filtres d’épaisseur

4.1.1.2.Les filtres membranaires (de surface) : sont constitués d’une fine lame ; tel que :
 Cellulose
 Acétate de cellulose
 Nitrate de cellulose
 Téflon

Figure 13 : Filtre Membranaire.

4.1.1.3.Les entonnoirs : entonnoirs ordinaires et spéciaux (BUCHNER)

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Figure 14 : entonnoir ordinaire Figure 15 : entonnoir spécial

4.1.2. Types de filtration :

 Filtration gravimétrique (lente, difficulté de récupérer la phase solide et séparation

incomplète)
 Filtration sous vide
 Filtration sous pression

Figure 16 : Filtration sous vide.

4.1.3. Ultra –filtration :
C’est la séparation des molécules en solution dans une phase dispersante à travers une
membrane de très faible porosité (25 mm).

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4.1.3.1.Application :
 Les analyses microbiologiques et tests de stérilité.
 Les analyses gravimétriques
 Isolements des cellules d’un liquide céphalo rachidien
 Les analyses de poussières
 Isolement de virus.
4.2. Centrifugation :

C’est une technique qui permet la séparation des composés d’un mélange en fonction de leur
densité sous l’action d’une force centrifuge pour obtenir deux phases : surnageant et culot.

Figure 17 : principe de la centrifugation.

4.2.1. Matériel de la centrifugation :
 Axe de rotation dans une chambre de centrifugation
 Les échantillons doivent être équilibré deux à deux ( dans le nombre et le volume)
et sont placés symétriquement par rapport à l’axe de rotation .
4.2.2. L’Ultra –centrifugation :

Les vitesses de rotation utilisées dans cette technique sont plus grandes : 75 000 tour par minute
(tpm) et permet ainsi la sédimentation des particules ultramicroscopiques.

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Figure 18 : les constituants d’une centrifugeuse.

4.2.3. Les types de centrifugeuse :

a. Selon le volume :

 Centrifugeuse de table (clinique) : 1000 à 3000 tpm ; peuvent être réfrigérées.

 Centrifugeuse au sol : 20000 tpm, permet de centrifuger des grands volumes (250 ml Х
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 Micro centrifugeuse : 150 00 tpm, pour les petits volumes

b. Selon l’axe de rotation :

 Centrifugeuse horizontale
 Centrifugeuse verticale
 Centrifugeuse oblique (les tubes sont logés dans un rotor inclinés à 45°)

4.2.4. Types de centrifugation :

4.2.4.1.Centrifugation différentielle :

Elle se base sur la différence de vitesse de sédimentation entre les particules qui différent selon
la densité et les dimensions. La séparation se fait à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation
à accélération croissante.

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Exemple : Isolement des organites cellulaire.

Constituant cellulaire Conditions de sédimentation

Noyau 500tours/ 10 minutes
Mitochondrie, lysosomes, peroxysomes 5000 tours / minutes
Réticulum endoplasmique ; appareil de Golgi 10 000 tours / 1heure

Figure 19 : Centrifugation différentielle.

4.2.4.2. Centrifugation en gradient de densité :

La sédimentation se fait par un gradient de densité ainsi la différence entre la densité de la

particule et celle du solvant constitue l’un des facteurs influençant la vitesse de sédimentation.

Plus la vitesse de densité est grande, plus la sédimentation est

rapide

On distingue trois cas :

 Si la particule est moins dense que le milieu, elle s’élève et flotte à la surface
 Si la particule est plus dense que le milieu, elle se sédimente au fond de tube
 Si la particule et le milieu ont la même densité, aucune sédimentation n’est observée
quel que soit la vitesse de rotation.

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Figure 20 : principe de la centrifugation en gradient de densité

4.3.Electrodialyse :
Est un procédé de séparation des ions d’un liquide placé entre deux membranes semi –
perméable en présence d’un champ électrique. Ces membranes sont soit cationiques qui
retiennent les anions (-) ou bien anioniques qui retiennent les cations (+)

L’application d’un champ électrique entre les deux électrodes plongées dans une solution salée,
les membranes cationiques s’opposent aux anions ainsi celles anioniques s’opposent aux
cations ; ce qui permet d’obtenir une eau purifié (sans Na+, Cl- …….).

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Figure 22 : Principe de l’électrodialyse.

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