BIO 304 : TECHNIQUES BIOCHIMIQUES II : ELECTROPHORESE_Avril 2022

Pr. EWANE Cécile Annie

OBJECTIFS DU COURS
- Présenter le principe et les différentes techniques permettant de
réaliser une électrophorèse, ainsi que leurs applications (ADN,
protéines ...), leurs intérêt et limites (I & II).
- Maitriser les méthodes physiques de séparation et d'analyse, et les
méthodes de dosage des biomolécules (III, IV & V).

I. PRINCIPE ET SUPPORT DE MIGRATION

Définition :
L'électrophorèse est une technique d'analyse (identification et dosage) et de
fractionnement (séparation) basée sur la migration différentielle de particules
chargées électriquement sous l'influence d’un champ électrique.
La charge électrique et la taille des molécules sont deux critères essentiels en
électrophorèse.

I.1- PRINCIPE
L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers
d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.
Seules les particules chargées positivement ou négativement sont attirées par
les pôles opposés du champ électrique. Les composés qui peuvent être
transformés en particules chargées par formation de complexes, sont de
mêmes sujets à une migration sous l'effet du champ électrique. Parmi les
supports utilisés dans la technique d'électrophorèse, on note le gel de
polyacrylamide donnant de bonnes résolutions lors de la séparation.

Les molécules chargées migrent vers leur électrode respective : celles qui sont
chargées négativement (les anions) migrent vers l'anode ; celles qui sont
chargées positivement (les cations) migrent vers la cathode ; celles qui ne sont
pas chargées (neutres) ne migrent évidemment pas.
On peut caractériser la migration par la vitesse à laquelle la molécule se
déplace et la distance qu'elle parcourt. Ces deux facteurs s'influencent
évidemment un l'autre.

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Cette technique permet, entre autres, de :
• déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer
leur masse molaire respective ;
• d'évaluer le degré de purification d'une protéine ;
• de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western
blot (réaction avec un ou des anticorps) ;
• de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de
départ en protéomique), selon 2 paramètres : point isoélectrique
(isofocalisation) puis masse molaire ;
• de séquencer l'ADN ;
• de déterminer la taille de fragments d'ADN ;
• de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du
Northen blot (ARN) ou du Southern blot(ADN) ;
• d'établir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction)
de fragments d'ADN ;
• …

I.1.1- Déplacement électrophorétique

Sous l'action d'un champ électrique, E, une protéine se déplace avec une
vitesse, v, proportionnelle au champ :
v = µ E,
avec µ appelée 'mobilité électrophorétique'

µ = v / E (1)
avec : µ en cm2.s-1.volt-1,
v en cm.s-1 et
E en volt.cm-1
Le champ électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une
protéine que l'on suppose sphérique et de charge nette q.
La protéine subit une force de Coulomb égale à :
F=qE
Les forces de frottement, F', dues à la viscosité du milieu (h ) vont s'opposer à
la migration de la protéine et la freiner.

Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champ uniforme dépend de

3 facteurs :
- La charge nette de la protéine q.
- Le coefficient de viscosité h .
- Le rayon de la protéine (sphérique) r.

Ainsi la mobilité répond aux règles :

- Elle est proportionnelle à sa charge (q).
- Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu.
- Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

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I.1.2- Migration et caractéristiques des molécules

- La charge des molécules est la caractéristique fondamentale de la

migration électrophorétique. Elle détermine la direction d'après sa
polarité, vers l'anode ou la cathode, et la vitesse, donc la distance de
migration proportionnellement à la densité de la charge.
- La taille des molécules a une certaine influence, particulièrement dans
le cas où les molécules passent à travers une matrice poreuse. Plus la
taille des molécules est petite, relativement à celles des pores, plus les
molécules se déplaceront facilement, ce qui implique évidemment
qu'elles migreront rapidement.
- L'affinité des molécules pour la matrice affecte la migration. Plus
l'affinité est grande, moins la molécule migre vite et loin, parce qu'elle
est retardée.

I.1.3- Types d'électrophorèse selon le sens de migration

Il existe deux types d’électrophorèse selon le sens de migration :
- Électrophorèse horizontale.
- Électrophorèse verticale.
La réalisation de l'électrophorèse nécessite 3 composantes principales :
1- Cuve d'électrophorèse qui porte le support de migration.
2- Générateur de courant électrique continu.
3- Cuve de révélation des produits séparés.

I.1.4- Types d'électrophorèse selon la nature des particules chargées

Il existe trois types d’électrophorèse selon la nature des particules chargées
- Ionophorèse : utilisé dans le cas d'ions de petite taille.
- Électrophorèse proprement dite.
- Cataphorèse.

