Master MEEF – Spécialité BGB/BSE TP Biochimie UE19b

Caractérisation de produits laitiers

La fermentation du lait est un procédé de conservation du lait utilisé dans de nombreux pays. La fermentation
modifie la composition du lait.
L'objectif de la manipulation est de déterminer :
L'acidité totale d'un yaourt par titrimétrie.
La concentration en acide lactique d'un yaourt par dosage enzymatique UV.
La concentration en lactose d'un yaourt par dosage colorimétrique.
L'identité des oses présents dans le yaourt par chromatographie sur couche mince.

I – Dosage de l’acidité dans le yaourt

1/ Mode opératoire
Introduire 30 g de yaourt dans un bécher. Homogénéiser dans environ 60 mL d'eau. Ajuster à 100 mL par de
l'eau distillée.
Prélever 10 mL de la préparation et compléter à 100 mL par de l'eau distillée. Ajouter quelques gouttes de
l'indicateur coloré.
Titrer à l'aide de la solution d'hydroxyde de sodium 0,025 mol.L-1 jusqu'au virage de l'indicateur : la coloration
doit être persistante pendant au moins 10 secondes.
2/ Résultats
Présenter le principe du dosage et justifier l'utilisation de l'indicateur coloré.
Etablir la formule littérale donnant la teneur en acide lactique du yaourt, en admettant que l'acide
lactique est majoritairement présent (masse molaire de l'acide lactique = 90 g.mol-1).
Calculer la teneur en acide lactique dans le yaourt.
On donne l'écart type de répétabilité Sr = 0,0866 mg.g-1. Contrôler l'acceptabilité de vos résultats.

II - Clarification des échantillons contenant des protéines par les réactifs de Carrez
Cette étape a été réalisée sur le yaourt préalablement au dosage enzymatique de l’acide lactique et du lactose.
1/ Réactifs
Réactif I de Carrez : 3,6 g K4[Fe(CN)6], 3 H2O / 100 mL eau
Réactif II de Carrez : 7,2 g ZnSO4, 7 H2O / 100 mL eau
2/ Protocole
Homogénéisation de 30 g de yaourt par 30 mL eau distillée,
Addition de 5 mL de Réactif I de Carrez, agitation, Addition de 5 mL de Réactif II de Carrez, agitation.
Le pH de la solution est ajusté à 8,1 par de la soude 10%, le volume est ajusté à 100 mL par de l’eau distillée.
La solution est centrifugée 10 min à 4000 tpm. Le surnageant obtenu constitue l’échantillon à tester.

III - Dosage enzymatique de l’acide lactique dans le yaourt

1/ Principe
Ce dosage est réalisé « en point final », la totalité de l’acide lactique de l’échantillon est donc dosé.
L-LDH
L-lactate + NAD+ → Pyruvate + NADH + H+
GPT
Pyruvate + L-glutamate → L-alanine + -cétoglutarate

Pourquoi est-il est nécessaire de coupler la réaction de transamination à celle d’oxydation ?

Quel est le paramètre expérimental mesuré ? Comment le relier à la concentration en acide lactique ?
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2/ Réactifs
Réactif 1 : acide L-glutamique (490 mg / 34 mL), tampon glycylglycine pH 10,0
Réactif 2 : NAD+ (250 mg / 7 mL eau)
Réactif 3 : Glutamate pyruvate transaminase (GPT) approx. 1100 U / 0,7 mL
Réactif 4 : Solution standard multi-acides dont acide L-lactique 0,144 g/L
Réactif 5 : L-lactate déshydrogénase (L-LDH) approx. 3800 U / 0,7 mL
3/ Mode opératoire
Préparer directement dans des semi-microcuves-UV :
1 mL Réactif 1 + 200 µL Réactif 2 + 20 µL Réactif 3 + 100 µL Réactif 4 + 900 µL eau distillée.
Mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 5 min environ (Abs 1).
Ajouter 20 µL Réactif 5. Mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 30 min environ (Abs 2).
Traiter l’échantillon dilué au 1/10ème, comme le standard (2 essais). Ne pas oublier le « blanc ».
4/ Résultats
 = 6,3 L.mmol-1.cm-1 Mac. lactique = 90 g.mol-1
Le calcul de la concentration en acide lactique utilise la variation d’absorbance A calculée de la façon suivante
: A = (Abs 2 – Abs 1)essai – (Abs 2 – Abs 1)blanc

Expliquer. Vérifier la concentration en acide lactique de la solution standard.

