TP 1/Analyse microbiologique des eaux /Boissons gazeuses et Jus Responsable de la matière : Dr. MEDJOUDJ H. (M.C.

Université d’Oum-El-Bouaghi Filière : Microbiologie Appliquée Master 1

Faculté des Sciences Exactes et Sciences de la Nature et de la Vie Matière : MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
Département des Sciences de la Nature et de la Vie (Année 2014/2015)

TP N°1/Analyse microbiologique des eaux /Boissons gazeuses et Jus

Introduction
Outre les problèmes reliés à la composition de l’eau, plusieurs problèmes sont causés par une contamination microbienne.
Les essais sont déterminés en fonction de la situation.

I-Prélèvement
Le prélèvement d’échantillons d’eau doit se faire en utilisant des bouteilles stériles fournies par le Laboratoire. Toutes les
précautions doivent être prises pour éviter leur contamination et celle de l’échantillon. La nature des flacons utilisés doit être
en verre ou des flacons à usage unique. Leur stérilisation se fait soit par la chaleur, à l’oxyde d’éthylène ou par les rayons
gamma. Faire le contrôle de stérilité et stérilisation à l’extérieure. Doter les flacons de prélèvement de neutralisants ; le
thiosulfate de sodium (pastilles) ou par l’EDTA (Ethylène Diamine Tetra-Acétique).

Pour la recherche de bactéries pathogènes (exemples : Salmonella, Yersinia, Campylobacter), se procurer un contenant stérile
de quatre litres. D’autres situations peuvent exiger un volume d’échantillonnage plus important (exemples : parasites et
virus).
Sur l’étiquette des contenants la lettre « T » apparaît, puisque chaque bouteille contient du thiosulfate de sodium, un agent
neutralisant de tout désinfectant résiduel de l’eau traitée. Ces contenants sont aussi utilisés pour l’eau non traitée. Sur
chaque bouteille, une étiquette indique la date limite d’utilisation (expiration), le numéro de la demande d’analyse, la date
de prélèvement et le numéro de prélèvement.

Note : Pour les interventions effectuées dans le cadre de toxi-infections alimentaires, lorsqu’il n’y a pas de bouteilles stériles
de disponibles, utiliser des sacs stériles, en utilisant deux sacs pour remplacer une bouteille. Pour les contenants de quatre
litres (recherche de pathogènes).

II- Analyse microbiologique

1/Dilutions
Préparation d’une série de dilution d’eau peptonée ou dans l’eau physiologique (10 -1-10-2).

2/Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile (FTAM)

Ensemencement dans la masse de la Gélose Nutritive par 1mL de la solution mère et des dilutions 10 -1 à10-2. Incubation à
37°C pendant 24-48h. Dénombrer les boites qui contiennent entre 15 et 300 colonies.

3/ Dénombrement des Coliformes totaux et fécaux (E. coli)

Coliformes totaux (Test présomptif) : Ensemencer dans une série de 3 tubes de BCPL (Bouillon lactosé au pourpre de
Bromocrésol) à partir de la solution mère avec 10mL dans les 3 premiers de BCPL D/C (double concentré) ; 1mL dans la 2ème
série de 3 tubes BCPL S/C (simple concentré) et la dernière série des 3 tubes BCPL S/C (simple concentré) est inoculée avec
0,1mL. Mélanger par retournement et chasser l’air de la cloche de Durham. Incubation à 37°C/ 24-48h.
Lecture : les tubes considérés positifs sont ceux qui présentent un trouble microbien+ virage du milieu au jaune et présence
de gaz d’au moins le 1/10ème de la cloche.
Coliformes fécaux (Test de confirmation) : A partir des tubes positifs ensemencer 0,5mL dans un autre tube de BCPL quelques
gouttes à 0,1mL dans un tube d’eau peptonée exempte d’indole(EPEI). Incubation à 44°C/ 24h.
Lecture : le BCPL doit présenter les mêmes résultats que dans le test présomptif (gaz+trouble+virage du milieu).Dans l’EPEI,
ajouter quelques gouttes de réactif de Kovacs, la production d’indole se manifeste par la présence d’un anneau rouge à la
surface du milieu. On confirme la présence des coliformes thermo tolérant et de E. coli si indole+.

