USTHB/FSB-M1PCP 2023/2024 Le 18-02-2024

MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene

Faculté des Sciences Biologiques

Groupe : 01

Sous-Groupe : 02

MASTER 01 PHYSIOLOGIE CELLULAIRE ET PHYSIOPATHOLOGIE

TP 01 : Dosage des acides aminés et des protéines par deux techniques colorimétriques
La Ninhydrine et Le Bradford

NOM ET PRENOM :

YEDDOU Imene 191931062765

Medriss Isma Chanez 191931084745

Bacha Maria 191931090571

Merar Nour el Imen 202031063379

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Les acides aminés, constituants fondamentaux des protéines, jouent un rôle crucial dans
divers processus métaboliques essentiels à la survie des organismes vivants , ces derniers
possède une fonction acide carboxylique (-COOH) et une fonction amine (-NH2) comme son
nom l’indique.

Objectif :
L'objectif de cette séance de travaux pratiques est d'établir la présence ou l'absence d'acides
aminés et de protéines dans un milieu biologique en utilisant deux techniques colorimétriques
: la réaction à la ninhydrine et la méthode du Bradford.

A. DOSAGE A LA NINHYDRINE :

1. Principe de la réaction a la ninhydrine:

Cette méthode colorimétrique, qualifiée de "qualitative", est utilisée pour mettre en évidence
les acides aminés et les protéines grâce à l'action de la ninhydrine (2,2-dihydroxyindan-1,3-
dione), un puissant agent oxydant agissant comme révélateur et détecteur. Lors de cette
réaction, la ninhydrine forme un complexe coloré avec les acides aminés et les protéines. Plus
précisément, elle réagit en premier lieu avec les amines primaires contenant un groupement
aminé et un groupement carboxylique libre. Cette réaction aboutit généralement à une
coloration violette caractéristique, connue sous le nom de pourpre de Ruhemann, et se déroule
en deux étapes principales :

• 1ére étape :

2 Ninhydrine + AA désamination et décarboxylation simultanée de l'acide

aminée, et libère l’aldéhyde correspondant, l’ammoniac et le gaz
carbonique.
➢ La ninhydrine subit ainsi une réduction.

• 2éme étape:
L’ammoniac réagit avec l’hydrindantine et une autre molécule de ninhydrine
pour donner un compose bleu-violacé avec une densité optique égale a 570nm
pourpre de Ruhemann
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Cependant, dans le cas de la proline, sa structure particulière, caractérisée par un groupement

amino-secondaire cyclique ou engagé, réagit également avec le réactif. Cette réaction conduit
à la formation d'un dérivé de coloration jaune avec la ninhydrine, qui peut être mesuré à une
longueur d'onde de 440 nm. Cette coloration jaune est le résultat d'une réaction partielle,
attribuable à la présence de sa fonction amine secondaire.

2. Protocole expérimental :

2.1. Échantillon :
➢ Une solution d'alanine à 0,5%
➢ Une solution de glutamate à 0,5%
➢ Une solution de blanc d'œuf dilué au 1/50 dans de l'eau physiologique
➢ Un blanc