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I.2- SUPPORT DE MIGRATION
Il existe deux types d’électrophorèse :
- Électrophorèse libre (en veine liquide).
- Électrophorèse de zones (sur papier, sur acétate de cellulose, sur
gel d’amidon, sur gel d’agarose, sur gel de polyacrylamide).

Les principales applications utilisent un support poreux stabilisant la phase

liquide : on parle alors d'électrophorèse sur support ou d'électrophorèse de
zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et
imprégné de tampon (papier, dérivés de cellulose, polyoside « agarose »,
polyacrylamide ...).

I.2.1- Caractéristiques et types de support de migration

Le support doit être homogène, poreux et inerte. Cependant, la condition
d'inertie n'est jamais respectée et le support joue un rôle plus ou moins
important dans la séparation.
Sur papier et acétate de cellulose, la migration s’effectue en surface de
la bande de papier ou d’acétate de cellulose (qui présente une pellicule
de solution tampon).
Sur gels d’agarose et de polyacrylamide, la migration s’effectue dans
l’épaisseur des gels.

Le choix du support est dicté par la nature des molécules à séparer.

Les gels formant un maillage tridimensionnel, les molécules doivent donc
progresser dans les pores.
Ainsi, plus les molécules seront encombrantes, plus leur progression sera difficile
(lente). A l’inverse, des molécules très petites, ne seront pratiquement pas
freinées, et peuvent mal séparées.

En fonction de la taille des pores, on peut donc efficacement séparer des

molécules situées dans une fourchette approximative de masses moléculaires.

On peut adapter la réticulation du gel à l’échantillon à traiter en choisissant la

concentration du produit. Cela suppose d’avoir une idée de la nature des
molécules que l’on souhaite séparer.
Dans le cas contraire, on peut faire plusieurs gels différents ou faire un gel
présentant un gradient de concentration.

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Les supports utilisés en électrophorèse sont nombreux, avec des degrés de
résolution variables.

La matrice d'une électrophorèse est le support physique sur lequel ou dans

lequel l'échantillon sera déposé et ses molécules migreront. Cette matrice
peut soit, être fabriquée d'avance et utilisée telle quelle, soit faite
immédiatement avant usage. Il y a plusieurs types de matrices qui diffèrent
au niveau de leur constitution (matériel avec lequel elles sont faites), du
type de montage dans lequel elles sont utilisées et leurs caractéristiques
physico-chimiques.

Papier : Habituellement employé dans un montage horizontal, plus

rarement vertical, il servait surtout à séparer des acides aminés ou d'autres
petites molécules chargées.

Acétate de cellulose : Il s'agit d'un dérivé acétate d'une forme purifiée de

cellulose. Elle se présente sous la forme d'une mince et fragile feuille. Le
dépôt et la migration se font en surface sur un montage horizontal. On s'en
sert beaucoup pour séparer grossièrement des protéines.

Polyacrylamide : On peut polymériser l'acrylamide entre deux plaques de

verre ou à l'intérieur de tubes cylindriques de verre, où il formera un gel
poreux. On dépose l'échantillon sur le sommet du gel de polyacrylamide,
maintenu vertical. Les molécules pourront alors migrer à l'intérieur de ce
gel. Cette matrice électriquement inerte n'entrave pas la migration,
permettant donc des séparations de haute résolution.

Agarose : Cette substance très hydrophile peut même à très basse

concentration, de l'ordre de 1%, former des gels solides mais très poreux.
L'agarose ne polymérise pas par création de liens covalents, il se gélifie à
basse température. Cette gélification est due à la formation d'une
multitude de liens hydrogène entre les longues molécules linéaires de
dextran qui composent l'agarose. Sa faible adhésion au verre oblige
généralement à étaler ce gel sur une plaque de verre maintenue
horizontale.

Amidon : Rarement employée de nos jours, cette matrice forme un gel

poreux. Les gels d'amidon servaient à séparer les protéines destinées à des
colorations enzymatiques.

Les types de support ont permis de distinguer plusieurs appellations en

électrophorèse, comme :
- Électrophorèse en veine liquide

- Électrophorèse sur papier

- Électrophorèse sur gels (agarose, amidon, polyacrylamide ...).

