Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Fiches Techniques

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie
Licence L3 Microbiologie Appliquée Semestre2
 T.P. N°01
 Matière: Microbiologie de l’environnement

 Intitulé : Isolement des microorganismes du sol

 Protocole :

 Principe: Isolement et dénombrement des microorganismes qui se trouvent dans deux

échantillons de sol différents (moisissures, actinomycètes, bactéries, levures…) par la
méthode des dilutions successives.

 Méthodologie (succincte) :
1 gramme de chaque sol séché et tamisé est introduit dans un tube contenant 9 mL
d’eau distillée stérile + tween 80 (agent mouillant). Les échantillons sont homogénéisés
par agitation au vortex pendant quelques minutes.
- Prélever 1 ml à l’aide d’une pipette stérile et déposer dans un tube à essai contenant 9
ml d’E.D stérile ou E.P
- Agiter pendant au moins une minute.
- Répéter les étapes 4 et 5 pour les trois autres dilutions (10-2, 10-3, 10-4).
- En commençant par la dilution la plus faible (10-4), pipeter 0,1 ml et déposer dans
chacune des 2 boites de Petri contenant les milieux PDA, GN et WYE. Étendre sur
toute la surface avec un étaloir stérile.
- Effectuer les mêmes étapes pour les dilutions de 10-4 et 10-3.
- Sceller les boites de Petri à l’aide du Ruban cellophane.
- Incuber les boites de Petri à la température de la pièce. Observer après 24, 48 et 72
heures.
- Noter le nombre de colonies/plat de Petri/dilution.
- Calculez le nombre de microorganismes par gramme de sol selon la formule suivante :
Nombre de colonies /plat × le facteur de dilution = # organismes / 1 gramme de sol
- Noter la morphologie des colonies.

Produits chimiques Consommable Lugol /Verrerie Petits Matériels

 Glucose asparagine : Glucose,
10g ; asparagine, 0.5g ;
K2HPO4, 0.5g ; agar, 15g
 PDA (Pomme de terre
dextrose Agar): 200g Pomme
de terre; 20g dextrose; 20g
Agar.
 GN (gélose nutritive): extrait
de viande 1,0g/L, extrait de
levure 2,5g/L, peptone 5,0g/L,
chlorure de sodium 5,0 g/L,
Agar 15,0 g/L
 WYE (water-yeast extract-
agar) Modifié par Reddi et
Rao: Extrait de levure oxoid,
0.25g; agar oxoid, 18g.
 Tween 80
 Boites de Petri  Anse de platine
 Embouts bleu stériles p1000 et p200  Tamis
 Pipettes Pasteur stériles  Spatules
 Micropipette p1000
 Papier aluminium  Micropipette p200
 Ruban cellophane
 Papier absorbant
 Désinfectants
 Eau distillée
 Béchers 200 ml
 Tubes à essai
 Lames
 Lamelles
 Huile à immersion
 Violet de Gentiane
 Fuschine
 Lugol
 Ethanol 0.95%
 NaOCl

T.P. N°02
 Matière: Microbiologie de l’environnement

 Intitulé : Isolement et observation de Rhizobium

 Protocole :

 Principe: Isolement des bactéries nodulant les plantes légumineuses (luzerne, pois,
fève... etc.) sur milieu gélosé et observation des formes bactéroides (provenant du
nodule). Formes dont les contours sont très irréguliers (formes en X, en Y, etc.).

 Méthodologie (succincte):

Préparer un état frais:

