ANNEE

2021-2022
UIACSS / FACULTE DE PHARMACIE
Année Universitaire 2018-2019
TRAVAUX PRATIQUES : BIOLOGIE MOLECULAIRE ET
GENETIQUE MODULE BIOTECHNOLOGIE MOLECULAIRE

Pr. EL FAHIME & Pr. BOUHOUCHE

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 Génétique du Gout amère

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Objectifs :
En complément des informations théoriques reçues durant les cours de Biologie moléculaire et
de génétique, les TP permettront aux étudiants de s’initier aux outils de biologie moléculaire et leurs
applications en génétique. La génétique du gout amer sera étudiée comme exemple à l’aide du Kit conçu
par l’institut Karolina aux États-Unis.

Introduction : Contexte scientifique

1. LE GOÛT, C’EST D’ABORD UNE AFFAIRE DE GÈNE. Aimez-vous le brocoli ? Le PTC ?
En 1931 le chimiste Arthur L. Fox découvre que la molécule sur laquelle il travaille,
le PhénylThioCarbamide (PTC) (un composé amer produit entre autres par le brocoli), a un goût très
amer pour certaines personnes, aucun goût pour d’autres, dont lui-même. L’un de ses collègues se plaint
de l’amertume du produit alors que lui-même ne sent rien. Il est ainsi le premier à mettre en évidence la
différence de sensibilité au PTC au sein de la population. En 1930, Albert Blakeslee chercheur au
« Cold Spring Harbor Laboratory », démontre pour la première fois le caractère héréditaire de
l’incapacité à sentir le gout amer et qu’en Amérique environ 75% des gens sont gouteurs et 25% non
gouteurs.
A partir de cette observation, de très nombreuses études sont menées. La sensibilité des populations est
très inégalement répartie selon les continents :

PhénylThioCarbamide (PTC)

Carte mondiale de la sensibilité des populations humaines au PTC d’après S. Wooding)

2. UN GÈNE POUR LE GOUT DU PTC.

Un gène pour le récepteur de PTC a été́ identifié en 2003 et nommé TAS2R38. Il mesure 1002
pb (paires de bases). Il existerait 7 allèles dans le monde (allèles = formes différentes d’un gène), mais
seuls 2 d’entre eux sont répandus en Amérique : un allèle goûteur et un allèle non goûteur qui diffèrent
par 3 mutations aux positions 145, 785 et 886. Dans ce TP, seule la mutation 145 sera utilisée pour
distinguer les allèles goûteur avec un C et non-gouuteur avec un G (Fig.1).

On soupçonne que notre sensibilité́ au PTC soit sous contrôle polygénique, c’est-à-dire que plusieurs
paires de gènes seraient impliquées. Cependant, le gène TAS2R38 serait le principal responsable des
variations observées dans la population [1].

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Le gout, pas juste une affaire de gène... La perception des saveurs est très complexe et plusieurs facteurs
interviennent, tels que l’influence de l’odorat, les mécanismes cérébraux, les différences culturelles, ou
simplement le nombre de papilles gustatives qui peut varier d’un individu à l’autre ! Le sexe pourrait
aussi intervenir puisque c’est souvent chez les femmes qu’on trouve des « super goûteuses» [2].
Trois variant ponctuels de l’ADN (=SNP, Single Nucleotide Polymorphism) ont été identifiés dans ce
gène : Les individus « sensibles » (allèle T+ ; homozygotes ou hétérozygotes) peuvent détecter le goût
amer du PTC ; les individus « non sensibles » (allèle t-; homozygotes) ne peuvent pas détecter le goût
amer du PTC .
Position du Changement Changement Changement d’acide Position de l’acide
nucléotide de nucléotide de codon aminé aminé

