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Electrophorèse.

Aspect théorique
L'électrophorèse est une technique d'analyse et de séparation basée sur les critères de la
charge électrique et la taille des molécules. La migration différentielle de particules
chargées électriquement, se fait sous l'influence d'un champs électrique. Seules les
particules chargéespositivement ou négativement sont attirées par les pôles opposés du
champs électrique. Les composés qui peuvent être transformés en particules chargées
par formation de complexes, sont de même sujets à une migration sous l'effet du champs
électrique. Parmi les supports utilisés dans la techniqueHYPERLINK "../QCM-
electrophorese.html" d'électrophorèse, on note le gel de polyacrylamide donnant de
bonnes résolutions lors de la séparation.

- QCM-électrophorèse (aspects techniques)

- QCM-électrophorèse. Supports de migration

Exercice sur la séparation des protéines

Supports pédagogiques takween

Déplacement électrophorétique.
Sous l'action d'un champs électrique, E, une protéine se déplace avec une vitesse, v,
proportionnelle au champs:

v = µ E, avec µ appelée 'mobilité électrophorétique' µ = v / E (1) avec : µ en cm2.s-1.volt-1, v


en cm.s-1 et E en volt.cm-1
Le champs électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une protéine que l'on
suppose sphérique et de charge q; F =qE
Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (eta) vont s'opposer à la migration de la protéine
et la freiner;
Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champs uniforme dépend de 3 facteurs : q, (eta)
et r.

*Elle est proportionnelle à sa charge (q).

*Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu , (eta)

*Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

La réalisation de l'électrophorèse nécessite 3 composantes principales: 1/ Cuve


d'électrophorèse qui porte le support de migration, 2/ Générateur de courant électrique
continu et une cuve de révélation des produits séparés.
Electrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide.
Ce type d'électrophorèse peut être réalisé en utilisant des systèmes tampons dissociant ou non
dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le plus utilisé est le détergent anionique;
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Une fois fixé sur les protéines (à chaud) le SDS affecte une
charge négative (-) à tous les polypeptides. Ces derniers migreront, donc, dans le gel de
polyacrylamide selon leur taille, uniquement. Ainsi, l'experimentateur peut déterminer le poids
moléculaire (PM) des différents polypeptides en se référant à la mobilité de polypeptides de PM
connus (marqueurs de PM).Le système tampon non dissociant est recommandé pour
l'électrophorèse de protéines natives, où l'interaction subunitaire, la conformation et l'activité
biologique des protéines doivent être préservées. Dans ce cas, la séparation se fait sur la base
de la charge et de la taille.Les systèmes tampons discontinus (multiphasiques) utilisent différents
tampons à des Ph différents.

Exemple de systèmes tampon discontinus : le système d'Ornstein.

L'utilisation de tampons discontinus dans leur pH et la nature des ions, permet la concentration
préalable de l'échantillon à séparer. Les gels de polyacrylamide répondant à cette condition,
présentent 2 types de structures:
- Un gel de concentration (stacking gel).- Un gel de séparation (resolving gel).
L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de concentrations en
polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations différentes :

- Elimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le cas des gels très
concentrés.

- Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le front.

Entre ces 2 extrêmes, les protéines peuvent être résolues différemment selon la concentration en
polyacrylamide du gel de séparation:

(Polyacrylamide) (%) Poids moléculaire (Kd)

15-20 10-40

10-15 40-100

5-10 100-300

5 300-500

2-5 PM>500

Révélation des protéines séparées par électrophorèse


Révélation des protéines par coloration sur gel
Lorsqu'il s'agit des protéines, celles ci sont généralement incolores. Leur visualisation sur les
supports d'électrophorèse s'effectue par des procédés histochimiques qui permettent de colorer
les produits de dénaturation de la protéine ou une partie chimique qui lui est associée. Exemples:
coloration au bleu de coomassie et coloration par nitrate d'argent.

Révélation des protéines par mise en évidence d'une activité biologique


(catalyse enzymatique)
Lorsque les protéines sont de nature enzymatique, la révélation peut être faite sur le gel par
addition des substrats spécifiques d'une telle ou telle enzyme. Des exemples de gels révélés au
laboratoire pour la détection du polymorphisme enzymatique (activité biologique) sont expliqués
dans la partie pratique (voir TP isoenzymes).