2.2. Réactifs :
• La Ninhydrine à 1% dans de l’éthanol ou acétone

2.3. Mode Opératoire :

Blanc Tube N°1 Tube N°2 Tube N°3
Alanine 0 1mL 0 -
Glutamate 0 0 1mL -
Blanc d'œuf 0 0 0 1mL
Eau 1mL 0 0 0
Physiologique
Ninhydrine 5gouttes 5 gouttes 5 gouttes 5 gouttes
Porter au bain Marie pendant 10min
2.4. Résultat et Interprétation :
TUBE Blanc Tube N°1 Tube N°2 Tube N°3
COLORATION Transparent Bleu Clair Bleu Clair Bleu foncé
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INTERPRETATION :
Les résultats obtenus dans les tubes mentionnés sont issus d'un traitement avec différents
réactifs. Le tube 1 contient 1 ml de solution de blanc, le tube 2 contient 1 ml d'alanine, le tube
3 contient 1 ml de glutamate, et le tube 4 contient 1 ml de blanc d'œuf, auxquels 5 gouttes de
ninhydrine ont été ajoutées. Après chauffage à 100°C au bain-marie pendant 10 minutes, des
différences significatives de couleur ont été observées.
Dans le tube 1, aucun changement de couleur n'est observé, la solution reste transparente
(réaction négative). Cela indique l'absence d'acides aminés ou de protéines, ce qui signifie
également l'absence de groupements aminés ou carboxyliques libres nécessaires pour que la
ninhydrine réagisse. Par conséquent, il n'y a pas de réaction de désamination ou de
décarboxylation simultanée des acides aminés, et aucun complexe bleu-violacé n'est formé.
Dans le tube 2, bien qu'il contienne de l'alanine, aucun changement de couleur vers un bleu
clair n'est observé, indiquant une réaction négative. Cela suggère une absence de réaction
avec la ninhydrine, malgré la présence d'un acide aminé.
Dans le tube 3, un changement de couleur vers un bleu clair est observé (réaction positive),
ce qui indique la présence d'un acide aminé. La ninhydrine a réagi avec un groupement aminé
libre par désamination simultanée de l'acide aminé, conduisant à la formation du complexe
bleu violacé.
Dans le tube 4, un changement de couleur vers un bleu foncé est observé (réaction positive),
indiquant la présence de plusieurs acides aminés (polypeptides). La ninhydrine a réagi avec
plusieurs groupements aminés libres par désamination simultanée, formant plusieurs
complexes bleu-violacés, ce qui donne cette couleur bleu foncé.

B. DOSAGE PAR LE BRADFORD :

1. Principe de la méthode de Bradford :

Le dosage de protéines Bradford est une méthode colorimétrique largement utilisée pour
quantifier la concentration totale en protéines (méthode qualitative). Cette méthode repose sur
la formation d'un complexe entre les résidus d'acides aminés basiques et aromatiques avec le
colorant Coomassie bleu brillant G-2S. En milieu acide, la forme anionique du bleu de
Coomassie G250 interagit (par des liaisons non covalentes, c'est-à-dire par adsorption) avec
les radicaux aromatiques des acides aminés constitutifs des protéines, ce qui conduit à la
formation d'un complexe coloré en bleu. Ce complexe présente une absorption maximale à
595 nm.
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2. Protocole expérimentale :

2.1. Échantillons :
➢ Une solution d'alanine à 0,5%
➢ Une solution de glutamate à 0,5%
➢ Une solution de blanc d'œuf dilué au 1/50 dans de l'eau physiologique
➢ Un blanc

2.2. Réactifs :
• La solution de Coomassie G250 est préparée en dissolvant 0,1 g de bleu de Coomassie
G250 dans 50 mL d'éthanol à 95% dans un flacon sombre. Ensuite, 100 mL d'acide
phosphorique (H3PO4) sont ajoutés, et le volume total est complété à 1000 mL avec de
l'eau distillée. La solution est ensuite conservée dans un flacon sombre à une
température de 4°C pendant un mois.

2.3. Mode Opératoire :

Blanc Tube N°1 Tube N°2 Tube N°3

Alanine 0 500μL 0 -
Glutamate 0 0 500μL -
Blanc d'œuf 0 0 0 500μL
Eau
Physiologique 500μL 0 0 0
Bradford 1mL 1mL 1mL 1mL
Portez à l’obscurité pendant

2.4. Résultat et Interprétation :

Tube Blanc Tube N°1 Tube N°2 Tube N°3

Bleu
Coloration Transparent Bleu foncé Bleu foncé Bleu Foncé
couleur du
réactif

DO échantillon 00 0,116 0,071 0,148

Tracer tracer la gamme étalon à partir du tableau ci-dessous et déterminer la

concentration dans le Tube N°3
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N° de 1 2 3 4 5 6
Tube
DO à 595 0,13 0,4 0,48 0,85 0,95 1
nm

INTERPRETATION :

Le dosage par étalonnage repose sur l'utilisation de solutions étalons contenant l'espèce
chimique à doser à différentes concentrations connues. Il suppose également que la
concentration de l'espèce chimique influence une grandeur physique, telle que l'absorbance ou
la conductivité, mesurable. Pour ce faire, on utilise des valeurs dépendantes de la
concentration. Ensuite, on compare les propriétés physiques de l'échantillon à la même
propriété physique pour une gamme étalon.