145 C -> G CCA -> GCA Proline -> Alanine 49

785 C -> T GCT -> GTT Alanine -> Valine 262
886 G -> A GTC -> ATC Valine -> Isoleucine 296

L’allèle conduisant à la combinaison d’acides aminés Proline-Alanine-Valine (PAV) est celui qui
confère la sensibilité. L’allèle conduisant à la combinaison Alanine-Valine-Isoleucine (AVI) produit un
récepteur membranaire qui ne fixe plus le PTC. Par commodité ces allèles sont donc
dénommés PAV et AVI. Ces deux allèles sont très largement majoritaires dans la population.
Remarque : il existe 3 autres combinaisons connues, et donc 3 autres allèles, mais elles sont très peu
fréquentes. Ces combinaisons d’acides aminés sont AAV, AAI et PVI. Cela fait donc en tout 5 allèles
connus à ce jour pour le gène TAS2R38. On soupçonne que notre sensibilité au PTC soit sous contrôle
polygénique, c’est-à-dire que plusieurs paires de gènes seraient impliquées. Cependant, le gène
TAS2R38 serait le principal responsable des variations observées dans la population [2].
Le goût, pas juste une affaire de gène… La perception des saveurs est très complexe et plusieurs
facteurs interviennent, tels que l’influence de l’odorat, les mécanismes cérébraux, les différences
culturelles, ou simplement le nombre de papilles gustatives qui peut varier d’un individu à l’autre ! Le
sexe pourrait aussi intervenir puisque c’est souvent chez les femmes qu’on trouve des «super
goûteuses».

3. GÉNOTYPE VS PHÉNOTYPE.
Nous venons au monde avec un bagage de gènes donnés, c’est notre génotype [3; page.303]. Les gènes
sont reçus en deux versions, l’une maternelle, l’autre paternelle. Lorsqu’un individu reçoit 2 allèles
identiques du gèneTAS2R38, on dit qu’il est « homozygote ». Le caractère héréditaire observé, le «
phénotype », est bien sûr celui porté par les allèles : l’individu est goûteur ou non-goûteur. Mais quel
sera le phénotype d’un individu « hétérozygote », c'est-à-dire un individu qui hérite deux allèles
différents ?
Ø Dans un cas de dominance complète, l’hétérozygote présente un phénotype correspondant à celui
de l’allèle dit « dominant ». L’allèle qui ne se manifeste pas est dit « récessif ».
Ø S’il s’agit d’un cas de dominance incomplète, l’hétérozygote présente un phénotype intermédiaire
entre ceux des homozygotes [3;p.309]; il sera alors semi-goûteur ou «goûteur faible».

4. QUESTION EXPÉRIMENTALE.
Puisque nous possédons maintenant les moyens techniques d’analyser notre ADN et nos gènes, nous
pouvons énoncer la question expérimentale suivante : l’interaction entre les deux allèles se
rapproche-t-elle d’une dominance complète ou incomplète ? En termes de résultats attendus, la
question peut s’énoncer ainsi : Les étudiants hétérozygotes possédant un allèle goûteur et un allèle non-
goûteur du gène TAS2R38 auront-ils un phénotype « goûteur fort » de PTC, «non-goûteur», ou un
phénotype intermédiaire «goûteur faible»?

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DÉMARCHE GÉNÉRALE PROPOSÉE
Au cours de ces TP, nous tenterons de répondre à la question posée en suivant la démarche suivante
(Fig.2) :
1. D’abord une dégustation de PTC, pour déterminer le phénotype de chacun. Qui est goûteur ? Non-
goûteur ? Y-a-t-il des « goûteurs faibles » ?
2. Ensuite une analyse d’ADN, pour déterminer le génotype de chacun : homozygote ou hétérozygote
? (Un seul étudiant expérimentateur par équipe)
3. Enfin, une analyse croisée des résultats pour déterminer le type de dominance, complète ou
incomplète, selon le phénotype observé chez les hétérozygotes. Les homozygotes, goûteurs et non-
goûteurs, constituent un groupe témoin servant à valider la méthode d’analyse, puisque leur
phénotype devra nécessairement correspondre à leur génotype, en toute logique.

