IV- Les différents types d’hybridation moléculaire :

Introduction :

L’hybridation peut avoir lieu dans un milieu liquide ou sur un support solide soit par
immobilisation sur membrane (nitrocellulose, nylon), sur verre, sur des colonies bactériennes,
sur des chromosomes ou sur des coupes de tissus…...

Des sondes monocaténaires spécifiques sont utilisées lorsque la séquence d’ADN ciblée est
connue donc il s’agit d’une technique ciblée, d’un autre coté des sondes monocaténaires non
spécifiques sont utilisées lorsque la séquence d’ADN ciblée est inconnue donc il s’agit d’une
technique de criblage ou de balayage.

IV-1. Les techniques d’hybridation moléculaires ciblées :

Il s’agit de techniques qui permettent la localisation précise d’une séquence d’acide

nucléique à l’intérieur d’un échantillon. En connaissant spécifiquement la séquence de
nucléotides à étudier (ADN cible), il est possible d’utiliser des sondes complémentaires qui
serviront alors de détecteurs dans l’échantillon à analyser. En les mettant dans les conditions
de température, et pH optimales, ces sondes vont s’hybrider à la séquence d’acide nucléique
complémentaire. Il suffit alors d’ajouter un marqueur à ces sondes pour pouvoir visualiser la
réponse obtenue. Pour cela plusieurs marqueurs peuvent être mis en place :

 Les marqueurs radioactifs : Il s’agit des éléments radioactifs 32P, 35S et 3H qui sont
des isotopes radioactifs des éléments P, S et H. Ces atomes radioactifs sont alors intégrés
aux bases azotées des sondes synthétisées et permettent l’obtention d’un signal «
chaud».
 Les marqueurs Non radioactifs : Il s’agit d’ajouter des « tags » aux extrémités des
séquences sondes. Ces tags sont souvent des protéines qui vont pouvoir être liées à un
révélateur et ainsi permettre de visualiser le signal de façon continue ou non. Trois
marqueurs sont couramment utilisés :
 La biotine : cette molécule possède une affinité extrêmement forte pour la streptavidine.
Une molécule de biotine peut se lier à 4 molécules de Streptavidine. Cette spécificité en
fait un outil d’amplification du signal extrêmement important. Il suffit en effet de révéler
la streptavidine pour pouvoir obtenir un signal stable et détectable.
  La Digoxygénine : Il s’agit d’un stéroïde qui se lie facilement aux autres molécules
biologiques. De plus le nombre d’anticorps ciblant cette molécule est important ce qui
permet à cette molécule de devenir un marqueur standard lors des techniques
d’hybridation d’acide nucléique.
 Les Fluorochromes : ces molécules sont des substances chimiques qui sont capables
d’émettre de la lumière lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde donnée. Cela
permet alors de détecter les séquences d’acides nucléiques à l’aide d’un microscope à
fluorescence.

IV-1.1.Le Southern-blot :