‫( الستظهار‬Révélation).
‫ فإنها غالبا تلون‬،‫ فيما يخص البروتينات‬.‫تختلف طرق استظهار مواد الفرز فوق وسط العزل حسب أنواع الجزيئات‬
‫ تستظهر الحماض النووية فوق وسط العزل‬.‫بالملون أزق كوماسي الذي يلتصق خصيصا بكل ما هو بروتين‬
‫بإضافة المادة الكيميائية بروميد اليتيديوم التي تتعرف عليه عند تسليط أشعة بنفسجية على المعقد تظهر للعين في‬
‫ يعطي الرسم التالي توضيحات إيضافية في استظهار البروتينات و الحماض‬.‫الظلم أطراف الحمض النووي‬
‫النووية بعد نهاية عزلهم بتقنية الكهروتهجير‬
Electrophorese non dénaturante sur gel de polyacrylamide (vidéo):

Extraction et Révélation des isoenzymes (vidéo)

Révélation des protéines par immunodétection


La révélation in situ sur gel des protéines par réaction antigène-anticorps est coûteuse, car les
protéines séparées restent " emprisonnées " dans le gel. Pour diminuer les quantités les coûts
d'anticorps à ajouter pour révéler les protéines, il faut éluer les protéines du gel.
Transfert des protéines préalablement séparées sur gel, sur membrane
(western blotting)
Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un nouveau support
(exemple: membrane de nitrocellulose). La formation de l'empreinte se dit blot en anglais d'où le
nom western blot, western n'est qu'un mot en rapport avec la technique initiale du Southern blot
conernant le transfert de l'ADN sur membrane de nitrocellulose ou nylon (technique inventée par
Southern).

‫ يصبح إلزامي نقل محتويات وسط العزل )بروتينات أو أحماض نووية( إلى وسط من نوع آخر‬،‫في حالت إستثنائية‬
‫ من أجل اكتشاف البروتينات بالجسام المضادة‬،‫ مثل‬.‫( للتمكن من اكتشافهم‬Anticorps)، ‫( يتم نقلهم من الهلم‬Gel)
‫( إلى غشاء مصنوع من النيتروسيليوز‬Nitrocellulose). ‫ ووضع مجموعة من‬،‫يتم وضع هذا الغشاء فوق الهلم‬
‫ جالبًا‬،‫ ثم يتم وضع الطبقات كلها في محلول يقوم بالتنقل إلى العلى عبر الوراق‬.‫طبقات أوراق الترشيح فوق ذلك‬
‫ تسمى هذه الطيقة ب التلطيخ الغربي )بالنجليزية‬.‫البروتينات معه إلى الغشاء‬: Western blotting).

Animations: Transfert du dna. Southern Blotting


'Southern Blotting', développée par Edwin Southern, est une techniques permettant d'identifier
l'ADN ayant une séquence nucléotidique précise.

Electrophorèse. Aspects techniques (voir QCM 1, QCM 2 )


Effet de la composition ionique des tampons sur la séparation électrophorétique.
1/ Les tampons à faible force ionique entraînent a/ une migration rapide (donc diffusion faible), b/
un chauffage faible, c/ bandes moins résolues.
2/ Les tampons à force ionique élevée entraînent a/ une migration faible (donc diffusion élevée),
b/ un chauffage élevé, c/ bandes plus résolues.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel
inférieureà celle du tampon d'électrodes.
Les systèmes tampons sont choisis de façon à avoir une force ionique du tampon du gel
inférieure à celle du tampon d'électrodes.
Les PI de la plupart des protéines se situent entre pH 4,0 et 7,0. Donc, les tampons à pH compris
entre 8 et 9,5 sont souvent utilisés lors de l'électrophorèse des protéines.
Effet du mode de séparation ''voltage (V) constant' ou 'Intensité (I) constante':
Séparation à V constant: Si R augmente, I diminuera (car V = Rx I). Ceci entraîne dinimution du
chauffage (lié à la puissance (P); P = I x I x R).
Séparation àI constante: la mobilité reste constante. Si R augmente, le chauffage augmentera (P
augmente