4/Streptocoques fécaux
Test de présomption : Ensemencer dans une série de 3 tubes de Bouillon de Rothe à partir de la solution mère ,10mL dans les
3 1ers tubes de Rothe D/C, 1mL dans la 2ème série de 3 tubes S/C et avec 0,1mL dans la dernière série de 3 tubes S/C.
Incubation à 37°C /24-48h.
Lecture : les tubes positifs se manifestent par un trouble du milieu du au développement microbien.
1
 TP 1/Analyse microbiologique des eaux /Boissons gazeuses et Jus Responsable de la matière : Dr. MEDJOUDJ H. (M.C.)

Le test de confirmation se fait par ensemencement à partir des tubes positifs de Rothe avec 0,5 mL dans le bouillon d’EVA
LITSKY (bouillon à l’éthyle Violet et à l’Azide de sodium), incubation à 37°C/24h. La présence de streptocoques fécaux se
manifeste par un trouble du milieu et présence d’une pastille violette au fond du tube.

5/ Dénombrement des Clostridiums sulfito-réducteurs :

Introduire dans un tube stérile 5 mL de la solution mère et porter dans un Bain Marie à 80°C pendant 10 à 15min ( pour
permettre la destruction des formes végétatives), ensuite refroidir immédiatement sous jet d’eau. Ajouter 15mL de la gélose
VF (Viande-Foie) à la solution mère et mélanger par retournement délicatement ensuite laisser refroidir sur la paillasse
jusqu’à solidification. Incubation à 37°C/ 24h-72h.
Les colonies de CSR apparaissent noires dans la gélose.

6/ Recherche des Salmonelles :

Inoculer le bouillon SFB (Bouillon au sélénite de sodium) à partir de la solution mère ou des dilutions par 1mL, incuber à 37°C
pendant 24 à 48h.
Après incubation, si le bouillon vire à la couleur rouge brique, on considère que le tube est positif et qu’il y’a présomption de
présence de salmonelle. On isole par stries sur un milieu gélosé approprié SS, DCLS ou Hektoen à partir du tube qui a viré au
rouge brique. Incubation à 37°C pendant 24h.
Les colonies de salmonelles sont transparentes ou transparentes avec centre noir.

III. Définition d’une eau potable

Toute eau, pour être considérée comme potable, doit satisfaire aux conditions bactériologiques définies par les normes
relatives aux spécifications microbiologiques de certaines denrées alimentaires. Les limites de qualité microbiologique des
eaux destinées à la consommation humaine sont les suivantes :
1) l’eau ne doit pas contenir de germes pathogènes ou de parasites
2) Les limites d’acceptabilité sont de :
• 0 Salmonella dans 5 litres
• 0 coliforme thermotolérant dans 100 ml
• 0 streptocoque fécal dans 50 ml
• 95 % au moins des échantillons prélevés ne doivent pas contenir de coliformes /100 ml
• pas plus d’une spore de bactéries anaérobies sulfito-réductrices / 20 ml <5

Lorsque les eaux sont livrées sous forme conditionnée, le nombre de germes aérobies mésophiles revivifiables ne doit
pas dépasser 20 et 100 UFC/ml respectivement après incubation à 37°C / 24 heures et 22 °C / 72 heures.
L’eau destinée à la boisson, conservée et livrée en bouteilles ou autres récipients, doit présenter les mêmes autres critères
que les eaux non traitées. L’analyse doit être réalisée dans les 12 heures suivant le conditionnement.
Les exigences de qualité des eaux douces superficielles destinées à produire de l’eau potable sont fonction des types de
traitements qu’elle subira.
en UFC ou UFT / 100 ml
A1 A2 A3
Coliformes totaux (37°C 24h) 50 5000 50000
Coliformes thermotolérants 20 2000 20000
Streptocoques fécaux 20 1000 10000
Salmonelles dans 5000 ml 0 0 0

A1 : traitement physique simple et désinfection

A2 : traitement normal physique, chimique et désinfection
A3 : traitement physique, chimique poussé, affinage et désinfection