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Rapport de stage en entreprise

Laboratoire d'analyse mdicale


Sommaire
-Remerciements
1- Prsentation de l'entreprise
1-1 Localisation
1-2 Historique
1-3 Horaires de travail
1-4 Organisation du laboratoire
1-5 Activits du laboratoire
2- Tches effectues
2-1 Les diffrents tubes de prlvements
2-2 Hmatologie
2-3 Immunologie
2-4 Bactriologie
2-4-1Urine
2-4-2 Coprologie
2-4-3 Prlvement vaginal (PV)
2-4-4 Identification et antibiogramme
2-5 Coagulation
2-6 Recherche d'agglutination irrgulire : (R.A.I)
2-7 Quelques machines du laboratoire
3-Bilan
-Annexes
1- Prsentation de l'entreprise
1-1 Localisation
Le laboratoire d'analyses mdicales dans lequel j'ai effectu mon stage se trouve au
Cette structure a un avantage gographique important. En effet elle est entoure de nombreux
cabinets de mdecins traitants, de cabinets d'infirmiers et d'un cabinet de radiologie.
Ce groupement forme, avec le laboratoire, un ple mdical relativement complet.
1-2 Historique
Le laboratoire de Villenave d'Ornon existe depuis 1968. A l'poque, tait le propritaire du
laboratoire et possdait galement la pharmacie de Villenave d'Ornon Chambry.
En 1975, la profession de biologiste d'analyses mdicales s'est individualise. En effet, il tait
devenu impossible de cumuler laboratoire et pharmacie. En 1989, le laboratoire est vendu qui
depuis 1982 occupe le poste de directrice adjointe.
Enfin, en 2002 s'est associ pour assurer la direction du laboratoire.
1-3 Horaires de travail

Les diffrents employs s'organisent de faon ce qu'il y ait toujours 3 personnes au laboratoire de
7h00 19h30.
Il faut toujours, selon la lgislation, un biologiste dans le laboratoire, donc et se relaient sur la plage
horaire de 7h00 19h30(parfois plus tard si il reste des analyses faire)
1-4 Organisation du laboratoire

1-5 Activits du laboratoire


Le laboratoire est organis suivant diffrents domaines d'analyses :
- la bactriologie
- la parasitologie
- l'hmatologie
- l'hormonologie
- la biochimie
Les analyses faites au laboratoires sont prescrites par un mdecin. La demande est traite selon une
procdure dans le but que le patient et le mdecin reoivent les rsultats (annexe 9)
2-Tches effectues
Pendant mon stage j'ai pu observer et m'exercer sur plusieurs paillasses du laboratoire. J'ai aussi
dcouvert une vritable quipe de travail et les responsabilits qui incombent chacun.
Je vais prsenter ci-dessous les diffrents domaines que j'ai explors.
2-1 Les diffrents tubes de prlvements
Il y a 7 types de tubes possibles identifiables par la couleur de leurs bouchons. La couleur de
chaque tube est normalise. En France la norme qui a t retenue est la norme amricaine.
Pour chaque tube il y a des caractristiques diffrentes :

2-2 Hmatologie
Hmogramme (NFS), numration de formule sanguine (globules rouges, globules blancs et
plaquettes)
Principe:
La numration consiste compter les cellules du sang grce un automate. Cet automate est
constitu de 2 lectrodes de platine entre lesquelles on fait passer un courant lectrique:
c'est la mthode Coulter
A chaque passage de cellule, une diffrence de potentiel se cre.
Chaque variation est compte et le nombre de variations correspond au nombre de cellules. De plus,
lintensit de la variation est proportionnelle la taille de la cellule, cest--dire plus la variation est
importante plus la cellule est grosse.
La formule est tablie grce a une diffrentiation chimique qui entre autre sparera les constituants
basophile et acidophile.
De plus la machine tablie le dosage de l'hmoglobine et dtermine Concentration Corpusculaire

