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: Isolement et purification
d’entérobactérie à partir d’un échantillon
de sol
Microflore de sol : contient des bactéries, archaebactéries, champignons (levures & moisissures),
algues et protozoaires.
L’isolement : consiste à réaliser à partir d’un échantillon des suspensions-dilutions. Ces dernières sont
ensemencées sur milieu de culture solide. Au terme d’incubation, les germes contenus dans le sol
seront développés. Chaque germe sera à l’origine d’une colonie, le comptage des colonies permet par
méthode de calcul simple d’estimer la quantité de germes contenue dans le sol étudié.
L’utilisation d’un milieu sélectif comme le milieu EMB permettra le criblage des bactéries à G-
présentes dans l’échantillon de sol, leur isolement, et leur purification.
Isoler : sélectionner (choisir, mettre à part) un microorganisme pour faire une étude (recherche).
Milieu EMB :
Milieu GN (incliné):
- Milieu standard.
- Favorable pour tous les microorganismes.
- Il va servir à une multiplication non sélective des bactéries.
Entérobactérie : AAF, Gram -, bacille, mobile, catalase+, oxydase -.
Galerie : Ensemble de tests. Composé d’une série de tubes contenant chacun milieu spécifique.
L’utilisation de chaque milieu est destinée à établir l’existence ou non d’un métabolisme.
Les milieux :
Liquide : bouillon nitraté, Clark et Lubs, urée Indole, gélose nutritif.
Solide : gélatinase, TSI, Citrate de Simmons, mannitol mobilité.
Pour ensemencer un milieu liquide :
- Pipette pasteur à bout effilé (prendre un volume) (pas boutonné).
- Anse de platine avec boucle (prendre une goutte).
Pour ensemencer un milieu gélose :
- Incliné avec culot : anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout boutonné, piqûre
centrale.
- Incliné sans culot (que la pente) : anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout
boutonné ou serré.
- Non incliné (que le culot): anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout boutonné ou
serré. Piqûre centrale.
Métabolisme énergétique :
- Recherche de catalase :
Bulles : présence du catalase, dégradation de peroxyde d’oxygène en eau + oxygène.
- Recherche de l’oxydase : en disque
couleur violette : présence de cytochrome oxydase.
- Recherche de Nitrate réductase (bouillon nitraté): si négatif on ajoute la poudre du Zinc
couleur rose ou rouge : la bactérie réduit les nitrates en nitrite, NIT1,NIT2. Si incolore, la
bactérie réduit les nitrites jusqu’au stade azote gazeux
Métabolisme glucidique :
Métabolisme protéique :
Gélatine : substance complexe azotée, isomère de l’osséine, extraite des os, des cartilages. La gélatine
nutritive est un milieu de culture utilisé pour la recherche de la gélatinase
Gélatinase : reste liquide, gélatine hydrolysée par gélatinase : +
Uréase : rouge : +
jaune : -
Trp : donne Indole
Indole+kovacs : rouge +
jaune -
TDA : brune : +
Jaune : - : pas de production de TDA