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DÉMARCHE DÉTAILLÉE DE L’ANALYSE D’ADN
Voici la « Vue d’ensemble »

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PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL.
1. DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE
SEANCE 1 : EXTRACTION DE L’ADN

A- PRINCIPE
Des cellules buccales sont d’abord recueillies par rinçage vigoureux avec une solution saline.
L’ADN est ensuite extrait des cellules par ébullition en présence d’une résine ; celle-ci sert à
éliminer les cations bivalents (ex : Ca++) nuisibles à l’enzyme « ADN polymérase » utilisée à la
prochaine étape. L’ADN est quantifié par spectrophotomètre (Nanodrop)

B- PROCEDURE EXPERIMENTALE
1) Se rincer vigoureusement la bouche avec 10 ml de saline pendant 1 minute afin de faire décoller
des cellules buccales. Rejeter dans le même petit contenant («shooter»).
2) Transférer 1000 μl dans un microtube de 1,5 ml. Refermer et écrire votre ID sur le couvercle.
3) Centrifuger à vitesse maximale pendant 2 minutes.
4) Après la centrifugation, observer un culot au fond du microtube (correspond aux cellules) et
rejeter délicatement le surnageant par une simple inversion au-dessus d’un évier.
NB : il faut qu’un peu de liquide (~0,1 ml) reste dans le microtube avec le culot.
De manière à doubler l’extraction d’ADN, répéter les étapes 2 à 4 en réutilisant le même microtube.
Pendant la 2ème centrifugation, pipeter 100 µl de résine Chelex dans un microtube de 0,5 ml Important : juste
avant de prélever la résine, bien la suspendre en aspirant-rejetant plusieurs fois. Réserver pour l’étape #6.
5) Resuspendre le culot en aspirant et rejetant délicatement (4-5 fois) avec une micropipette de 30 μl.
6) Transférer 30 μl de suspension dans le microtube contenant la résine. Fermer et identifier.
Mélanger au Vortex.
7) Porter à ébullition pendant 10 min. (thermocycleur à 99°C)
8) Agiter vigoureusement pendant 5 secondes.
9) Centrifuger à vitesse maximale pendant 90 secondes pour faire précipiter la résine au fond du
microtube.
10) Transférer 30 µl de surnageant (sans culot ni résine) dans un nouveau microtube de 1,5 ml.
Identifier et conserver sur glace. C’est l’extrait d’ADN.

Étape : Dosage de l’ADN au Nanodrop :

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 SEANCE 2 : AMPLIFICATION DU FRAGMENT D’ADN CONTENANT LE SNP

A- PRINCIPE

Objectifs. L’amplification en chaîne par polymérase (PCR) nous

permet d’atteindre 2 objectifs :
1) Cibler une région précise de l’ADN : ici la région de la
mutation 145 du gène TAS2R38.
2) Faire de multiples copies (ou « réplicons ») de cette région
pour pouvoir l’analyser.

è Chez un homozygote, toutes les copies obtenues seront
identiques
è Chez un hétérozygote, on aura 2 types de copies qui
diffèrent par une seule lettre, C ou G

• Étapes. La PCR s’effectue dans un thermocycleur (petit four
à température programmable) en 3 étapes (Fig.3) :
1) Dénaturation à 94°C : à cette température, l’agitation
moléculaire l’emporte sur les liaisons H de l’ADN et les
brins d’ADN se séparent.
2) Hybridation à 68°C; l’agitation diminue et les brins d’ADN tendent à se lier, mais les amorces, plus
concentrées, prennent de vitesse l’ADN chromosomique. Elles se fixent au début et à la fin de la
région ciblée grâce à la complémentarité des bases azotées. Pour cibler la région de la mutation 145,
nous utilisons une « amorce-début (F ou sens)» de 44pb, complémentaire à la région 101-144 du
gène, et une «amorce-fin (R ou antisens)» de 24pb, complémentaire à la région 297-320 (Fig.4)
Amorce F (Début) : 5’-CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG 3’
Amorce R (Fin) : 5’-AGGTTGCTTGGTTTGCAATCATC-3’

3) Élongation à 72 °C; à partir des amorces, l’enzyme ADN polymérase Taq ajoute les nucléotides
complémentaires. Cet enzyme est extrait de la bactérie Thermophilus aquaticus vivant dans des eaux
thermales et il est activé à la température de 72°C.
Chacune de ces 3 opérations ne dure que 30 secondes mais elles sont répétées plusieurs fois, de telle
sorte qu’au bout de 30 cycles on obtient 1 073 741 824 réplicons de la région ciblée : la région 101 à
320 du gène TAS2R38, mesurant 220 pb (Fig.4). Attention, un hétérozygote présentera deux types de
réplicons qui diffèrent uniquement à la position 145.