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I.2.2- Formation des gels de polyacrylamide
Les gels de polyacrylamides sont au départ des solutions liquides constituées
d'un mélange d'acrylamide et du bis acrylamide (N,N'-méthylène-
bisacrylamide) qui réagissent entre eux pour former un gel réticulé suite au
déclenchement d'une réaction de polymérisation initiée par
le persulphate (fourni par le persulfate d'ammonium) et le TEMED (N,N,N',N'-
tétraméthyléthylènediamine). Le persulfate génère en présence du TEMED
le radical sulfate.
L'acrylamide (A) possédant une double liaison entre deux carbones, constitue
une cible privilégiée pour le radical sulfate. Il en résulte une molécule
d'acrylamide forme radical libre (A.). Celle-ci attaque à son tour une deuxième
molécule d'acrylamide, pour donner un nouveau radical libre. Les radicaux
libres du polyacrylamide peuvent régir entre eux pour donner des polymères
d'acrylamide ou polyacrylamide (A-A-An) qui est une chaîne linéaire de forme
liquide et visqueuse. Pour arriver à un support d'électrophorèse sous forme de
gel solide facile à manipuler, il devient nécessaire de faire appel à un agent
réticulant (cross linker).
Le bisacrylamide (équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un
groupement méthyl), possédant deux sites d'attaque radicalaire (2 doubles
liaisons entre atomes de carbone), constitue un agent de réticulation de choix.
Ainsi, Il permet la formation de ponts entre les molécules d'acrylamide. Les gels
obtenus ainsi sont caractérisés par un degré de réticulation bien précis
(dépendant du pourcentage du bisacrylamide).
Le pourcentage C de Bis par rapport à l'acrylamide est :
C = [poids (Bis)/ poids(acrylamide+Bis)]x 100.

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7
I.2.3- Révélation des molécules séparées par électrophorèse
Les molécules séparées par électrophorèse doivent être révélées par
coloration ou traitements appropriés pour les rendre visibles, afin qu'elles
puissent être détectées.
La méthode de révélation dépend de la nature des molécules à mettre en
évidence.

NB : Il faut rapidement stabiliser l’emplacement des molécules.

- On peut fixer les molécules sur leur support en plongeant le gel dans une
solution contenant un mélange de méthanol et d’acide acétique, qui va
dénaturer définitivement les protéines et de les fixer au support.
- On peut déshydrater le gel pour une conservation de longue durée.
- On peut également transférer les molécules sur un autre support sur lequel
elles se fixeront fortement. C’est ce que l’on appelle un blot.

Ce second support est une membrane de nitrocellulose. Une fois les molécules
transférées, on peut leur faire subir différents traitements, ce qui n’entraînera
pas leur décrochage.

La méthode la plus classique pour l’ADN est d’utiliser un agent intercalant

fluorescent tel que le bromure d’éthidium.
Cette molécule plate va s’intercaler entre les bases des nucléotides.
Lorsqu’on éclaire cette molécule avec des UV à courtes longueurs d’ondes
(autour de 300 nm), elle réémet de la lumière visible rouge orangée. On
peut observer directement la lumière produite ou faire une photographie.

NB : Il faut utiliser des protections adaptées lors de cette révélation. Les

méthodes chimiques utilisant des colorants sont moins utilisées car ils sont
moins sensibles.

Il existe une multitude de façons pour révéler les protéines.

- La plus simple est d’utiliser un colorant, le bleu de Coomassie, avant de
déshydrater le gel. La technique est très simple mais sa sensibilité reste
modeste.
- On peut utiliser une coloration beaucoup plus sensible au nitrate d’argent,
mais cette méthode est plus longue et complexe à mettre en œuvre.
- Après transfert sur membrane de nitrocellulose on peut utiliser des
méthodes indirectes basées sur la reconnaissance spécifique antigène-
anticorps. On parle alors d’immunoblot.
- On peut faire une autoradiographie dans le cas de présence des
molécules comportant des atomes radioactifs.

NB : Il existe de nombreuses autres méthodes disponibles en fonction des

particularités des molécules étudiées.

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 II. TECHNIQUES ELECTROPHORETIQUES

II.1- Rappel
L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones permet de stabiliser
la phase liquide grâce à l’utilisation d’un support poreux imprégné d'un solvant
tamponné. Le support doit être homogène, poreux et inerte.
On peut procéder sur :
- bande (papier, acétate de cellulose),
- lame ou en tube (gels)
Principes de la migration électrophorétique : la migration dépend de plusieurs
facteurs :
- la mobilité électrophorétique U ;
- du champ électrique E ;
- des courants liquidiens ;
- de la durée de migration ;
- de facteurs liés à la nature du support.

II.2- Applications des techniques électrophorétiques

L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines,
peptides, acides aminés, acides nucléiques et nucléotides. Elle permet dans
certaines conditions de séparer des molécules non ioniques, comme des
hormones stéroïdes par exemple.

II.2.1- Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose

La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau, Amido-
schwartz, vert de lissamine, bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des
lipoprotéines avec un colorant des lipides, révélation d'une activité
enzymatique ...).
La lecture peut se faire à l'oeil nu ou par densitométrie ; dans ce cas,
l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions ; ou encore
le dosage peut être effectué après élution des fractions.

Tracé densitométrique du protéinogramme d'un sérum humain normal.