Moyen en Hmoglobine, Teneur Corpusculaire Moyen en Hmoglobine, Volume Globulaire


Moyen, Indice de Distribution d'England.
utilisation de la machine:
la tache principal du technicien est de confirmer la bonne utilisation de l'appareil, pour cela il doit
effectuer un contrle quotidien qu'il doit comparer a un abaque donn par le fournisseur.
Tout les matins un contrle est effectu pour pouvoir confirmer le bon fonctionnement de la
machine.
L'analyse consiste a interprter les rsultats bruts et de dterminer si une formule manuelle doit tre
tablie ( cf coloration de May Grunwald Giemsa ).
Les rsultats moyens sont :
NUMERATION GLOBULAIRE ET PARAMETRES ERYTHROCYTAIRES

FORMULE LEUCOCYTAIRE

Intrt :
La numration permet de connatre avec une certaine prcision le nombre de cellule dans le sang
dun patient.
Les rsultats du patient sont apprcies en comparaison des valeurs de rfrences appeles :
normales .
Cette comparaison permet de mettre en vidence parfois des anomalies , exemple :
- manque dhmoglobine => anmie
-excs de leucocyte => probabilit dinfection, dinflammation ou de leucmie
Comptage des cellules sur cellule de Malassez
Principe :
La cellule de Malassez est une lame pour observation microscopique.
Elle est caractrise par le quadrillage calibr grav sa surface.
Dans le cas o lautomate charg du comptage des cellules ne parviendrait pas donner un rsultat
fiable, il faut quun biologiste observe au microscope un chantillon de sang.
Grce au quadrillage le biologiste va pouvoir compter les diffrentes cellules et comparer avec
lappareil les rsultats obtenus, exemple :
-thrombopnie ( Nombre de plaquettes infrieur a 150 000.)
On fait un contrle en cellule de Malassez aprs passage en unopette
Une unopette dtruit les globules rouges et conserve les plaquette, et les globules blancs.
Intrt :
Ce contrle permet de compter le nombre de plaquettes et de vrifier la prsence ou
dagrgat plaquettaire.

Coloration de May Grnwald et Giemsa

l absence

Principe :
Cette coloration repose sur laffinit acide-base des colorants et des lments cellulaires. Il y a 2
colorants:
-le May Grnwald =>contenant un colorant acide : losine et un colorant basique : le bleu de
mthylne
-le Giemsa => contenant de losine galement, et un colorant basique : lazure de mthyle
Les lments cellulaires acides, seront colors slectivement par les colorants basiques. Ces
lments sont qualifis de basophiles (ADN, cytoplasme des lymphocytes)
Les lments cellulaires basiques, seront colors slectivement par les colorants acides. Ces
lments sont qualifis d'acidophiles ou d'osinophiles (cytoplasme des hmaties)
Les lments neutrophiles sont colors la fois par les colorants acides et basiques.
But :
Dans un premier temps ce test permet dtablir manuellement la formule sanguine si lautomate
met des alarmes.
Dans un deuxime temps ce test permet de vrifier la cytologie (coloration MGG et lecture au
microscope)
-des Globules rouges :
-taille (macrocyte , microcyte )
-forme ( schizocyte , ellytocyte )
-le remplissage en hmoglobine ( exemple : hypochromie => globule rouge en forme de
cible )
-des Globules Blancs :
-quantit ou phase de maturation anormale => leucmies
-plaquettes ( macrothrombocytose => volume plaquettaire moyen elev ou agrgat
plaquettaire.)

photo Hmatie et Lymphocyte vue a lobjectif *100 grce a la coloration de May Grnwald et
Gimsa (on peut voir galement 2 plaquettes a droite en violet)

photo : Hmatie et polynuclaire neutrophile vue a lobjectif *100 grce a la coloration MGG
(reconnaissable la coloration bleu-violet du noyau polylob)
Coloration des rticulocytes
Un rticulocyte est un jeune globule rouge.
Lors de la gense des hmaties (lrythropose) une cellule souche totipotente (qui possde la
facult de se dissocier en leucocyte, en hmatie ou en plaquette) va se dissocier pour arriver
maturit sous la forme dune hmatie.
Lors dune anmie (diminution de lhmoglobine) on va compter les rticulocytes pour savoir de
quelle sorte est lanmie :
-diminution de la production de globule rouge => les hmaties se dgradent normalement mais le
systme pour les remplacer est dfectueux => anmie non rgnrative, le nombre de rticulocytes
baisse.
-acclration de la fabrication => la production des hmaties est stimule, le nombre de
rticulocyte augmente => anmie rgnrative.

