TP N 03 :

Dosage enzymatique colorimé trique de

cholesté rol total

2022/2023
 I. Introduction :

Le cholestérol est à la fois apporté par l'alimentation et synthétisé par le corps humain, à
partir de l'acétyl-CoA, majoritairement dans le foie. Molécule insoluble Il est le précurseur de
certaines hormones stéroïdes et des acides biliaires.

Les autres sources sont les cellules intestinales qui synthétisent également le cholestérol qui
est organisé en chylomicrons. Les glandes surrénales et les gonades peuvent aussi produire du
cholestérol.

Son transport dans le sang se fait sous forme de lipoprotéines. Il est principalement associé à
des LDL en provenance du foie vers les tissus périphériques ou des HDL qui récupèrent
l'excédant en le redirigeant vers le foie.

Les LDL (Low Density Liporpotein) qui transportent près de 60% du cholestérol sérique total
sont des lipoprotéines athérogenes.

De retour au foie, il peut être réutilisé dans des lipoprotéines, être éliminé directement
(inchangé) dans la bile ou dégradé en acides biliaires.

Le cholestérol est impliqué dans la fluidité des membranes cellulaires. Plus il est présent dans
une membrane, plus celle-ci est rigide.

La détermination du cholestérol est l’un des outils les plus importants pour diagnostiquer et
classifier les dyslipidémies. L’augmentation du niveau de cholestérol est l’un des facteurs de
risques cardiovasculaires possibles. Le diagnostic clinique doit tenir compte des données
cliniques et de laboratoire.

II. Phase pré analytique :

1. Condition de prélèvement :

- Prélèvement sanguin veineux sur tube sec (sérum) ou hépariné (plasma)

- Tube EDTA accepté
- Jeun stricte de 12h,
- Si associé aux Triglycérides il faut séparer le sérum dans les deux heures qui suit le
prélèvement
- Interférence possible : bilirubine (ictère).

2. Valeurs de référence :
- moins de 200mg/dl : normal
- entre 200 et 239 mg/dl : modéré
- ≥ 240 mg/dl : élevé

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 3. Conservation :
- 7 jours à +4 °C
- 3 mois au congélateur (-20ºC).

III. Phase analytique :

1. Méthodes de dosage :

i. Dosage par la méthode enzymatique colorimétrique CHOD-POD :

Principe :

Le cholestérol présent dans l’échantillon sous forme d’ester est hydrolysé par la cholestérol
estérase, le cholestérol libre obtenu est oxydé en présence d’O2 et de cholestérol oxydase ; le
H2O2 formé réagit avec le réactif de Trinder pour générer une coloration rose évaluée au
Spectrophotomètre à 505 nm (500-550)

L’intensité de la couleur formée est proportionnelle à la concentration de cholestérol présent

dans l’échantillon

Réactions mis en jeu :

IV. Mode opératoire :

1. Réactif et matériel :
-Spectrophotomètre réglé à λ =505 nm .
-Cuve de dosage d’1cm de trajet optique ;
-Equipment du laboratoire : Portoir, Tubes secs, Pipettes
-Réactifs : Réactif de travail (RT: R1 et R2), Blanc, Contrôles (PN, PP), standard.

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 2. Contrôle de réactif :

DO Blanc CFAS PCC1 PCC2 Standard

DO 0.056 0.450 0.284 0.406 0.408

Absorbance 0.394 0.225 O.350 0.352

corrigée /
Concentration 1.278 (STD) 1.98 (STD)
trouvée par / / 0.987(CFAS) 1.53(CFAS) /
calcule (g/l)
Concentration
réelle (g/l) / 1.73 [0.94-1.040] [1.61-1.79] 2

En connaissant les concentrations de standards: [StD]=2 g/l et [CFAS]= 1.73 g/l ; Par une
simple règle de trois, on peut déterminer les concentrations des échantillons et contrôles.

C Etalon DO Etalon
C Ech DO Ech

C Ech= (C Etalon. DO Ech) / DO Etalon

3. Choix des concentrations et préparation des dilutions :

A partir d’une solution mère de concentration 10g/l de cholestérol on prépare une gamme
d’étalonnage.

Le choix des points se fait afin de déterminer les limites inférieure et supérieure de la technique et
de balayer toutes les zones des valeurs physiopathologiques dans les limites de la technique.

*On démarre toujours avec l’intervalle de référence [Cmin – Cmax] (1,5-2) g/l, on prend :
- 2 à 3 points ˂ Cmin (1,5 g/l)
- 2 à 3 points ˃ Cmax (2 g/l)
- 2 à 3 points dans l’intervalle (1,5-2 g/l)

C’est ainsi qu’on obtient le tableau suivant :

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 N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cf (g/l) 0.5 1 1.30 1.50 1.80 2 2.5 3 6

Cm(g/l) 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Vf (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Vm 0.05 0.1 0.13 0.15 0.18 0.2 0.25 0.3 0.6

(ml)
V eau 0.95 0.9 0.87 0.85 0.82 0.8 0.75 0.7 0.4
distillée
(ml)

 Des notions à définir :

- La limite de détection : 60mg/l

- La limite de linéarité théorique : 6g/l

4. Le dosage des échantillons sanguins :

Remarque : sur le tableau est mentionné l’absorbance corrigée après soustraire l’absorbance du
blanc réactif qui est 0.056 A

J’ai calculé les concentrations par une simple règle des trois en utilisant la concentration et
l’absorbance du CFAS.

échantillon 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration 1.15 1.301 1.334 1.677 1.837 1.916 2.285 2.409

réelle g/l
DO 0.325 0.252 0.330 0.343 0.356 0.461 0.540 0.520

Concentration 1.42 1.10 1.44 1.50 1.56 2.02 2.371 2.28

calculée (g/l)

V. Exploration physiologique et physiopathologique :

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1. Les variations physiologiques :

- Age : augmente de 0.2g/l par tranche de 10 ans

- Sexe : il est plus élevé chez l’homme par rapport aux femme en période d’activité
génitale (augmente âpres ménopause)
- Grossesse : il diminue au premier trimestre et augmente au 3eme trimestre de
grossesse a cause de l’augmentation de progestérone
- Régime alimentaire : les végétariens ont une cholestérolémie diminuée
- Exercice physique : il diminue le taux de cholestérol

2. Variation pathologique :

Les hypocholestérolémies Les hypercholestérolémies

- Affections familiales - dyslipidémies familiales

- Dénutritions - athérosclérose
- insuffisance hépatocellulaires - affection hépatique (cholestase)
- pathologies infectieuses et - pancréatite – diabète
cancéreuses - hypothyroïdie
- hyperthyroïdie - syndrome néphrotique
- myélome
- corticothérapie