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II.2.2- Électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE)
La polyacrylamide est un gel finement réticulé, que l'on fabrique au moment
de l'emploi en mélangeant de :
- l'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2),qui polymérise en donnant des chaînes
linéaires et
- du bis-acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CO-CH=CH2) qui forme des ponts
entre les chaînes.
On obtient ainsi un réseau, dont les mailles sont de taille variable en fonction
des proportions d'acrylamide et de bis-acrylamide utilisées.
Le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les
macromolécules migrent d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses).
En présence de Sodium dodécylsulfate (SDS) détergent anionique qui défait la
structure spatiale et se fixe sur les protéines, toutes les molécules sont chargées
de la même façon, et la séparation est alors uniquement fonction de la masse
molaire. SDS_CH3 - (CH2)10 - CH2 - O - SO3-, Na+

II.2.3- Électrolocalisation (IEF-IsoElectric Focussing)

La migration est effectuée dans un gradient de pH; chaque molécule migre
jusqu'à l'endroit où le pH est égal à son pHi. On utilise un gel de forte porosité
(polyacrylamide ou agarose), pour que la taille n'influence pas la migration. Le
gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules amphotères de
synthèse introduites dans le gel au moment de sa fabrication : on utilise un
mélange de telles molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme
(gamme large, ex. 3-9, ou ± étroite, ex. 4-5 ou 5-6,5). Ces molécules migrent
rapidement dans le gel jusqu'à atteindre une zone où leur charge devient
nulle. Elles ont alors une distribution statistique telle qu'elles génèrent un
gradient de pH sensiblement linéaire le long du gel.

L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir

une courbe de titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). On
prépare un gel dans lequel on établit le gradient de pH, puis on dépose dans
une rigole centrale la solution de protéine, après quoi on tourne la plaque de
90° et on fait à nouveau passer un courant électrique.

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II.2.4- Électrophorèse bidimensionnelle
On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans
l'autre dimension (PAGE-SDS); on sépare ainsi environ 1000 protéines dans le
sérum.

On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux

tissus et organes humains. La lecture nécessite alors un système informatisé
d'analyse d'images.

II.2.5- Électrophorèse sur agarose

Elle est peu utilisée dans le cas des protéines, car dans ce domaine les gels de
polyacrylamide donnent toute satisfaction. Cependant, des gels d’agarose
sont utilisés sous forme de kits prêts à l'emploi en biologie clinique : ils sont alors
destinés à des applications spécifiques pour révéler un type donné de
constituant (lipoprotéines) ou certaines enzymes (déshydrogénases, estérases,
…), ainsi que pour les techniques de révélation par anticorps (qui peuvent plus
facilement diffuser au sein du gel, voir plus loin).

II.2.6- Immunoélectrophorèse
La révélation est basée sur une réaction "antigène-anticorps". On mettra de
côté l'immunoblot, qui consiste à visualiser des protéines sur un gel (la fixation
d'Ac étant révélée par un second anticorps marqué).
Les techniques ci-dessous utilisent le fait qu'à des concentrations adéquates,
du fait de la présence de familles d'anticorps (polyclonaux) et de la bivalence
de ces anticorps, il se forme des agrégats (= réaction d'immunoprécipitation).
Ce précipité est ensuite coloré selon les techniques classiques.
Il existe en fait tout un ensemble de techniques qui utilisent des anticorps
associés à des séparations électrophorétiques. On peut distinguer les
techniques suivantes :

II.2.6.1- Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

Les protéines migrent dans un gel d'agarose, puis on les révèle par une
technique de double diffusion des antigènes et des anticorps, donnant des
arcs de précipitation.

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 II.2.6.2- Électro-immunodiffusion double (électrosynérèse)
Elle consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions
électrophorétiques sont choisies de façon à ce que les antigènes et les
anticorps migrent en sens inverse.

II.2.6.3- Électro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)

Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se place à
pH où les Ig migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les
anticorps qui forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets"
dont la hauteur est proportionnelle à la concentration en protéine. On utilise
une partie des puits pour faire un étalonnage.

II.2.6.4- Électro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell)

On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On
coule ensuite un gel contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la
seconde dimension.

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II.2.7- Électrophorèse en champs pulsés
Cette technique est utilisée pour l'électrophorèse des molécules d'ADN de haut
poids moléculaire (15-100 kb). Dans cette gamme de taille (au-delà de 20 kb),
les molécules ne sont plus séparées par les méthodes classiques, car la
migration devient indépendante de la taille.
L’emploi de deux champs orthogonaux utilisés en alternance fait que les
molécules d'ADN, qui mettent un certain temps à s'orienter dans le sens du
champ électrique, ne migrent que lorsque celle-ci est réalisée. Le temps
nécessaire à l’orientation est d’autant plus grand que la molécule d’ADN est
longue.