La coloration est faite grce au bleu de crsyl brillant qui est un colorant acidophile, donc il va
colorer lappareil nuclaire du rticulocyte qui est acide.
On va donc observer des petits amas bleus qui correspondent a lappareil nuclaire non ject du
rticulocyte.

photo :Rticulocyte par la coloration au bleu de crsyl brillant (caractris par les petits amas
bleus=> matriel nuclaire)

Vitesse de sdimentation :
Principe :
La mesure de la vitesse de sdimentation (appel aussi VS) est un test non spcifique utilis pour
dpister une inflammation.
Pour cela on utilise une loi qui lie la vitesse de chute dune sphre dans un liquide par laction de la
gravit, cest la loi de Stokes.
On a comme formule :

Avec:
v => vitesse limite de chute (en m / s)
r=> rayon de la sphre (en m)
g=> acclration (m / s2)
D(r)=> diffrence de la masse volumique entre la particule et le fluide (en kg / m3)
m=> viscosit du fluide (en Pa.s)
On mesure la vitesse a laquelle tombe les globules rouges en mm/h.
Exemple :
-gpathie monoclonale : les globules rouges se collent , les hmaties forment des rouleaux et
donc en suivant la loi de stock ils tombent plus vite.
-Quand il y a un processus inflammatoire, les protines inflammatoires vont modifier la viscosit
du plasma, se qui vas entrainer laugmentation de la VS.
Lecture et normes :
Le test de base est effectuer sur 2h , les nouveaux procds permettent une mesure en 1h voir mme
30min.
Pour la 1re heure :
glose BromoCrsol Pourpre (BCP) (annexe 1)
-cytologie positive (plus de 20 000 leucocytes et/ou prsence de germes a ltat frais) => glose
chromogne URI 4 (annexe 2 )

Pour les femmes enceintes, on rajoutera une glose au sang + ANC (annexe 3) pour la recherche de
Streptococcus agalacticae ( groupe B) responsable dinfection no-natale.

2-4-2 Coprologie :
La coproculture permet la recherche de bactries pathognes dans les selles.
Ces bactries sont responsables de diarrhe.
Dans une selle il y a 2 types de flore :
-la flore commensale=> Entrobactries, Lactobacillus, Streptococcus.
-la flore pathogne => Salmonella, Shigella, Yersinia et Staphylocoque dor
(enterotoxique)
Mise en uvre :
Examen microscopique
Vrifie si la flore commensale aro anarobie est prsente, absente, ou avec un dsquilibre.
Ensemencement :
-une glose BCP => va mettre en vidence la flore saprophyte (E. coli, entrocoque) et la flore
lactose ngatif ( aromonas pleusiomonas )
-une glose Chapman (annexe 8) slectif des staphylocoques va permettre la recherche de
Staphylococcus aureus enterotoxique dont la toxine est responsable de diarrhe.
-une glose Hekton (annexe 4 ) slectif des gram ngatif utilis pour la recherche des bactries
pathognes de types Salmonella et Shigella.
-un milieu Yersin pour la recherche de Yersinia enterocolictica
-un milieu pour la recherche de campylobactre
-un bouillon slnite qui permet lenrichissement de Salmonella et qui sera repiqu sur glose
SMID (annexe 5 ), les salmonella seront colors en rose indien.
2-4-3 Prlvement Vaginal (PV) :
Au mme titre que la selle il y a dans le vagin une flore commensale appele la flore de Doderlein,
et une flore pathogne. On recherchera des germes pathognes qui sont responsables de maladies
gnitales.
On va ensemencer pour lidentification plusieurs gloses :
-Glose BCP : elle va permettre une vue densemble de la flore non exigeante.
-Glose chocolat (annexe 7) : elle va permettre la pousse dun grand nombre de germes exigeant
ou non.
-Petite colonie brillante => Neisseria (pathogne sexuellement transmissible.) trs exigeant
pousse exclusivement sur glose chocolat.
-Colonie plate et verte => Lactobacillus (commensal )
-Petite colonie blanche => Corynbacterium (commensal )
-Petite colonie blanche qui pousse en suivant les lignes densemencement=>
Gardnerella(pathogne ou grand opportuniste)
-Glose au sang + ANC : isole les GRAM +
-Colonie bta hmolytique => Streptocoques ou Staphylocoques que lont diffrenciera par la

