USTL – LICENCE SCIENCES ET TECHNOLOGIES B (L1 S2)

Biochimie 1 : Molécules du Vivant - Travaux Pratiques

Le port des lunettes de protection est obligatoire pour toutes les manipulations. Les lunettes et
propipettes empruntées en début de TP sont à rendre impérativement en fin de séance.

TP1 : Etude des Glucides

I – PRESENTATION, CONSIGNES ET DEMONSTRATION
Présentation de la vaisselle ; Règles de laboratoire et Consignes de sécurité
Utilisation du matériel : propipette, pipette automatique, balance, spectrophotomètre,
distributeur, agitateur magnétique
Démonstration de la préparation de la solution de Glucose à 1g/L (solution étalon du dosage)
avec pesée et préparation en fiole jaugée (100 mL).

II - DOSAGE DU GLUCOSE PAR LA GLUCOSE-OXYDASE

Principe :
Une solution de glucose de concentration inconnue est dosée par la méthode à la glucose-oxydase
(méthode couramment employée pour le dosage de la glycémie) à l’aide d’une solution étalon à 1 g/L.
Le schéma réactionnel du dosage est le suivant :
(1) Glucose + O2 → Acide gluconique + H2O2
(2) 2 H2O2 + phénol + amino-4-antipyrine → quinone-imine + 4 H2O

La réaction (1) est catalysée par la glucose-oxydase ; la réaction (2) utilise la peroxydase. L’intensité de
la coloration obtenue est mesurée au spectrophotomètre à 505 nm.

Manipulation :
La solution étalon de glucose à 1 g/L est préparée en démonstration pour l’ensemble du groupe.
Le réactif de dosage est disponible en distributeur. Sa composition est la suivante :
Tampon phosphate pH 6,6…………225 mM
Amino-4-antipyrine…………………0,3 mM
Phénol……………………………….8,5 mM
EDTA…………………………………5 mM
Peroxydase……………………...> 300 U.L-1
Glucose-oxydase…………….> 10 000 U.L-1

Chaque binôme dispose d’une solution de glucose à doser (échantillon X). Réaliser le dosage dans des
tubes à hémolyse en plastique selon le tableau suivant (les volumes en µL sont prélevés à l’aide d’une
pipette automatique):

Tube 1 : Blanc réactif Tube 2 : Etalon Tube 3 : Dosage

Eau distillée 10 µL - -
Solution étalon - 10 µL -
Echantillon X - - 10 µL
Réactif 1 mL 1 mL 1 mL

Mélanger, incuber 20 min à température ambiante (la coloration est stable environ 1h).
Lire l’absorbance à 505 nm contre le blanc réactif, à l’aide d’une microcuve.

Résultats :
Par comparaison des absorbances, déterminer la concentration en glucose de l’échantillon inconnu.
III – HYDROLYSE DE L’AMIDON
Principe :
L’amidon est un homopolyoside composé de molécules de glucose unies entre elles par des liaisons
-1,4 et -1,6 (pour les points de branchement).
L’amidon est insoluble dans l’eau froide mais donne un empois dans l’eau chaude. Avec une solution
d’iode, l’amidon donne une coloration bleue.
L’-amylase est une enzyme hydrolysant l’amidon en donnant des dextrines. La coloration obtenue par
fixation d’iode sur les dextrines est fonction de la longueur des chaînes de glucose. Ainsi on peut suivre
l’évolution de l’hydrolyse enzymatique de l’amidon grâce à une gamme de coloration avec l’iode (bleu-
rouge-jaune).

Préparation de l’empois d’amidon :

Ce protocole permet la préparation de l’empois d’amidon nécessaire pour 4 binômes. L’empois
obtenu sera réparti dans 4 béchers avant d’être placé à 4°C.
Peser 8g d’amidon dans une capsule et y ajouter 60 mL d’eau désionisée. Délayer et verser cette
suspension dans un bécher contenant 100 mL d’eau désionisée préalablement bouillie. Maintenir
doucement l’ébullition et mélanger soigneusement pour avoir un empois bien homogène. Laisser
refroidir, répartir l’empois préparé dans 4 béchers et les mettre au moins 15 min à 4°C avant utilisation
pour l’hydrolyse. Ne pas oublier d’identifier chaque bécher avec un n° de binôme.

