TP N° 01 :

Dosage enzymatique du glucose en

point final
 I. Introduction :

Le glucose est la principale source d’énergie de l’organisme. Le taux de glucose dans le sang est très
finement régulé par plusieurs hormones, avec l’action combinée de l’insuline et du glucagon.

La glycémie est la concentration de glucose dans le sang. Elle est généralement mesurée en g /L ou
en mMol / L. Chez un sujet normal la glycémie à jeune peut varier entre 0,75 et 1,10 g/l. avec un
seuil glycémique maximal à jeun, admissible pour ne pas être considérée diabétique, de 1,26 g/l.

-Il existe plusieurs techniques de dosage de la glycémie, -seules les techniques enzymatiques sont
encore utilisées en routine vu leur spécificité, leur sensibilité et l’automatisation de ces techniques.

II. Dosage de glucose par méthode enzymatique colorimétrique

Principe de la méthode :

La méthode utilisée dans notre TP est la méthode enzymatique colorimétrique

La Glucose-oxydase (GOD) catalyse l’oxydation du glucose en acide gluconique et en H2O2 ; Le

peroxyde d'hydrogène (H2O2) formé de cette réaction est détecté par un accepteur d’oxygène
chromogénique, le Phénol-Aminophénazone, ce chromogène réduit incolore, en présence de la
Peroxydase (POD), sera oxydé en un dérivé coloré en rose (Quinone). L'intensité de la coloration
obtenue est proportionnelle à la concentration en glucose.

Réactions mise en jeu :

La réaction enzymatique en point final selon la méthode de Trinder est la suivante :

Glucose oxydase

Glucose + O2 + H2O Acid gluconique + H2O2

Peroxydase

H2O2 + Phénol + Aminophenazone Quinone + H2O

On peut simplifier l’ensemble de ces réactions ainsi :

Autres méthodes de dosage :

a) Méthode enzymatique cinétique a l’Hexokinase (HK) :

Principe :

HK
Glucose+ ATP Glucose-6-phosphate
G6PDH
Glucose-6-phosphate + NADH, H+ 6PhosphoGluconolactone + NAD+

-Mesure la diminution de l’absorbance à 340 nm

b) Méthode à la glucose déshydrogénase (GDH)

GDH

Glucose + NAD Gluconolactone + NADH, H+

-Mesure l’augmentation de l’absorbance à 340 nm

c) Des méthodes basées sur les propriétés physicochimiques du glucose (ancienne

méthodes )

1- Méthode réductimétrique : basées sur le pouvoir réducteur de glucose vis-à-vis d’un réactif
minéral ou organique (abandonnées)
-Très peu spécifique

2- Méthode Furfuralique : formation d’OHCH3 furfural par déshydratation et cyclisation du

glucose en milieu Acide concentré et à chauffés, Puis condensation de l’OHCH3 furfural avec
différence composés (phénols ou des amines aromatique) == composé coloré.
-peu utilisé
III. Phase pré-analytique :
Prélèvement : Différents type de prélèvement :
 Sang : On fait un prélèvement sur un sujet en jeune (au moins 8 heurs). On fait le dosage
après centrifugation sur sérum ou plasma hépariné ou avec EDTA, de préférence sur anti
glycolytique (NaF)

 Urine : pour la glycosurie.

 -LCR : la glycorachie.

Conservation :
Sérum : 3jours à +4°C ou plusieurs mois à -20°C.

IV. PHASE ANALYTIQUE :

But
L’objectif de la présente manipulation est la détermination spectrophotométrique indirecte des
concentrations de solutions de glucose par une méthode enzymatique-point final à l’aide d’une
gamme d’étalon.

A. Matériel et condition de travail :

Matériel nécessaire pour la manipulation est :

- Le réactif fourni prêt à l’emploi

- Spectrophotomètre réglé à λ =505 nm.
- Equipement de laboratoire : Pipettes, Tubes secs et Porte-tubes.
- Solution mère, contrôles normales et pathologiques

Lors de la lecture spectrophotométrique, certaines précautions doivent être prises :

 S’assurer que la cuve est propre et ne bloque pas le passage du faisceau lumineux
 Rincer la cuve entre le passage de deux solutions uniquement si les concentrations ne
 sont pas croissantes Fermer la porte du spectrophotomètre lors de la lecture

B. Notions à définir :

-La limite de linéarité : La limite pour laquelle la loi de Beer-Lambert est linéaire (limite
de validité de la relation linéaire/proportionnelle).