L'analyse commence avec de l'ADN génomique, l'ADN est isolé puis digéré par des
enzymes de restriction. Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui coupent l'ADN
à des sites particuliers. Chaque enzyme coupant I'ADN uniquement à son site de reconnaissance
spécifique, l'ADN total d'un individu, présent dans ses cellules nucléées, peut être coupé en
fragments de tailles définies, d'une manière reproductible. Les fragments d'ADN individuels
peuvent alors être sélectionnés, ligaturés dans des vecteurs adaptés, multipliés et étudiés. Grâce
à la répartition irrégulière des sites de restriction, les fragments d'ADN diffèrent par leur taille.
Il s’agit du polymorphisme de longueur des fragments de restriction ou RFLP (pour Restriction
fragment length polymorphism).
Le mélange initial de fragments d'ADN est en premier trié suivant le critère de la taille,
grâce à une électrophorèse dans un gel. Un protocole permet ensuite de détecter les fragments
d'ADN cibles par buvardage ou Southern blot, baptisé ainsi par E. Southern qui développa cette
méthode en 1975.
Un (ou plusieurs) de ces fragments, non encore identifié, contient l’ADN cible. Les
fragments sont séparés en fonction de leur taille dans un gel (le plus souvent, de l'agarose) dans
un champ électrique donc par électrophorèse. La vitesse de migration d'un fragment est
inversement proportionnelle à sa taille, d'autant plus rapide que la taille est petite, d'autant plus
lente que la taille est grande. Ensuite, les fragments contenus dans le gel sont transférés sur une
membrane de nitrocellulose ou de nylon.
L'ADN est ensuite dénaturé par traitement alcalin puis fixé à la membrane sous l'action de la
chaleur (environ 80°C) ou par irradiation aux UV. La membrane est alors incubée avec une
sonde d'ADN (ADN génomique ou ADNc simple brin), complémentaire de l’ADN cible. La
sonde s’hybride spécifiquement avec le fragment complémentaire recherché.
La sonde étant marquée par un isotope radioactif 32P, le fragment recherché peut être repéré
en plaçant un film radiosensible sur la membrane. Après développement du film, le fragment
est visualisé sous la forme d'une bande noire (autoradiographie). La taille du fragment est
corrélée à sa position, et celle-ci est définit à l'aide de fragments d'ADN de tailles connues qui
ont migré en parallèle dans le gel lors de l'électrophorèse (Echelle moléculaire).

Figure 1. Principe du Southern-blot

IV-1.2. L’ASO Dot-blot :

Le principe de cette méthode repose sur l’emploi de deux oligonucléotides ou sondes.

Chaque sonde est spécifique à l’un des deux allèles, l’allèle normal et l’allèle porteur d’une
mutation. Après une étape d’amplification par PCR, l’ADN ou le produit amplifié est
immobilisé sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon. La sonde strictement spécifique
de l’allèle normal s’hybridera sur l’ADN non muté alors que la sonde spécifique de l’allèle
muté s’hybridera uniquement si l’allèle muté est présent. Les conditions d’hybridation et de
stringence sont telles que la sonde normale ne s’hybride pas avec l’allèle muté et la sonde mutée
ne s’hybride pas avec l’allèle normal. La forme du dépôt sur la membrane à l’aspect d’un rond,
on parle de dot-bot.

En pratique, après une PCR réalisée sur le fragment d’ADN d’intérêt, les produits amplifiés
sont dénaturés pour les rendre sous forme simple brin puis déposés sur un rond d’une membrane
de nylon ou de nitrocellulose.

La membrane est ensuite coupée en deux demi-membranes. Après fixation de l’ADN amplifié
sur chaque demi-membrane, la sonde normale est mise en contact avec la première demi-
membrane et la sonde mutée est mise à hybrider avec l’autre demi-membrane. Le marquage des
sondes est réalisé soit avec un isotope radioactif (32P ou 35S) ou par un système de marquage
enzymatique. Pour chaque sonde, des conditions de stringence spécifique ont été étudiées au
préalable afin d’assurer une hybridation optimale entre la sonde et sa cible homologue (les
sondes normales et les sondes mutées sont généralement différentes sur un seul nucléotide !).
Après hybridation des deux demi-membranes, plusieurs séries de lavages sont réalisés pour
éliminer l’excès de sondes non hybridées. Une étape de révélation qui permet de mettre en
évidence le couple sonde-cible est ensuite réalisée soit par autoradiographie dans le cas d’un
marquage avec un isotope radioactif, soit par émission d’un signal fluorescent dans le cas
d’utilisation d’enzyme ou autre marquage non radioactif.
 Figure 2. Principe du Dot-blot