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Astuce de l’amorce-début.
Normalement, les nucléotides d’une amorce sont
identiques à ceux du gène. Ici, l’amorce-début diffère
à la position 143 : elle contient un G au lieu d’un A.
Cette « erreur » vise à introduire le doublet GG devant
la mutation 145. Ainsi, les réplicons obtenus par PCR
contiendront en positions 143-146 les séquences
GGCC pour l’allèle goûteur ou GGGC pour le non-
goûteur (Fig.5). Ces deux séquences sont essentielles
au bon déroulement de la prochaine étape.

B- PROTOCOL EXPERIMENTAL
1- Prendre un tube PCR contenant du Ready-To-Go PCR bead. Marquer le tube avec vos initiales.
2- Utiliser une micropipette et ajouter au tube 22.5 ml du Mix PTC primer/loading dye
3- Ajouter 2.5 de votre ADN des cellules buccales (Etape I) directement dans le mix primer/loading dye.
Assurez-vous que vous avez entièrement vider le volume de l’ADN.
4- Mettre votre échantillon dans la glace jusqu’à ce les autres soient est prête pour démarrer le
programme PCR.
5- Placer votre tube, avec ceux des autres étudiants, dans le thermocycler qui a été programmé pour 30
cycles du profile suivant :

Phases Température Temps Cycles

Dénaturation 94°C 30 secondes

X 30
Hybridation 64°C 45 secondes

Extension 72°C 45 secondes

Attente 4°C ∞

PS : Faire 35 cycles si vous allez marquer avec « CarolinaBLU ».

6- A la fin de la PCR, stocker votre ADN amplifié dans la glace ou à - 20°C jusqu’à ce que vous êtes
prêts de continuer l’Etape III.

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 SEANCE 3 : DIGESTION ENZYMATIQUE ET DETERMINATION DU PHENOTYPE

A- PRINCIPE
Objectif : couper l’allèle goûteur de manière à pouvoir le distinguer de l’allèle non-goûteur.
Les réplicons sont incubés en présence de l’enzyme de restriction HaeIII (extrait de la bactérie
Haemophilus aegypticus). Cet enzyme coupe l’ADN par hydrolyse au milieu d’une séquence GGCC.
Cette séquence se trouve aux positions 143-146 de l’allèle goûteur ! Ce dernier est alors coupé en 2
fragments de 44pb et 176pb (Fig. 6). Par contre, l’allèle non goûteur présente la séquence GGGC et ne
peut être coupé par l’enzyme.
NB. En guise de groupe témoin, des réplicons ne seront pas traités avec l’enzyme.

B- DIGESTION AVEC L’ENZYME DE RESTRICTION HAEIII
1) Centrifuger 10 secondes le tube PCR puis,
- Transférer 10 µl dans un 1er microtube de 0,5 ml. Identifier « N » (témoin non-digéré) et # d’équipe.
- Transférer à nouveau 10 µl dans un 2ème microtube de 0,5 ml; identifier « D » (digéré) et # d’équipe.
2) Ajouter 1 µl d’enzyme HaeIII au microtube « D » seulement ; observer une microgoutte sur la paroi
du tube.
3) Centrifuger les 2 tubes pour faire descendre les gouttes au fond des tubes (vitesse maximale, 10
secondes).
4) Incuber les 2 tubes à 37°C pendant 30 minutes, dans le thermocycleur. (30 min/durée minimale)

C- DÉTERMINATION DU PHÉNOTYPE
Goûteur fort ? Non-goûteur ? Goûteur faible ? Il est parfois difficile d’évaluer objectivement le goût de
chacun. Cette partie du protocole comporte une bonne part de subjectivité et on devra en tenir compte
dans l’analyse des résultats. Par exemple, si on distingue des goûteurs forts et des goûteurs faibles, est-
ce vraiment relié à une dominance incomplète ou simplement dû à divers facteurs influençant la
perception des saveurs ?
Chaque équipe se voit attribuer un numéro. Dans chaque équipe il y a un étudiant « A » et un étudiant
«B». Les 2 étudiants détermineront leurs génotypes à partir de leurs cellules buccales. On inscrira donc
au tableau des résultats les numéros 1A, 1B, 2A, 2B, etc.
1) Goûter une languette contrôle (sans PTC) en l’humectant bien au milieu de la langue pendant 10
secondes.
2) Goûter de la même manière une languette imbibée de PTC. Y-a-t-il une différence ? Si un goût amer
est perçu, est-il « fort » ou « faible » ?
3) Inscrire au Tableau 1 (voir « résultats ») les numéros de chacun des étudiants dans un des 3 groupes
: goûteur fort, goûteur faible ou non-goûteur.