-Deux types sont à distinguer :

Linéarité théorique : littérature.
Linéarité pratique : diffèrent d’une manipulation à une autre.
 -Les échantillons ayant une concentration en glucose dépassant la limite de linéarité (pratique)
sont à diluer puis traiter par le même mode opératoire. Ne pas oublier de multiplier le résultat
final obtenu après dosage par l’inverse de la dilution pratiquée.

-La concentration de la solution mère correspond généralement à la limite de linéarité théorique.

(5g/l)

- Etalon ou standard : Une solution étalon est une solution dont la concentration en
soluté est connue de façon très précise.
- Calibration ou étalonnage : Il s'agit de comparer la DO des échantillons à tester avec
celle d'une solution dont on connaît la concentration avec précision et que l'on appelle
étalon.

Deux types d’étalonnage selon le nombre d’étalon utilisés :

 Dosage : un seul étalon

 Gamme d’étalonnage : plusieurs étalons

C. Mode opératoire : ou manipulation

 Préparation d’une solution mère (étalon) :
A partir d’une solution de glucose à 5%, on prépare 50 ml d’une solution mère à 5g/l.

100 ml 5g X= 50 g/l (concentration de la solution en g/l)

1000 ml (1L) Xg

On cherche à obtenir une solution de concentration 5g/l à partir d’une solution de 50g/l donc on
doit faire une dilution 1/10ème c’est à dire on prélève 5 ml de la solution de glucose à 5% et on
complète avec de l’eau distillée jusqu’à 50 ml

NB : la concentration de la solution mère dosée sur automate est 4.93 g/l

 Choix des concentrations des solutions filles :

Le choix des points se fait afin de balayer toutes les zones des valeurs physiopathologiques dans
les limites de la technique.

*On démarre toujours avec l’intervalle de référence [Cmin – Cmax] (0,7-1,10) g/l, on prend :
- 2 à 3 points ˂ Cmin (0,7 g/l)
- 2 à 3 points ˃ Cmax (1,10 g/l)
- 2 à 3 points dans l’intervalle (0,7-1,10 g/l)

*on choisit des valeurs qui présentent un Intérêt clinique, diagnostic et même pronostic, par
exemple :
- Le 0.50 g/l comme limite d’une hypoglycémie clinique.
- Le 1,26 g/l comme limite d’une hyperglycémie clinique.

 Préparation des dilutions (gamme d’étalonnage)

Cf (g/l) 0.25 0.5 0.75 1 1.25 2 3 3.5 4 5

Cm (g/l) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Vf (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Vm (ml) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.40 0.60 0.70 0.8 1

V eau 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.60 0.40 0.70 0.2 0
distillée

 Lecture au spectroscope et établissement de la courbe :

10 μl d’échantillon + 1ml de réactif, incubation 20mn à température ambiante ou 5 mn à 37°C

Lecture des densités optique de chaque solution au spectrophotomètre à une longueur d’onde λ=
505 nm
Remarque : sur le tableau est mentionné l’absorbance corrigée après soustraire l’absorbance
du blanc réactif qui est 0.526 A

CONCENTRATIO 0.25 0.5 0.75 1 1.25 2 3 3.5 4 5

N
Cf (g/l)

DO 0.063 0.104 0.216 0.237 0.285 0.441 0.660 0.791 0.832 1.237

 Après la détermination des DO, on trace la courbe DO = f(C) :

La courbe tracée est une droite qui passe par l’origine.

- La relation entre l’absorbance et la concentration est linéaire de type Y = a X
- La linéarité pratique est de 3.5 g/l
 Les contrôles et échantillons :

Echantillon 1 2 3 4 PCC1 PCC2

DO 0.91 0.275 0.544 0.723 0.411 0.51

Concentration après 0.79 1.22 2.4 3.24 1.870 2.35

extrapolation (g/l)
Concentration sur 0.85 1.25 2.23 3.29
cobas 6000 (g/l)

Interprétation des résultats :

Les valeurs de glycémies des échantillons trouvé par extrapolation sont proches des valeurs
trouvées par l’automate cobas 6000