Quelle est la teneur en acide lactique du yaourt ? Comparer avec la valeur obtenue par titrimétrie.
Ecart type de répétabilité Sr = 0,085 mg.g-1.

IV - Dosage du lactose dans le yaourt

Les glucides réducteurs peuvent être dosés grâce à leurs propriétés réductrices, par la méthode au 3,5-
dinitrosalicylate ; ce dernier est réduit, à chaud, par les oses réducteurs en acide 3-amino-5-nitro-salicylique.
L'intensité de la coloration est, dans les conditions expérimentales, proportionnelle au pouvoir réducteur. (La
réaction est non stœchiométrique, donc dépendante des conditions opératoires). Le 3,5-DNS jaune est réduit
en acide 3-amino-5-nitrosalicylique orangé-rouge, dosable par colorimétrie à 530 nm.

1/ Mode opératoire
Courbe étalon
A partir de la solution étalon de lactose, effectuer des prises d’essai de façon à ce que les différents tubes
contiennent des quantités allant de 0 à 0,4 mg. Le volume final est de 0,6 mL.
Ajouter à chaque tube 0,4 mL de réactif au 3,5-DNS. Mettre 5 min au bain-marie bouillant.
Refroidir immédiatement et ajouter 3 mL d’eau dans chaque tube. Laisser stabiliser 15 min.
Mesurer l’absorbance à 530 nm (utiliser des cuves de 3 mL).

Contrôle
Effectuer un contrôle de la qualité de la manipulation (2 essais) avec la solution contrôle de lactose.

Echantillons
Opérer de la même façon avec la préparation de yaourt en faisant une dilution convenable, sachant que la
teneur en lactose d'un yaourt est de l'ordre de 50 mg.g-1.

2/ Résultats
Présenter, en les justifiant, les dilutions effectuées.
Tracer la droite d’étalonnage à l’aide de l’outil informatique puis calculer la teneur en lactose du yaourt.

Données :
Limite d’acceptabilité : 0,42 – 0,48 mg.mL-1.
Sr = 0,308 mg.g-1.
Uc (tlactose ; yaourt) = 0,52 mg.g-1.
Incertitude élargie U = k . Uc (facteur d’élargissement k = 2 pour un niveau de confiance de 95%).
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Matériel nécessaire pour le titrage :
1 bécher haut 100 ou 200 mL
1 éprouvette de 100 mL
1 fiole jaugée de 100 mL
1 pipette jaugée de 10 mL et 1 de 20 mL
1 propipette
1 burette de 25 mL
3 erlens de 250 mL (col large)
1 tige de verre
Matériel pour le dosage du lactate :
P200 ; P1000 avec cônes
1 fiole jaugée de 10 mL
Spectrophotomètre Shimadzu
4 cuves-UV + portoir
Matériel pour le dosage du lactose :
P200, P1000 et P5000 avec cônes
1 fiole jaugée de 10 mL et une de 25 mL
3 erlens de 25 mL
10 tubes à hémolyse 8 mL sur un portoir
Bain-marie 100°C
Spectrophotomètre Shimadzu + cuves PS 3 mL
Données de sécurité
Hydroxyde de sodium NaOH :
TP Biochimie UE19b
1 bécher "poubelle"
Echantillons de yaourt homogénéisé
Flacon de NaOH 0,025 M (~50 mL)
Flacon de bleu de thymol
Produits / 4 essais / étudiant
5 mL Réactif 1 (tampon, Glu)
1 mL Réactif 2 (NAD)
100 µL Réactif 3 (GPT)
100 µL Réactif 4 (Std)
100 µL Réactif 5 (LDH)
Yaourt clarifié : 1 mL SN à diluer 1/10ème
Solution étalon de lactose 20 mg.10 mL-1.
Solution contrôle de lactose 0,45 mg. mL-1.
Flacon de 3,5' DNS
Yaourt clarifié : 1 mL de SN à diluer
H314 P280 P305 + P351 + P338 P310