La sonde complémentaire à la séquence normale du gène de la β globine (T au niveau du codon 6) fluoresce en

jaune.
La sonde complémentaire à la séquence mutée du gène de la β globine (A au niveau du codon 6) fluoresce en vert.
Le pedigree représente une famille de 5 membres, après une analyse en dot-blot :
L’ADN du père et de la mère ont été hybridés avec les deux sondes (dot de couleur jaune et dot de couleur verte))
donc ils sont porteurs des deux types de gènes normal et muté, même chose pour le garçon ; ils sont donc
hétérozygote porteurs de la mutation (donc on met un point noir dans leur symbole).
L’ADN de la première fille a hybridé seulement avec la sonde normale (dot de couleur jaune), donc elle ne possède
que deux copies de l’allèle normal (symbole claire) et ne possède pas de copie de l’allèle muté.
L’ADN de la deuxième fille a hybridé seulement avec la sonde mutée (dot de couleur verte), donc elle ne possède
que deux copies de l’allèle muté (symbole foncé) et ne possède pas de copie de l’allèle normale.
 IV-1.3. Northern-blot:

Cette méthode est utilisée pour détecter des molécules d'ARN spécifiques parmi un
mélange d'ARN (transcriptome) et analyser la présence et/ou les modifications de séquences
d’ARN sur des extraits de tissus ou cellules.
Le Northern blot peut être donc utilisé pour analyser un échantillon d'ARN d'un type de tissu
ou de cellule particulier afin de mesurer l'expression d'ARN de gènes particuliers. Cette
méthode a été nommée pour sa similitude avec la technique connue sous le nom de Southern-
blot. Différentes techniques découlent selon le type d’ARN analysés (ARN totaux, ARNm ou
ARNr, miARN…). La séparation de l'ARNm des ARN totaux se fait par chromatographie
d’affinité avec l’utilisation d’ancrages poly T fixés sur des colonnes d’élution. L’ARN étudié
peut aussi être de type ARNr, ce qui permet de définir l’espèce d’un microorganisme dans un
échantillon biologique, différents types d’ARNr (5S, 28S, 15S, 16S….) sont alors identifiés.
Le point de départ de tout Northern-blot est de l’ARN de bonne qualité (congélation +++), et
en quantité suffisante (minimum 5 μg). Les molécules d'ARN sont ensuite séparées en fonction
de leur taille par électrophorèse sur gel. Après la séparation, l'ARN est transféré du gel sur une
membrane. Une fois le transfert terminé, l’ARN est fixé sur la membrane nylon par cuisson
sous vide, UV). Vient ensuite une étape de pré-hybridation pour la saturation des sites
aspécifiques. Suivit par l’hybridation proprement dite avec la sonde complémentaire marquée
(32P principalement). Plusieurs lavages successifs sont effectués pour l’élimination des
hybridations non spécifiques sur des séquences analogues à la cible (stringence croissante). Le
signal est détecté par autoradiographie sur film, ce qui permet de détecter la molécule d'ARN
d'intérêt parmi les nombreuses molécules d'ARN différentes présentes sur la membrane.

Figure 3. Principe du Northern-blot

 IV-1.4. L'hybridation in situ en fluorescence :

Cette technique couramment appelée FISH (pour Fluorescence in situ Hybridization)

est fortement utilisée en laboratoire de recherche et de diagnostic sur des échantillons de
différents types. La toute première technique de cytogénétique moléculaire s’appelle
l’hybridation in situ fluorescente. Elle repose sur les propriétés de dénaturation et de
renaturation de la molécule d’ADN. Dans certaines conditions de température, de ph ou de
salinité, les deux brins d’une molécule d’ADN peuvent se séparer puis se réassocier de façon.
Un nucléotide (le dUTP) est intégré par voie chimique couplé à de la biotine dans un fragment
d’ADN utilisé comme sonde marquée, une fois dénaturée, cette sonde est hybridée sur des
préparations chromosomiques, elles aussi préalablement dénaturées, la sonde est révélée par
des anticorps anti-biotine couplés à un fluorochrome, le FITC. Grâce à un microscope qui émet
un faisceau lumineux excitant le FITC, les chromosomes sont visualisés directement par la
localisation de la sonde. C’est le principe de l’hybridation in situ fluorescente, permettant
l’observation de loci sur des métaphases ou des noyaux, d’où le terme in situ (à la différence
du Southern blot qui est l’hybridation d’une sonde sur de l’ADN fixé sur une membrane de
nylon). L’utilisation de plusieurs fluorochromes et de filtres microscopiques idoines ainsi que
le développement de système de numérisation des signaux fluorescents ont permis d’hybrider
plusieurs sondes de façon concomitante. Grâce à ces progrès, il est possible aujourd’hui
d’étudier de façon simultanée plus de 20 loci sur des chromosomes.