Hydrolyse enzymatique :
Préparer 15 tubes à essais contenant 15 mL d’eau désionisée (mesurés à l’éprouvette) additionnée de 5
gouttes de solution iodo-iodurée (solution prête : iodure de potassium 20g, iode 10g, eau qsp 1L).
Mélanger pour obtenir une coloration homogène jaune-pâle.
Démarrer la digestion enzymatique en ajoutant à l’empois refroidi 0,3 mL de solution d’-amylase
(solution à conserver dans la glace). Mélanger avec un agitateur en verre.
Tremper rapidement le bout de l’agitateur dans le 1er tube à essais. Agiter le tube et rincer l’agitateur.
Sous l’effet de l’enzyme, l’empois commence à se liquéfier. Continuer à mélanger l’empois et l’enzyme.
A des temps réguliers (2 min au début, puis 1 min selon l’évolution de la coloration obtenue dans les
tubes avec la solution d’iode), recommencer le prélèvement et suivre ainsi l’évolution de la coloration de
la gamme jusqu’au retour à la couleur jaune initiale.

IV – SUIVI DE COLORANTS CONTENUS DANS LES SIROPS

Manipulation :
L’absorbance des colorants présents dans un sirop (menthe ou grenadine) est mesurée au
spectrophotomètre en fonction de la dilution du sirop.
Chaque binôme réalisera 3 dilutions avec l’un des 2 sirops selon le protocole suivant (prélever le sirop
avec une pipette automatique, préparer 2 ml de chaque dilution, lecture de l’absorbance au
spectrophotomètre en cuve plastique):
- Sirop de menthe (bleu brillant) : dilutions au 1/5, 1/10 et 1/20, absorbance mesurée à 630 nm.
- Sirop de grenadine (anthocyanes) : dilutions au 1/2, 1/5 et 1/10, absorbance mesurée à 525 nm.

Tracer le graphe Absorbance = f (dilution) pour le sirop utilisé.

Présenter en fin de séance la gamme de coloration obtenue pour l’hydrolyse de l’amidon.

Rendre en fin de TP la feuille de résultats (1/binôme avec les noms et le n° de binôme) comprenant
le dosage du glucose (en précisant le n° de l’échantillon X) et les valeurs d’absorbance obtenues
pour les dilutions du sirop avec le graphe correspondant.
 TP2 : Acides aminés et protéines

I - CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE DES ACIDES AMINES

Principe
La chromatographie sur couche mince est un procédé d’analyse très sensible très utilisé en biochimie. La
séparation est réalisée sur un support solide inerte et hydrophile (couche mince de gel de silice) par
l’ascension par capillarité d’un système-solvant. Hormis leur liaison réversible avec la surface du support
(adsorption), les acides aminés dont les solubilités dans l’eau et les solvants organiques sont différentes,
auront des coefficients de partage différents et pourront être séparés.
La révélation des acides aminés après migration utilise la ninhydrine qui conduit à la formation d’un
chromophore violet (pourpre de Ruheman) avec les acides aminés, excepté pour la proline qui conduit à
un chromophore jaune.

Manipulation
- sur une plaque de chromatographie en couche mince (4 x 10 cm) recouverte de Silicagel (0,2 mm
d’épaisseur) tracer délicatement au crayon un trait à 1,5 cm du bord inférieur pour y effectuer les
dépôts distants d’environ 1 cm.
- 3 dépôts : chaque binôme dépose 1 µL d’un échantillon A ou B contenant un mélange de 3 acides
aminés à une concentration de 2,5 mg/mL (échantillon A : Arg/ Pro/ Trp ; échantillon B : Val/ Asp/
Lys). Les 2 autres dépôts correspondent à 2 acides aminés témoins à choisir parmi les 6 acides aminés
suivants (0,5 µL/dépôt) : Trp, Val, Asp, Arg, Lys, Pro.
- sécher les dépôts et mettre la plaque dans la cuve contenant le solvant de migration (n-butanol/acide
acétique/eau (75/20/20)) ; fermer la cuve et laisser migrer pendant environ 2h jusqu’à ce que le solvant
arrive en haut de la plaque.
- sortir alors la plaque et repérer le front du solvant
- sécher la plaque et pulvériser ensuite la solution de ninhydrine (solution à 1% dans l’acétone) sous la
hotte
- chauffer jusqu’à apparition des taches colorées

Résultats & Interprétation

Entourer les taches observées, noter leur couleur, identifier les acides aminés présents dans votre
échantillon en justifiant votre réponse, calculer les Rf.

