Biochimie clinique

Dosage du cholestérol
Introduction

- Double origine : exogène et endogène.

- Exogène :absorption intestinale en présence des glycérides et sels biliaires.
- Endogène : biosynthèse dans l’hépatocyte à partir de l’acetylCoA (1,5 à 2 g /l).
- Deux formes : estérifiés et non estérifiée .

Dosage du cholestérol total

I.Modalités du prélèvement

- Sérum ou plasma(EDTA/héparine, oxalates, citrates et fluorures à éviter).

- Jeune de 12H est indispensable.
- Il ne s’agit pas d’un examen d’urgence .
- Conservation possible a +4° .
- Stables 5 à 7 jours à +4°C,3mois à -20°C, plusieurs années à -70°C (éviter congélation
décongélation répétées)

II.Principe

Méthode enzymatique colorimétrique :

Stérides+ cholestérol libre cholestérol estérase cholestérol total libre + AG

CTL cholestérol oxydase +O2 cholesténone +H2O2

H2O2 peroxydase H2O+ ½ O2

½ O2 + chromogène réduit incolore chromogène oxydé coloré (DO ; λ)

Chromogène : 4aminoantipyrine+ phénol quinone imine ( lue à 500nm).

Avantage :

Spécificité / procédés chimiques

Pas d’interférence avec les chromogènes.
Meilleure sensibilité .
Rapides
Automatisable.

III.Autres méthodes

 Oxydation du cholestérol , λ=630nm.

 Lieberman-Burchard ( ac sulfirique+anhydride acétique coloration rouge violacée
λ= 550nm).
 Zak-Zlatkis ( FeCl3 en milieu acétique et sulfirique).

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IV.Courbe d’étalonnage

 Choix des points : se fait afin de déterminer les limites inférieure et supérieure de la
technique et de balayer toutes les zones des valeurs physiopathologiques dans les
limites de la technique.
A partir d’une solution mère à C= mg /l, on fait des dilutions pour obtenir des
solutions filles .
Cmère x Vmère = Cfille x Vfille

Valeurs usuelles : 1,5 à 2 g/l.

Remarque

Il faut choisir au minimum

- Une concentration basse.

- Une concentration moyenne .
- Une concentration élevée.

Les points choisis doivent convenir avec la concentration de la solution mère.

Les volumes choisis doivent convenir avec le volume de la solution mère.

Les points choisis sont :

/ / / /………./ / dernier point = Cmère

Intérêt de la courbe

- Se fait à chaque fois qu’il y a un dosage en série.

- Permet de déterminer la concentration du paramètre dans l’échantillon à doser.
- Permet de déterminer les limites de linéarité et de sensibilité de la technique.

Intérêt des contrôles

- Permettent de valider la manipulation (ou d’effectuer un contrôle de qualité)

Intérêt du blanc réactif

- Permet d’éliminer les interférences.

-
 Tableau des dilutions

Vfinal = x ml

Cm x Vm = Cf x Vf  Vm = (Cf x Vf)/ Cm

V eau distillée = Vfinal – Vm

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Cf mg/l
Vm ml
V ed ml

V. DOSAGE

On réalise le dosage du paramètre suivant le protocole :

 On réalise les dilutions.

 Manipulation (réactions proprement dite).
 Lecture au spectrophotomètre à λ = nm contre le blanc réactif.

Tableau des résultats

C mg/l PN PP S1 S2
D.O
La loi de Beer-Lambert

D.O= ε. l . C ou

ε : coefficient d’extinction molaire ( cte)

l : longueur de la cuve = 1 cm. (cte)

C : concentration (variable)

On peut tracer la courbe D.O = f (C)

Le tracé (voir papier millimétré)

Titre : dosage de l’acide urique sanguin ( et / ou urinaire) D.O = f (C)

Echelle : en abscisse 1cm

En ordonnée 1cm

La courbe est une droite qui passe par l’origine .

La limite de linéarité pratique = mg/l

La linéarité selon la littérature = 6mg/l.

VII. EXPLORATION

 Détermination des concentrations du PN,PP et des sérums par extrapolation.

 Multiplier par l’inverse de la dilution si elle avait eu lieu.

PN PP S1 S2 Sn
D.O
C mg/l

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Variations physiologiques

 Après 40 ans (importante chez l’homme plus que la femme)

 Sexe : femme ;taux plus faible que l’homme.
 Régime alimentaire.
 Grossesse : 1er trimestre , puis normal , 3ème trimestre .
 Exercice physique.

Variations pathologiques

Hypocholestérolémie

Insuffisance hépatocellulaire.
Dénutrition.
Hyperthyroidie.

Hypercholestérolémie

Dyslipédémies familiales.
Athérosclérose.
Affections hépatiques.
-Ictères rétentionnels (total et estérifié)
-Hépatite parenchymateuse (diminution de l’estérification du cholestérol ; CT )

Dosage du HDLc
I.Principe

Méthodes par précipitation (très répandus) :

Consiste à précipiter les lipoprotéines de basse densité (LDL, VLDL) et à doser le CT du

surnageant qui ne contient plus que les HDL ( après centrifugation)

Plusieurs agents précipitant peuvent être utilisés :

 Héparine en présence de Mg2+.

 Acide phosphotungstique en présence de Mg2+
 Sulfate de dextran en présence se Mg2+.
 Concanavaline A et PEg (abandonnés)

Valeurs usuelles : 0,4 – 0,75

II.Autres méthodes

- Ultracentrifugation de flottation préparative ( longue et couteuse)

- Electrophorèse des lipides.
- Immunoturbidimétrie .

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Détermination du LDLc
LDL est le principal fournisseur de CT pour la constitution de la plaque d’athérome. Il
existe une corrélation positive entre la concentration en LDLc et le risque
d’athérosclérose :
Formule de Friedwald

LDLc = CT ( TG/5+ HDLc)

Non valable si TG > 3,45g/l

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