➢ Pour réaliser ce dosage, on utilise une solution de concentration connue d'une protéine
considérée comme une référence ou un standard par rapport à la protéine dont on veut
déterminer la concentration. Par exemple, une solution mère de sérum albumine
bovine (BSA) à 0,1 % peut être utilisée comme référence.
➢ On prépare également une solution de la protéine dont on veut déterminer la
concentration. En comparant les propriétés physiques de cette solution avec celles des
solutions étalons, on peut alors déterminer la concentration de la protéine dans
l'échantillon.

❖ Traçage de la gamme étalon :

Pour tracer la gamme étalon de l'absorbance (DO) en fonction de la concentration de BSA

(albumine sérique bovine), il est nécessaire de calculer la concentration réelle de BSA dans les
solutions étalons.
Pour cela, on peut utiliser la formule de dilution :
C1×V1=C2×V2

• C1 est la concentration initiale de la solution mère de BSA (0,1 % ou 0,1 g/100 mL),
• V1 est le volume de la solution mère de BSA utilisé pour préparer la solution étalon,
qui est de 5μL
• C2 est la concentration recherchée de BSA dans la solution étalon (exprimée en
g/mL),
• V2 est le volume total de la solution étalon, 1500μL (dans chaque tube ; 1mL du
réactif de Bradford + 0,5 mL l’échantillon Ala, Glu, BO)
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• Les Calculs :

Tube 1 : C2 = 0,1% × 5μL/1500μL = 0.00033%

Tube 2 : C2 = 0,1% × 10μL/1500μL = 0.00066%
Tube 3 : C2 = 0,1% × 15μL/1500μL = 0.001%
Tube 4 : C2 = 0,1% × 20μL/1500μL = 0.00133%
Tube 5 : C2 = 0,1% × 25μL/1500μL = 0.00166%
Tube 6 : C2 = 0,1% × 30μL/1500μL = 0.002%

Tube 1 2 3 4 5 6
DO à 0.13 0.4 0.48 0.85 0.95 1
595nm
[BSA] (%) 0.00033 0.00066 0.001 0.00133 0.00166 0.002
Traçage de la gamme d’étalon représentant DO=f [BSA]

Courbe étalon des DO en Fonction de la concentration de BSA

- On obtient une droite qui démarre par l’origine

Blanc Alanine Glutamate Blanc d’œuf

DO 00 0.0116 0.071 0.148
−4 −4
[PROT]% 0% 2.09 × 10 % 1.28 × 10 % 2.67 × 10−4 %

Par extraction :
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On a :
Y= a.X DO = CST [BSA]
DO = 555.05[BSA] [BSA] = DO/555.05
Donc :
Tube 1 : Blanc [prot]= 0/555.05 = 0% (absence de protéine )
Tube 2 : Alanine [prot]= 0.116/555.05 = 2.09 × 10−4 %
Tube 3 : Glutamate [prot]= 0.071/555.05 = 1.28 × 10−4 %
Tube 4 : Blanc d’œuf [prot]= 0.148/555.05 = 2.67 × 10−4 %

Sachant que :

0.1%= 0.1 pour 100mL

= 100mg pour 100mL
= 1mg pour 1mL
= 1000µg pour 1mL = 1000µg/mL donc :
Tube 1 = [Prot] blanc = 0 µg/Ml (absence d'acides aminés et de protéines)
Tube 2 = [Prot] Alanine = 0.209 µg/mL (présence des acides aminés)
Tube 3 = [Prot] Glutamate = 0.128 µg/mL (présence des acides aminés)
Tube 4 = [Prot] Blanc d’œuf = 0.267 µg/mL (présence des acides protéines)