catalase car staphylocoque = catalase + et streptocoque = catalase -. Le test se fait avec lcrasement
dune colonie sur de leau oxygn. Le rsultat est positif sil y dgagement de gaz sous forme
apparente de bulles.
Lidentification du groupe auquel appartient le streptocoque se fera par technique didentification au
latex.
-Glose Sabouraud (annexe 6 ) => slectif des levures par exemple Candida albicans (pathogne
opportuniste)
2-4-4 Identification et antibiogramme
Aprs observation des boites qui servent lisolement des colonies, on peut tre amener identifier
et/ou tablir lantibiogramme, a partir dune culture pure, et pour se faire utiliser des galerie
didentification.

galerie didentification biochimique :

Ces galeries sont constitus de puits dans lesquels sont dposs diffrents substrats quel les
bactries sont susceptible dutiliser. ( LDC , ODC , ADH )

Photo : rapid ID 32 (Biorad)=> galerie didentification compose de 32 puits spcialis dans


lidentification de germes responsable dinfection urinaire.
Antibiogramme :
Il a pour but de dfinir la rsistance ou la sensibilit dune bactrie pour un antibiotique donn.
Dans les diffrentes cupules sont dposs des antibiotiques une concentration donn et
ensemencer avec la bactrie a tester en dilution standardis.

ABT gram ngatif avec prsence de la souche Pseudomonas aeruginosa (caractristique de la


coloration verte).
Ces deux galeries sont lues grce aux techniques de turbidimtrie et de colorimtrie.
2-5 Coagulation
En coagulation ltape pr-analytique est fondamentale :
-vrifier les tubes
-vrifier le nom du patient
-vrifier les temps dincubation
Les conditions optimales de prlvement sont :
-le matin
- jeun
Pour mesurer le temps de coagulation le prlvement sanguin se fait sur un tube citrat (bouchon
bleu)
Ce tube contient un anticoagulant qui bloque la coagulation de faon rversible, le volume
danticoagulant est de 9 units de sang pour 1 unit danticoagulant.

Il faut vrifier labsence dhmolyse, le tube doit tre centrifug dans un dlai de 1h aprs le
prlvement et la mesure doit tre faite 4h maximum entre le prlvement et le rsultat.
T.P (taux de prothrombine)
Le taux de prothrombine est la transformation d'un temps de coagulation (temps de Quick) en
pourcentage.
Le temps de Quick est ralis en mettant en prsence un plasma citrat avec un ractif : la
thromboplastine calcique, qui joue le rle d'activateur tissulaire de la coagulation.
Le plasma coagule et le temps obtenu s'appelle le temps de Quick.
Le taux de prothrombine se calcul grce a une formule mathmatique en fonction du temps de
Quick.
Le TP est une mesure trs sensible aux conditions opratoires cest pour cela que la valeur du TP est
lisse grce a lINR (international normalized ratio), et le rsultats sont comparables dun
laboratoire a un autre.
Avec :
TQpatient : le temps de Quick mesur pour le plasma du patient tester ;
TQTemoin : le temps de Quick tmoins (TP = 100 %) ;
ISI : l'indice de sensibilit international spcifique du ractif thromboplastine utilis.
L'INR n'a pas d'unit. Il est, par dfinition, indpendant du ractif utilis, et plusieurs mesures
successives, faites dans des laboratoires diffrents, peuvent tre compares entre elles sans
problme.
T.C.A (Temps de cphaline active)
Cest un temps de coagulation qui explore la voie intrinsque.
Cette mesure se fait en rapportant le temps de coagulation du patient a celui dun tmoin.
Il sagit de mesurer le temps de coagulation dun plasma sanguin recalcifi en prsence de
cphaline et dun activateur particulier.
On exprime le ratio telle la formule :
2-6 Recherche dagglutination irrgulire (R.A.I)
Principe :
Ce test se fait sur plaque dans des puits ou il y a un gel filet au fond.
On met en prsence le srum du patient(Anticorps) avec des antignes spcifiques des agglutinines
irrgulires.
Si la raction antigne anticorps a lieu il y a une agglutination visible a lil nue
Cette raction a lieu pendant la priode dincubation de 15 min 37C.
Ensuite on centrifuge, ce qui va permettre aux Ag et aux Ac qui nont pas agglutins de traverser
compltement le gel et de tomber au fond du puits.