Avec l'aiguille lancéolée, prélever par grattage, un peu de matière d'une nodosité et faire
un premier étalement avec le plat de l'aiguille ou d'un bistouri.
Ajouter une goutte de colorant (bleu de méthylène ou rouge neutre) et, après 2 minutes
environ, placer la lamelle et procéder à un nouvel écrasement en appuyant délicatement sur
la lamelle avec le manche de l'aiguille.
b) A partir d'une suspension dilution des nodules racinaires : déposer une petite goutte
d'eau (flacon du portoir à colorants)
- Etaler sur environ ¼ de la lame.
- Laisser sécher en mettant la lame sur le chauffe lames.
- Fixer le frottis en passant la lame 3 fois dans la flamme du bec Bunsen (1/2 seconde par
passage).
- coloration au violet de Gentiane suivie d'un mordançage par une solution iodo-iodurée de
Lugol.
- Recouvrir toute la lame de Violet de Gentiane. Laisser 1minute
- Rincer à l’eau avec une pissette d’eau
- Ajouter le Lugol. Laisser 30 secondes (répéter l'opération un deuxième fois).
- Rincer à l'eau .
- Décoloration à l'alcool
- Recouvrir la lame d'alcool éthylique 100°. Attendre 10 secondes.
- Rincer immédiatement à l'eau .
- Recoloration à la fuchsine.
- Ajouter la Fuchsine. Laisser 1 minute.
- Laver abondamment à l'eau.
- Sécher délicatement la lame dans un papier jetable. Nettoyer au besoin le dessous de la
lame avec un papier jetable . La lame doit être totalement sèche.
- Observer à l'immersion en pleine lumière : Mettre une goutte d'huile à immersion sur la
lame
3) Isolement
a- La technique consiste à stériliser superficiellement les nodules dans un premiers temps;
 - Dans un petit récipient en verre, verser 10 mL de NaOCl à 2% sur les nodules
préalablement lavées et laisser agir pendant 5min.
- Eliminer le NaOCl et laver les nodules 2 à 3 fois avec de l'eau stérile.
- A l'aide d'une tige de verre préalablement trempée dans l'alcool et flambée stérile, broyer
les nodules placés dans 3mL d'eau stérile. Ceci constitue l’échantillon non dilué.
- Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10 -1, 10-2, 10-3 et 10-4 dans un volume
final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube.
- A l'aide de pipette pasteur stérile, déposer une goutte du liquide ou d'une suspension
diluée du surnageant dans une boîte de Petri YEM et étaler aseptiquement les gouttes avec
un étaloir.
b- Ensemencement des milieux de culture et incubation
- Prévoir 1 gélose par dilution.
- Ensemencer 0.1 mL des dilutions suivantes;10 -1, 10-2 et 10-3 sur les milieux suivants :
Yeast Extract-Mannitol (YEM) et GN.
- Vortexer la dilution avant de prélever 0.1 mL ; répartir sur la gélose puis étaler
rapidement au râteau. Incuber les boites des milieux gélosés YEM et GN à pendant 2 à 4
jours à un température comprise entre 25 à 30°C.
- Noter la morphologie des colonies.
- Purification des isolats sur milieu YEM par la méthode des quadrants et incubation à
température ambiante pendant 72h.

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Milieu Yeast-Extract-  Boites de Petri  Anse de platine
Mannitol (YEM):  Embouts bleu stériles p1000 et p200  Spatule
Mannitol: 10g; K2HP04:  Papier filtre  Micropipette p1000
0.5g; Extrait de levure:  Pipettes Pasteur stériles  Micropipette p200
0.5; NaCl: 0,1g;  Flacons en verre 250ml  Aiguille lancéolée
MgS04.7H20: 0.2g; HCl  Papier absorbant  Pince
N/10; agar: 18 g.  Désinfectants  Bistouri
 GN (gélose nutritive):  Eau distillée  Verre de montre
extrait de viande 1,0g/L,
 Béchers 200 ml
extrait de levure 2,5g/L,
 Tubes à essai
peptone 5,0g/L, chlorure
de sodium 5,0 g/L, Agar  Lames
15,0 g/L.  Lamelles
 Huile à immersion
 Violet de Gentiane
 Fuschine
 Lugol
 Bleu de méthylène
 NaOCl
 éthanol 0.95%
 T.P. N°03
 Matière: Microbiologie de l’environnement

 Intitulé : Isolement des microorganismes de l’eau

 Protocole :

 Principe: Faire une analyse bactériologique de deux échantillons différents d'eau par un
dénombrement en fermentations à tubes multiples et sur milieux gélosées et ce pour la
mise en évidence des indicateurs de contamination fécale et de la flore aérobie
mésophile totale.

 Méthodologie (succincte):