II.2.8- Électrophorèse capillaire

C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre
essentiellement les avantages de la rapidité, de la très grande résolution et,
partant, de la très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un
capillaire de silice de diamètre d'environ 50 µm et de longueur 1 m (rempli de
tampon ou de gel), et des voltages élevés (15-30 kV). Ceci aboutit à des
vitesses de migration très rapides des composés dans les capillaires et ceux-ci
sont détectés par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie directement
sur le capillaire. Ceci fournit donc une sensibilité particulièrement élevée.

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Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides,
d'acides aminés, d'oligonucléotides … le nombre de plateaux est de l'ordre de
500000 par mètre, ce qui fournit une résolution remarquable (on peut séparer
des peptides différant d'un acide aminé, des mélanges complexes
d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est
utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse …).

La technique peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en

présence de micelles de détergents appropriés.

II.2.8.1- Électrophorèse capillaire en solution libre (FSCE)

Dans l’électrophorèse capillaire, le courant d'endosmose est la force
dominante et il dépend des charges présentes sur la paroi du capillaire ; ce
courant diminue à pH acide.

II.2.8.1- Électrophorèse capillaire micellaire (MCE)

Les micelles de détergent (SDS) forment une phase pseudo-stationnaire et le
soluté se partage entre celle-ci et la phase mobile. Les substances les plus
apolaires sont davantage "retenues" et la séparation obtenue s'apparente à
celle de la HPLC en phase inverse.

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II.2.8.1- Électrolocalisation en électrophorèse capillaire (CE-IEF)

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 III. ELECTROPHORESE DES PROTEINES

III.1- Principe
Les critères moléculaires exploités dans la séparation des protéines sont
la charge électrique et le poids moléculaire, et dans certaines situations la
forme (effet de pH sur les formes de l'albumine)

Le pH des solutions joue un rôle très important dans l'acquisition des charges
électriques. Ainsi, dans le cas des protéines, le pH auquel la charge électrique
globale est nulle est appelé point isoélectrique.

Une protéine en solution portée à un pH inférieur à son PI, se comporte comme

une base et capte des protons H+. Elle devient chargée positivement.

Une protéine mise à un pH supérieur à son PI, se comporte comme un acide

et cède des protons. Elle sera chargée négativement.

La mobilité électrophorétique d'une molécule peut être exprimée (de manière

simplifiée) par la relation :
Mobilité = k . (pH - pI) / masse molaire
où pI est le point isoélectrique de la molécule.

III.2- Électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide

Ce type d'électrophorèse peut être réalisé en utilisant des systèmes tampons
dissociant ou non dissociant, continus ou non continus. L'agent dissociant le
plus utilisé est le détergent anionique : Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).

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Une fois fixé sur les protéines (à chaud) le SDS affecte une charge négative (-)
à tous les polypeptides. Ces derniers migreront, donc, dans le gel de
polyacrylamide selon leur taille uniquement. Ainsi, l'expérimentateur peut
déterminer le poids moléculaire (PM) des différents polypeptides en se référant
à la mobilité de polypeptides de PM connus (marqueurs de PM).
Le système tampon non dissociant est recommandé pour l'électrophorèse de
protéines natives. Dans ce cas, la séparation se fait sur la base de la charge et
de la taille. Les systèmes tampons discontinus (multiphasiques) utilisent
différents tampons à des pH différents.

Exemple de systèmes tampon discontinus : Le système d'Ornstein

L'utilisation de tampons discontinus dans leur pH et la nature des ions, permet
la concentration préalable de l'échantillon à séparer. Les gels de
polyacrylamide répondant à cette condition, présentent 2 types de structures
:
- Un gel de concentration (stacking gel).
- Un gel de séparation (resolving gel).
Le gel de concentration et le gel de séparation sont deux types de gels de
polyacrylamide utilisés pour obtenir une meilleure séparation des protéines
dans chaque échantillon.

Ces deux gels diffèrent par le pH, la teneur en polyacrylamide, la taille des
pores ainsi que leur but ultime.
- Le gel de concentration a un pH inférieur (6,8) à celui du gel de
séparation (8,8).

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 - La teneur en polyacrylamide dans le gel de concentration
(généralement environ 4%) est inférieure à celle du gel de séparation
(environ 10%).
- La tailles de pores est plus petites dans le gel de concentration.
- Le but du gel de concentration est d'aligner (d'empiler) tous les
échantillons de protéines chargés sur le gel, afin qu'ils puissent entrer
dans le gel de résolution en même temps. Le gel de séparation consiste
à séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire.
L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de
concentrations en polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations
différentes :
- Élimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le
cas des gels très concentrés.
- Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le
front.
Entre ces 2 extrêmes, les protéines peuvent être résolues différemment selon la
concentration en polyacrylamide du gel de séparation :

(Polyacrylamide) (%) Poids moléculaire (Kd)

15-20 10-40
10-15 40-100
5-10 100-300
5 300-500
2-5 PM>500

III.3- Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes

La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été
décrite par Ulrich Laemmli en 1970. C'est l'une des techniques les plus cité(e)s
dans la littérature scientifique (et donc l'un des articles):
Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4" Nature, 227, 680 – 685.