II - DOSAGE DES PROTEINES – SPECTROPHOTOMETRIE

Principe
Le principe du dosage d’un composé par spectrophotométrie est appliqué au dosage colorimétrique des
protéines par la méthode du Biuret.
Après détermination de la longueur d’onde d’absorption maximale d’un composé, son absorbance (A)
peut être dans certaines conditions reliée à sa concentration (c en mol.L-1) grâce à la loi de Beer-
Lambert : A =  l c, où l représente le trajet optique (en cm) et  le coefficient d’extinction molaire (en
cm-1.L.mol-1) du composé à la longueur d’onde utilisée.

Le dosage colorimétrique des protéines par la méthode du Biuret utilise le réactif de Gornall qui met en
évidence les liaisons peptidiques. En milieu alcalin et en présence de cuivre, une coloration violette
apparaît, coloration dont l’intensité est mesurée au spectrophotomètre à 540 nm. Cette intensité est reliée
à la concentration du composé coloré formé et donc à la concentration initiale de la protéine.
Manipulation :
Une solution de sérumalbumine à 10 g/L est utilisée pour réaliser une gamme de concentration variable
en protéine (gamme étalon). Après réaction avec le réactif de Gornall, on mesure l’absorbance des tubes
de la gamme et de la solution de protéine à doser (solution X). On utilise des tubes à essais en verre. Les
volumes indiqués dans le tableau sont en mL.

Gamme étalon Solution X

N° des tubes 1 2 3 4 5 6 7 8
Sérumalbumine à 10g/L 0,2 0,4 0,6 0,8 1
NaCl à 8g/L 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,5
Solution de protéine à doser 0,5 1
Réactif de Gornall 4 4 4 4 4 4 4 4

Bien mélanger après addition de chaque réactif et laisser à l’obscurité 30 minutes.

Lire l’absorbance à 540 nm (lecture en cuve, réglage du zéro optique avec le blanc : tube 1).

Le réactif de Gornall est disponible en distributeur. Sa composition est la suivante :

Dissoudre 1,5 g de CuSO4 pur dans 200 mL d’eau ; ajouter 6 g de tartrate double de sodium et de
potassium puis 30 g de soude ; après agitation et dissolution ajouter 1 g d’iodure de potassium et
compléter à 1 litre avec de l’eau. Conserver à l’obscurité en flacon bien bouché.

Résultats & Interprétation

Tracer la courbe A = f (quantité de protéine par tube en mg).
Calculer la concentration en protéine, exprimée en g/L, de la solution X.

III – PRECIPITATION NON DENATURANTE DES PROTEINES

La précipitation non dénaturante des protéines est réalisée par des sels neutres tels que le sulfate
d’ammonium. Il s’agit d’un relargage avec possibilité de redissolution de la protéine après élimination de
l’agent de précipitation.
Manipulation :
- dans un tube à hémolyse en plastique, mettre 1,5 ml d’ovalbumine à 1%, ajouter 1,5 ml de
sulfate d’ammonium saturé (solution de (NH4)2SO4 à environ 750 g/L), boucher et mélanger.
- placer le tube à 4°C au moins ½ heure pour favoriser la précipitation.
- centrifuger 5 à 10 min à 3000 t/min.
- décanter le surnageant et redissoudre le précipité dans 3 ml d’eau distillée.

Rendre en fin de TP la feuille de résultats (1/binôme) complétée avec les calculs et interprétations,
en joignant le graphe du dosage et la plaque de chromatographie annotée.

Ne pas oublier d’indiquer les noms et n° de binôme, ainsi que les références des solutions analysées
(mélange d’acides aminés et solution X du dosage).