1) Analyse des coliformes totaux et fécaux

Test présomptif :
Dans 9 tubes contenants le milieu BCPL, transférer avec une pipette stérile, respectivement
10ml, 1ml, 0,1ml de l’échantillon bien homogénéisé, et mélanger le contenu de ces 9 tubes
de façon à obtenir une répartition homogène de l’inoculum et du milieu. Les tubes sont
incubés à 37°C pendant 48 h. Les tubes présentant un trouble avec production du gaz dans
la cloche sont positifs.
Les tubes BCPL présentant un trouble avec dégagement du gaz dans la cloche sont
positifs, ils confirment la présence des coliformes, Compter le nombre de séries de tubes
positifs et le nombre de tubes négatifs et on obtient les résultats en extrapolant sur la table
de MAC GRADY.
Test confirmatif :
Procéder à la confirmation de chaque culture provenant des tubes ayant donné une réaction
positive, en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée le bouillon lactosé au vert brillant.
Incuber deux séries de tubes dans les conditions suivantes:
Les coliformes totaux sont incubés à 37°C pendant 48h.
Les coliformes fécaux sont incubés à 44°C pendant 24h.
Test démonstratif :
-Inoculer le milieu EMB à partir des tubes positifs BLBVB et incuber 24h à 37°C.
-Préparer un frottis à partir des colonies développées sur milieu EMB et faire une
coloration de Gram.
-Observer à l'immersion et noter la forme des cellules et leur mode de regroupement.

2) Analyse des stréptocoques fécaux

Le bouillon de Rothe est utilisé (même mode opératoire que les coliformes) pour le test
présomptif, tubes sont incubés à 37°C pendant 48h. Le bouillon Litsky est utilisé pour le
test confirmatif. La lecture des résultats se fait après 48h d’incubation. Les tubes de Litsky
présentant un trouble avec dépôt violet au fond sont positifs.

3) Dénombrement de la flore mésophile totale

- Prélever 1mL d'eau brute et l'introduire dans un tube contenant 9 mL d’eau physiologique
stérile. L'échantillon est homogénéisé par agitation au vortex pendant quelques minutes. La
suspension ainsi obtenue constitue la dilution 10-1.
 - Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10-2, 10-3 et 10-4 dans un volume
final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube.
- Liquéfier la gélose PCA à 45-50°C.
- Prévoir 2 boites par dilution.
- Vortexer la dilution avant d'ensemencer 1 mL des dilutions suivantes 10-2, 10-3 et 10-4.
Prélever 1ml de l'échantillon à analyser et l'introduire à l’intérieur des boites de pétri
stériles puis ajouter 10 à 15mL de gélose.
- Laisser solidifier après une agitation lente.
- La première série de boites est incubée à 37°C pendant 24h pour la croissance des
bactéries pathogènes, qui se développent à la température du corps humain. La deuxième
série de boites est incubée à 22°C pendant 48 à 72h pour la croissance des bactéries
adaptées à la température de l’eau.
- Dénombrer les colonies sur PCA et noter leur aspect macroscopique.
- Calculer la concentration des bactéries par ml d'échantillon d'eau. Ne pas oublier de tenir
compte des dilutions.
N : Nombre d' UFC par gramme ou par mL de produit initial
Boîtes interprétables = boîtes qui contiennent entre 30 et 300 colonies. Pour une boîte 10-3
le facteur de dilution est 1000.

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Bouillon de Rothe : peptone  20,0 g;  Boites de Petri  Anse de platine
glucose 5,0 g; azide 0,2 g; NaCl : 5,0  Embouts bleu stériles p1000 et  Micropipette
g; hydrogénophosphate de p200 p1000
potassium : 2,7 g;  Pipettes Pasteur stériles  Micropipette p200
dihydrogénophosphate de potassium :  Ruban cellophane
2,7 g.  Papier absorbant
 Bouillon de Litsky : Ploypeptone : 20  Désinfectants
g.  Eau distillée
 Glucose : 5 g.  Béchers 200 ml
 Chlorure de sodium : 5 g.  Tubes à essai
 Phosphate monopotassique : 2.7 g.  Lames
 Phosphate dipotassique : 2.7 g.  Lamelles
 Azide de sodium : 0.3 g.  Ecouvillons stériles
 Ethyl violet : 0.0005 g.  Eprouvettes 50 ml

 Bouillon lactosé au pourpre de
bromocrésol (BCPL): Peptone 5,0 g;
Extrait de viande de bœuf  3,0 g;
Lactose 10,0 g, Pourpre de
bromocrésol 25 mg.
 Bouillon vert brillant: Peptone
10,0 g; Lactose 10,0 g; Bile 20,0 ml;
Vert brillant 13,0 mg.
 Milieu EMB: peptone  10,0 g;
lactose 10,0 g; éosine 0,4 g; bleu de
méthylène 0,0625 g;
hydrogénophosphate de potassium
2,0 g; agar 15,0 g.
 Milieu PCA: Tryptone 6,0 g; extrait
 de levure 2,5 g; glucose 1,0 g;
agar15,0 g.
 Huile à immersion
 Violet de Gentiane
 Fuschine
 Lugol
 Bleu de méthylène
 Rouge neutre
 NaOCl
 éthanol 0.95%

T.P. N°04
 Matière: Microbiologie de l’environnement

 Intitulé : Etude de la Flore Bucco-dentaire humaie

 Protocole :

 Principe: Isolement des microorganismes à partir de d'un prélèvement de muqueuses

buccales de la gencive et de la langue sur différents milieux de culture et identification
morphologique microscopique et macroscopique après incubation à des températures
proches de la température du corps humain.