En revanche les complexe Ag/Ac qui sont gros, sont retenue dans les mailles du gel et visible car
diffues.
Si diffusion dagglutination dans le gel, le test est considr comme positif.
3-bilan
3-1 personnel et relationnel:
Dun point de vue personnel le stage ma intresser, jai pu dcouvrir le travail dun laboratoire
danalyses et les responsabilits qui incombent a un technicien.
Je suis aussi ravi que toute les personnes du laboratoire maient accord du temps pour mapprendre
et mexpliquer le fonctionnement des machines, jai pu aussi mpanouir dans une grande libert et
mme utiliser le matriel du laboratoire pour mexercer.
Je voudrais insister sur le relationnel entre les diffrentes personnes du laboratoire, en effet dans ce
travail le bon fonctionnement est de essentiellement la communication, on peut reprsenter la
communication comme cela:
Biologistes

technicien

secrtaire

Les 3 secteurs du laboratoire sont en communication constante, sans cette communication le


laboratoire ne fonctionnerait pas correctement.
De plus cette communication permet une ambiance de travail trs agrable sans oublier que le
travail passe avant tout.
3-2 les connaissances thoriques et pratiques
Les connaissances que jai pu acqurir au lyce saint louis mont servi au cours de mon stage.
La partie concernant la microbiologie (=la bactriologie) ma permis de mettre mes connaissances
au service du laboratoire, en effet lensemencement des milieux de cultures et des galeries
didentification est au programme de 1er STL ce qui ma permis de pouvoir me mettre en activit
trs rapidement dans ce service du laboratoire.
Toujours dans le domaine de la bactriologie jai pu utiliser mes connaissances thoriques
notamment lors de lidentification dune souche.
Le point ngatif est que je navais jamais vu lhmatologie au cours de ma scolarit il ma t donc
assez compliqu de combler cette lacune mais laide plus que prcieuse des personnes du
laboratoire ma permis de combler ce retard et mme me donner une exprience dans ce domaine.
Pour conclure je dois dire que lenseignement propos par le lyce peut sembler obsolte par
rapport au technique utilis dans le monde du travail, par exemple les techniques biochimique
manuel (ex :azote par mthode de Kjeldalh , dosage des nitrites par colorimtrie ) qui ont
compltement disparus.
3-3 dcouvertes du monde du travail
Ce stage est le troisime que je fais, durant ma scolarit jai pu dcouvrir le monde de
linformatique, celui du paysagisme, celui dun laboratoire de collge, mais je navais jamais
dcouvert le monde du mdical.
Chaque exprience que jai pu avoir a tait trs bnfique mais le stage dans le laboratoire ma
permis de voir ce que mes tudes peuvent mapporter comme travail.