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On fait bouillir un mélange de protéines en présence :
• d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol qui réduit les ponts
disulfures ;
• d'un détergent anionique fort : sodium dodecyl sulfate (SDS)
qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de
charges négatives. Ces charges se repoussent er déplient les
chaînes polypeptidiques.

En conséquence :
- les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure
tridimensionnelle native ;
- les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une
forme monomérique.
Les protéines de l'échantillon sont ensuite séparées par une
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
C’est un gel réticulé, obtenu par polymérisation :
• d'acrylamide qui forme des chaînes et ;
• de bis-acrylamide qui ponte les chaînes d'acrylamide.

La réaction de polymérisation est :

• initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate
d'ammonium ;
• catalysée par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane -
toxique).
Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est
élevée et les mailles du réseau sont serrées.
En conséquence :
• plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules
volumineuses peuvent migrer ;
• une protéine globulaire migre d'autant moins que sa masse molaire est
élevée.

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 Pourcentage d'acrylamide Gamme de séparation en kDa
7,5 45 - 400
10 22 - 300
12 13 - 200
15 2,5 - 100

Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support et
un peigne est enchâssé entre ces plaques.
Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant ainsi des puits.
La taille et le nombre des dents des peignes sont variables, ce qui permet
de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL d'échantillon de protéines
à séparer.
Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans
une cuve d'électrophorèse.

Source : Bio-Rad

Du tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis dans la cuve

et la migration s'effectue sous l'action d'un champ électrique :
Ex : tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS 0,1% -
pH 8,3 - 8,8
• Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol.
• Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion).
• Voltage : 100 V - 150 V

Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans les puits.

Après migration, le gel est démoulé.
Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient
du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de manière irréversible
les protéines dans les mailles du gel.
Les protéines sont révélées par une coloration avec le bleu de
Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible).

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On obtient différentes bandes pour chaque piste de la figure ci-dessous (la
flèche indique le sens de migration).
La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont
des protéines standards de masses molaires connues (piste de droite).

Exemple de marqueurs :
• Myosine (205 kDa) • Albumine (66 kDa)
• β-galactosidase (116 kDa) • Ovalbumine (45 kDa)
• Phosphorylase β (97,4 kDa) • Anhydrase carbonic (29 kDa)

III.3.1- Détermination de la masse molaire d'une protéine

Distance de migration d'une bande
La mobilité relative est le rapport : -----------------------------------------------
Distance de migration du front de migration

La droite : log (masse molaire) = f(mobilité relative) permet de déterminer

la masse molaire d'une protéine inconnue.

III.3.2- Révélation des protéines par coloration sur gel

Lorsqu'il s'agit des protéines, celles-ci sont généralement incolores. Leur
visualisation sur les supports d'électrophorèse s'effectue par des procédés

21
histochimiques qui permettent de colorer les produits de dénaturation de la
protéine ou une partie chimique qui lui est associée (coloration au bleu de
Coomassie et coloration par nitrate d'argent).

Révélation des produits d’électrophorèse : Protéines (Bleu de

Coomassie) ; Acides nucléiques (Bromure d’éthidium).

III.3.3- Révélation des protéines par mise en évidence d'une activité biologique
(catalyse enzymatique)
Lorsque les protéines sont de nature enzymatique, la révélation peut être faite
sur le gel par addition des substrats spécifiques d'une telle ou telle enzyme (la
détection du polymorphisme enzymatique).

III.4- Électrophorèse non dénaturante sur gel de polyacrylamide

III.4.1. Révélation des protéines par immunodétection

La révélation in situ sur gel des protéines par réaction antigène-anticorps est
coûteuse, car les protéines séparées restent " emprisonnées" dans le gel.
Pour diminuer les quantités les coûts d'anticorps à ajouter pour révéler les
protéines, il faut éluer les protéines du gel.

22
III.4.2. Transfert des protéines préalablement séparées sur gel, sur membrane
Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées sur un
nouveau support (membrane de nitrocellulose). La formation de l'empreinte se
dit blot en anglais d'où le nom western blot.