Figure 4. Fluorescence de sondes sur chromosomes métaphasiques

A/ Sondes centromériques : en rouge, sonde centromérique du chromosome 8, en vert sonde

centromérique du chromosome 17.
B/ Sondes spécifiques de loci : en rouge sonde télomérique du chromosome 12, en vert sonde
télomérique du chromosome 8.
 IV-2. Les techniques d’hybridation moléculaires non ciblées :

Lorsque l’ADN cible contient une mutation pas encore identifiée, l’analyse moléculaire se
limite à la recherche de la présence ou de l’absence de cette mutation sans définir la séquence
en nucléotides. Les techniques qui permettent de mettre en évidence la présence ou l’absence
d’une mutation inconnue sont dites techniques de balayages. Parmi celles-ci, il y a
l'électrophorèse sur gel en gradient dénaturant ou DGGE (pour denaturing gradient gel
electrophoresis) et le polymorphisme de conformation des simples brins ou SSCP (pour single
strand conformation polymorphism).

IV-2.1. L’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant ou DGGE :

Cette méthode est basée sur la différence de mobilité électrophorétique entre deux
molécules d’acides nucléiques qui diffèrent par une variation de séquence.

La mobilité électrophorétique d'un fragment d'ADN double brin dans un gel de

polyacrylamide est affectée par la séparation partielle de ses deux brins. Une molécule
composée en partie de la double hélice classique et en partie de deux simples brins est
fortement ralentie par rapport à une molécule double brin ou complètement dénaturée.
Dans des conditions dénaturantes (urée-formamide), le Tm du double brin d’ADN dépend
de la séquence et la mobilité électrophorétique sera d’autant réduite qu’il atteindra le Tm
tôt lors de la migration. Après amplification PCR des régions susceptibles de contenir une
mutation, l'ADN de ces fragments migre dans un gel d'acrylamide où il rencontre des
conditions de plus en plus dénaturantes (gradient en acrylamide). Cependant, si le
gradient augmente de façon linéaire, la dénaturation de l'ADN, elle, ne se fait pas de façon
progressive tout au long de la molécule, mais de domaine en domaine, qui s'ouvrent plus ou
moins rapidement, en fonction de leur composition en bases AT et GC. La stabilité de
chacun des domaines dépend de la structure primaire de la molécule. Deux molécules
dont les séquences ne différeront que d'une paire de base pourront donc ne pas s'ouvrir
au même moment et migreront alors différemment à travers un gradient précis.
 Figure 5. Principe de la DGGE

IV-2.2. Le polymorphisme de conformation des simples brins ou SSCP :

La technique est basée sur la capacité du simple brin d’ADN de pouvoir prendre dans des
conditions NON dénaturantes différentes conformations 3D selon la séquence de départ. Deux
brins ADN différents en structure primaire adopteront des structures spatiales différentes, ce
qui se traduit en une différence de mobilité électrophorétique. Après dénaturation thermique
des fragments ADN amplifiés, on procède à un refroidissement brusque, pour que les molécules
restent monocaténaires et adoptent les conformations les plus stables pour chacune d’entre elles.
Les profils de migration en gel d’acrylamide non dénaturant sont comparés en partant de l’idée
qu’une différence de migration signifie une différence de séquence et par conséquent un
polymorphisme ou une mutation.
Figure 6. Principe du SSCP