Tableau 1. Reporter votre phénotype sur le tableau suivant en indiquant votre identifiant
PHÉNOTYPE (Identifiant : ………………….)
Goûteur fort Goûteur faible Non goûteur

UIACSS/FPA- 2ème année/ Module Biotechnologie Moléculaire : Pr . EL FAHIME & Pr. BOUHOUCHE.
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 SEANCE 4 : ELECTROPHORESE ET DETERMINATION DU GENOTYPE

A- PRINCIPE

Objectif : séparer et visualiser les deux types d’allèles.

• Les fragments d’ADN sont placés dans un gel d’agarose et soumis à un courant électrique.
Puisque l’ADN porte des charges négatives (-), les fragments sont entraînés vers l’électrode
positive (+) et ce, à différentes vitesses, les plus petits se déplaçant plus rapidement à travers le
gel. Une fois la migration terminée, un colorant fluorescent sous UV permet de visualiser les
bandes d’ADN (Fig. 7).

• La position des fragments est évaluée à l’aide d’un marqueur comportant des brins de dimension
connue ; la bande de 500pb est plus brillante et sert de repère. L’allèle non-goûteur n’est pas
coupé et ne présente qu’une seule bande de 220pb, alors que l’allèle goûteur est coupé et présente
2 bandes distinctes de 176pb et 44pb.

B- PROTOCOL EXPERIMENTAL
1) Ajouter 5 µl de colorant de chargement à chacun des tubes «N» et «D». Centrifuger pour mélanger
(10 sec.).
2) Technicienne : charger un marqueur d’ADN « 100pb DNA Ladder » dans le puits #1 du gel
d’agarose 2%.
3) Charger 15 µl des tubes «N» et «D» dans les puits d’un gel d’agarose 2% (Fig.8). Noter les # des
puits (Fig.9).
Le gel contient un colorant potentiellement cancérigène. On portera des gants à la station
d’électrophorèse.
4) Faire migrer à 130 V pendant 30-40 minutes ou jusqu’à une migration de 5 cm du colorant de
chargement.
5) Observer les résultats aux UV et prendre une photo.

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 C- DETRMINATION DU GENOTYPE
Observation sous UV :
• Attention ne pas s’exposer aux UV, ils peuvent endommager les yeux !
• Visualiser les fragments d'ADN amplifiés sous lumière ultraviolette (d'un dispositif
d'éclairage par transillumination). Vérifier par rapport au marqueur de poids
moléculaire que la taille du produit de PCR en bp est bien celle attendue.
• Prendre une photo de résultat de votre gel et la coller à l’emplacement ci-dessous.

REFERENCES BIBLIOGRAGRAPHIQUE
[1] M. Saint-Hilaire, «Génome gourmand,» Québec Science, pp. 28-30, sept 2007.
[2] S. Wooding, «Phenylthiocarbamide: A 75-Year Adventure in Genetics and Natural Selection,» Genetics,
2015. [En ligne]. URL: http://www.genetics.org/content/172/4/2015.full . Page consultée le 9 octobre 2017.
[3] « People differ in their taste sensitivity » Taste Science Lab, 2015. [En ligne]. URL:
http://www.tastescience.com/abouttaste3.html . Page consultée le 9 octobre 2017.
[4] J. Reece et coll, Campbell Biologie, 4e éd., Montréal: ERPI, 2012, 1458 p.
[5] «La PCR?,» Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative, 2015. [En ligne].
URL: http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm . Page consultée le 9 octobre 2017.
Ce TP a été mis au point à partir du protocole suivant: CAROLINA Cie, Page consultée le 02/10/2015, Using a
Single-Nucleotide Polymorphism to predict Bitter-Tasting Ability,
[En ligne], URL: http://bioinformatics.dnalc.org/ptc/animation/index.html

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