III.4.3. Immunodétection
Après transfert sur membrane des protéines à partir du gel, celles-ci sont
révélées par immunodétection en utilisant un anticorps préalablement
préparé contre elles. La réaction de détection fait appel à un anticorps
secondaire marquée à la peroxydase qui transforme un substrat de la réaction
en un produit coloré visible.
L'immunodétection (immunomarquage) est une des meilleures méthodes pour
caractériser une protéine parmi d'autres protéines.
La protéine (antigène) réagit avec les anticorps spécifiques (anticorps
primaires). Une fois le complexe antigène-anticorps formé. Il est détecté grâce
à un deuxième anticorps (anticorps secondaire, pouvant être marqué par une
enzyme (peroxydase) qui détecte les emplacements où les anticorps primaires
se sont fixés sur les antigènes (protéines) fixés à la membrane.
L'activité enzymatique est détectée grâce à une méthode de
chimiluminescence pour trouver la position des complexes antigène-
anticorps.

23
 IV. ELECTROPHORESE DES ACIDES NUCLEIQUES

IV.1- PRINCIPE
L'électrophorèse des acides nucléiques (ADN, ARN) exploite en priorité la
propriété de la taille des molécules (car charge négative pour tous les acides
nucléiques, due au phosphate). Néanmoins, la forme intervient aussi, lorsqu'il
s'agit de plasmides.

IV.2- Gel d'électrophorèse d'ADN

L'agarose (figure ci-contre) est un

polymère d'un diholoside
(MM d'environ 120.000 Da).

24
IV.3- Tampon d'électrophorèse
- TAE : Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8
- TBE : Tris/Borate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8
Tampon de charge : bleu de bromophénol 0,02% - xylène cyanol 0,02% -
glycérol 3% - tampon TBE.
Les 2 colorants permettent de suivre la migration des fragments d'ADN :
- la migration du bleu de bromophénol est "comparable" à celle d'un
fragment d'ADN de 300 paires de base.
- la migration du Xylène cyanol est "comparable" à celle d'un fragment
d'ADN de 4000 paires de base.

Migration
------------>

IV.4- Révélation des acides nucléiques

La révélation des acides nucléiques peut être faite par simple incubation des
gels dans une solution de bromure d'éthidium ou par coloration au nitrate
d'argent.
Lorsqu'on dispose d'une sonde marquée, on peut l'utiliser dans la révélation du
DNA après transfert des produits séparés sur membrane de nitrocellulose
(Southern blotting). La détection des fragments de DNA se fait par hybrydation
selon les appariements des bases A-T et C-G.

IV.4.1- Révélation des bandes d'ADN (coloration) par le bromure d'éthidium

Des hétérocycles organiques à noyaux accolés comme le bromure d'éthidium
se lient à l'ADN bicaténaire par intercalation.

Ils occupent un site interbase sur deux jusqu'à saturation.

Ce type de liaison est dit par "exclusion du voisinage".
Les intercalants sont séparés les uns des autres par des intervalles de 10,2 Å.
Le bromure d'éthidium (concentration d'utilisation finale : 0.5 µg/ml)
est extrèmement dangereux et nécessite de porter des gants pour manipuler
les gels lors de la révélation et après.

25
 Intercalation
------------>

Source des figures : "Principes de Biochimie Minérale"

Lippard & Berg (1997), Ed. DeBoeck Universités

La visualisation des bandes révélées avec le bromure d'éthidium nécessite

un transilluminateur UV (longueur d'onde : 302 nm, voire 254 nm et 365 nm).
Les rayons UV sont dangereux pour les yeux : il faut porter des lunettes, ou
disposer d'une enceinte dans laquelle sont placés le transilluminateur et une
caméra.

Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui ne nécessitent pas l'emploi

d'UV mais sont moins sensibles que la révélation par le bromure d'éthidium :
- le bleu de méthylène
- l'azure A
- le bleu de toluidine

La coloration au bleu de Nile semble une méthode à la fois sensible et non

dangereuse.
GelRed
- Colorant stable et sensible pour visualisation d''acides nucléiques (ARN et ADN simple et double brin).
- Alternative à l'utilisation du BET, sans danger pour l'environnement.
- Présente les mêmes spectres d''excitation et d''émission que le BET.
- Les acides nucléiques colorés au GelRed sont utilisables en clonage et en séquençage.
- Colorant concentré 10000 X dans l''eau.
- Existe en trois conditionnements : 0,1 ; 0,5 et 10 ml.
- Longueur d''onde d''excitation principale 290 nm / secondaire 520 nm.
- Longueur d''onde d''émission 595 nm.

26
IV.4.2- Détermination de la taille d'un fragment d'ADN
Gel d'électrophorèse sur agarose (ci-dessous) sur lequel on voit :
- les marqueurs (ou échelle, "ladder") de longueur (en paires de base) de
fragments d'ADN.
- un fragment d'ADN inconnu.