 Méthodologie (succincte):
1) Prélèvement
- Avec un écouvillon stérile, frotter environ 2 cm2 de la muqueuse buccale
(intérieur de la joue). Agiter l’écouvillon dans 2 mL d’eau stérile. Ceci constitue
l’échantillon pur = non dilué (P).
2) Colorations de Gram
a) Frotter l’écouvillon « muqueuse » sur 2 lames. Faire une coloration de Gram
sur 1 lame et conserver l’autre pour refaire la coloration si nécessaire. Estimer le
% de chaque type de bactéries.
b) Avec un autre écouvillon frotter une dent du fond et la gencive l’entourant.
Frotter l’écouvillon « dent » sur 2 lames. Faire une coloration de Gram sur 1 lame
et conserver l’autre pour refaire la coloration si nécessaire.
Estimer le % de chaque type de bactéries et comparer avec la flore de la
muqueuse.
3) Dilutions en eau distillée stérile
Dans des tubes à essai stériles, réaliser les dilutions 10 -1, 10-2, 10-3 et 10-4 dans un
volume final de 10 mL. Bien vortexer chaque tube
4) Ensemencement des milieux de culture et incubation
Prévoir 1 gélose par dilution.
Ensemencer 0.1 mL des dilutions suivantes: 10 -2, 10-3 et 10-4 sur les milieux
suivants : PCA, Chapman et Sabouraud.
vortexer la dilution avant de prélever 0.1 mL ; répartir sur la gélose puis étaler
rapidement au râteau. Incuber les boites des milieux gélosés à 37° C pendant 24
à 48h.
5) Dénombrer les colonies de chaque type sur les différents milieux. Noter
l'aspect macroscopique des colonies sur chaque milieu de culture.
6) Identifier sommairement les bactéries : Gram, oxydase, catalase
 3) Calculer la concentration de chaque type de bactéries par mL de muqueuse
buccale. Ne pas oublier de tenir compte de la dilution.
N : Nombre d' UFC par gramme ou par mL de produit initial

Produits chimiques Consommable/Verrerie Petits Matériels

 Milieu PCA: Tryptone 6,0 g;  Boites de Petri  Milieu PCA: Tryptone
extrait de levure 2,5 g; glucose  Embouts bleu stériles p1000 et 6,0 g; extrait de levure
1,0 g; agar15,0 g. p200 2,5 g; glucose 1,0 g;
 Milieu Chapman:  Pipettes Pasteur stériles agar15,0 g.
Peptone 10,0 g; Extrait de viande  Ruban cellophane  Milieu Chapman:
de bœuf 1,0 g; Chlorure de  Papier absorbant Peptone 10,0 g;
sodium 75,0 g; Mannitol 10,0 g;  Désinfectants Extrait de viande de
Rouge de phénol 0,025 g; Agar-  Eau distillée bœuf 1,0 g; Chlorure
Agar15,0 g.  Béchers 200 ml de sodium 75,0 g;
 Milieu Sabouraud: Peptone 10 g; Mannitol 10,0 g;
Glucose 20 g; Agar-agar 15 g;  Tubes à essai Rouge de phénol
vitamines et facteurs de  Lames 0,025 g; Agar-
croissance  Lamelles Agar15,0 g.
 Disques oxydase  Ecouvillons stériles  Milieu Sabouraud:
 Eau oxygénée Peptone 10 g; Glucose
 Huile à immersion 20 g; Agar-agar 15 g;
 Violet de Gentiane vitamines et facteurs
 Fuschine de croissance
 Lugol  Disques oxydase
 Bleu de méthylène  Eau oxygénée
 Rouge neutre  Huile à immersion
 NaOCl  Violet de Gentiane
 éthanol 0.95%  Fuschine
 Lugol
 Bleu de méthylène
 Rouge neutre
 NaOCl
 éthanol 0.95%