Jai dcouvert un travail enrichissant bas sur lutilisation de machines, le travail de technicien est
de vrifier ltat de fonctionnement de ces machines mais aussi de faire un premier diagnostique
pour le biologiste.
Le travail de technicien rclame rigueur, prcision et une prise dinitiative constante.
Dans le cadre de mon stage jai pu mentretenir avec un technicien et jai pu avoir plus de
prcisions sur le mtier de technicien, malheureusement ce mtier est vou a disparatre , en effet
avec lautomatisation de tous les tests de laboratoire il ny aura besoin que dun technicien pour
vrifier le bon fonctionnement des machines et un biologiste pour valider les rsultats.
Le nouveau rle du technicien sera dassurer le prlvement sanguin, le pr et le post analytique.
Remerciements:
Je tiens tout dabord remercier de mavoir permis deffectuer mon stage au sein de leur laboratoire
et davoir mis ma disposition tout le matriel ncessaire pour me permettre dacqurir une
meilleure technique de travail
Je tiens aussi remercier toute lquipe du laboratoire pour mavoir soutenu dans mon travail et
pour mavoir appris comment travailler dans un laboratoire danalyses.
Je voudrais aussi remercier plus particulirement Monsieur pour avoir fait preuve dune grande
tnacit dans mon apprentissage et davoir souvent pris sur son temps libre pour maider dans le
travail dun technicien

ANNEXE 1

ANNEXE 3

ANNEXE 4

ANNEXE 5 => Salmonella sur glose SMID

ANNEXE 6 => levure sur glose Sabouraud

ANNEXE 7 => Neisseria gonoreae sur glose au chocolat

ANNEXE 8
couleur du bouchon
caractristiques/compositions

analyses ralises
Rouge
tube sec sans anticoagulant
ou tube sec + activateur de coagulation (silice ou thrombine)
analyses de chimie, d'immunologie et hormonologie(test de grossesse) + tube pour prlever le
srum.
Bleu
contient du citrate qui bloque de faon rversible le calcium qui est utilis toute tape de la
coagulation. Concentration = 9 units de sang pour 1 unit de citrate.
dosage des facteurs de coagulations (TCA, TP, fibrinogne)
Violet
contient de l'EDTA qui altre le moins la morphologie des cellules.
numration de formule sanguine (NFS) , groupe sanguin.
Gris
contient du fluore qui bloque les enzymes de la glycolyse (dgradation du glucose)
dosage de la glycmie par exemple
Vert
contient de l'hparine qui bloque la permabilit cellulaire l'ion potassium K
ionogramme et analyses de chimie.
Noir
idem que le tube bleu mais avec un volume de 1 unit d'anticoagulant pour 4 units de sang.
analyse de la vitesse de sdimentation.
1re semaine
8 jours 3 mois
3 mois 3 ans
3 6ans
6 15 ans
Adulte
Hmaties 10.6/L(Tera/L)
5,0 6,0
3,8 4,8
3,6 5,2
4,1 5,3
4,0 5,4
H : 4,5 5,8F : 3,8 5,4
Leucocytes 10/L (Giga/L)
10,0 30,0
6,0 18,0
6,0 15,0
5,0 13,0
5,0 11,0
4,0 10,0
Plaquettes 10/L (Giga/L)
150 400
150 400
150 400
150 400
150 400
150 400
Hmoglobine g/dL
14,5 22,5

10 16
10,5 13,5
10,5 13,5
11,5 14,5
H : 13,5 17,5F : 12,5 15,5
Hmatocrite %
44 58
38 44
36 44
36 44
37 45
H : 40 50F : 37 47
VGM fl
100 120
85 96
70 86
73 89
77 91
82 98
TCMH pg
34 38
24 34
23 31
24 30
24 30
> ou = 27
CCMH g/dL
32 36
32 36
32 36
32 36
32 36
32 36
en 10/L
1re semaine
8 jours 3 mois
3 mois 3 ans
3 6 ans
6 15 ans
Adulte
Polynuclaires neutrophiles
6,0 26,0
1,5 8,5
1,5 8,5
1,5 8,5
1,8 8,0
1,8 7,5
Polynuclaires osinophiles
0,2 0,85
0,2 1,2
0,05 0,7
0,02 0,65

0 0,6
0,1 0,4
Polynuclaires basophiles
0 0,64
0 0,2
0 0,2
0 0,2
0 0,2
0 0,2
Lymphocytes
2,0 11,0
2,0 11,0
4,0 10,5
2,0 8,0
1,5 6,5
1,0 4,5
Monocytes
0,4 3,1
0,05 1,1
0 0,8
0 0,8
0 0,8
0,2 1,0