La droite : log(taille) = f(distance de migration) permet de déterminer la taille en

paires de base d'un fragment d'ADN inconnu (figure de dessous).

27
 V. L'ELECTROPHORESE SUR GEL BI-DIMENSIONNEL EN PROTEOMIQUE
(SWISS-2DPAGE)

V.1- Principe
La stratégie la plus courante est de séparer dans un premier temps les protéines par
électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide (ou 2D - PAGE - "two-
dimensional polyacrylamide gel electrophoresis").
En effet, du fait de leur composition en acides aminés, les protéines diffèrent les
unes des autres par leur masse molaire et leur charge nette à un pH donné. Cette
valeur est caractérisée par le point isoélectrique ou pI.
Les protéines ont :
• des pI qui s'échelonnent de 2 (glucose-1-phospho-D-
mannosylglycoprotéine phosphodiestérase) à 12 (cathepsine G) ;
• des masses molaires de 5 kDa à 590 kDa (calossine - 5322 acides aminés).
L'une des difficultés majeures de la séparation est de trouver des conditions
d'électrophorèse qui couvrent de telles gammes de propriétés physico-chimiques.

1ère dimension : une isoélectrofocalisation (IEF) où les polypeptides migrent

jusqu'à un pH égal à leur pl.
La séparation selon la charge utilisait auparavant des ampholytes pour obtenir
un gradient de pH. Mais ce procédé n'était pas assez reproductible pour la
comparaison de gels par superposition.
On utilise maintenant des gradients de pH immobilisés (IPG), formés avec
des immobilines qui sont des dérivés de l'acrylamide et leur structure générale
est décrite dans la figure ci-dessous.

Ainsi, les groupes chargés portés par les immobilines qui forment le gradient de
pH sont covalamment attachés (via une liaison vinyle) à la matrice de
polyacrylamide et donc immobilisés.
Cette technique permet d'obtenir des gradients de pH reproductibles et très
étroits.

2ème dimension : une séparation selon la masse molaire est un gel

d'électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes (sodium
dodécyl sulfate ou SDS et réduction des ponts disulfure).

28
 Source : Piercenet

Ces deux électrophorèses sont effectuées de manière perpendiculaire l'une

par rapport à l'autre.

Les paramètres de la séparation étant indépendants, cette technique est

particulièrement résolutive : plusieurs centaines de chaînes polypeptidiques
peuvent être séparées sous forme de taches de protéines ou spots sur un gel.

Source : Humboldt - Universität Berlin

29
V.2- Les méthodes de révélation des protéines
La coloration des gels pour la révélation des protéines (100 ng à 0,1 ng de
protéine par spot) peut se faire avec le :
• Bleu de coomassie : 30 - 50 ng, faible sensibilité.
• Bleu colloïdal : 5 à 10 fois plus sensible.
• Nitrate d'argent : forte sensibilité (0,1 ng) (photo de droite ci-dessous).
• Fluorophore "Sypro Ruby®" : forte sensibilité (1 à 10 ng) (photo de
gauche ci-dessous).

Source : Sigma- Aldrich

Les logiciels d'analyse d'image des gels repèrent les spots et calculent leur
coordonnées et leur intensité.
La sélection des spots à prélever est transmise au couteau à gel. Les morceaux
de gels sont déposés dans les puits de plaques à 96 puits.

Exemple d'appareillage :
- Électrophorèse 1ère dimension : "Protean IEF Cell" (BioRad).
- Électrophorèse 2ème dimension : "Ettan DALTsix Large Vertical System"
(Amersham Biosciences).
- Logiciel : "ImageMaster 2D" (Amersham Biosciences).
- Couteau à gel : "Spot cutter" (BioRad).

Références Bibliographiques
Cl. Audigier, G. Dupont, F. Zonszain (1995). Principes des méthodes d’analyse Biochimique
(Tome 1, nouvelle édition). DOIN Éditeurs.
Lippard & Berg (1997). Principes de Biochimie Minérale. Ed. DeBoeck Universités.
RF. Boyer (1993). Modern experimental biochemistry (2e ed), Addison-Wesley Publishing
Company, Reading (USA). p. 114-45.
RMC. Dawson, DC. Elliot, WH. Elliot, KM. Jones (1986). Data for biochemical research,
Clarendon Press, Oxford p. 442-3.
RL. Dryer, GF. Lata (1989). experimental biochemistry, Oxford Univesity Press, Oxford.
P. Kamoun (1977). Appareils et méthodes en biochimie, Flammarion Médecine-Sciences, Paris.
DT. Plummer (1987). An introduction to practical biochemistry (3° édition), McGraw Hill Book
Co., London.
RL. Switzer & LF. Garrity (1999). Experimental Biochemistry, WH Freemam, NY: 61-77.

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