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Coloration de May-Grünwald-Giemsa
M. Imbert, M. El Khoury

Les colorations les plus utilisées en hématologie cellulaire sont la coloration de May-Grünwald-Giemsa
(Europe) et celle de Wright (États-Unis). Elles dérivent de la coloration de Romanovsky, mise au point à la
fin du XIX e siècle. Grâce aux différentes affinités tinctoriales de leurs constituants, elles colorent
différemment les composants cellulaires (noyau, cytoplasme, granulations), ce qui permet ensuite de
reconnaître les cellules par lecture microscopique. Obtenir une coloration satisfaisante requiert une
procédure rigoureuse incluant notamment l’utilisation de réactifs commerciaux de bonne qualité et une
préparation quotidienne des colorants. La bonne qualité de la coloration doit être évaluée avant la lecture
du frottis. Elle est nécessaire pour éviter des erreurs d’identification des cellules normales et
pathologiques.
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Mots clés : Coloration de May-Grünwald-Giemsa ; Coloration de Wright ; Coloration de Romanovsky

Plan ■ Principe [1]

¶ Introduction - Historique 1 Le colorant de May-Grünwald est une solution neutre

¶ Principe
¶ Méthode
Préparation des colorants
Réalisation technique
¶ Contrôle de la qualité
¶ Problèmes techniques
■ Introduction - Historique
La coloration de May-Grünwald-Giemsa en Europe et la
coloration de Wright aux États-Unis sont les principales colora-
tions de type Romanovsky utilisées en hématologie cellulaire
pour la coloration des frottis sanguins, médullaires ou
ganglionnaires.
C’est à la fin du XIXe siècle qu’apparaissent les premières
techniques de coloration des éléments du sang. Paul Ehrlich,
médecin allemand élève de Virchow, fut le premier en 1877, à
pouvoir observer au microscope les noyaux et le cytoplasme des
cellules sanguines et médullaires grâce à l’utilisation d’une
coloration triacide à l’aniline sur des frottis fixés à chaud.
La coloration d’Ehrlich a été rapidement remplacée par celle
de Romanovsky utilisant du bleu de méthylène et de l’éosine
sur des frottis séchés à l’air. Giemsa a modifié cette technique
en remplaçant le bleu de méthylène par du méthylène azur.
Les colorations de type coloration de Romanovsky compor-
tent un mélange :
• d’un colorant basique ou cationique comme l’azur qui colore
en bleu ou bleu-violet les groupements acides des acides
nucléiques, des protéines du noyau et du cytoplasme, des
granulations basophiles et à un moindre degré des granula-
tions neutrophiles ;
• d’un colorant acide ou anionique comme l’éosine qui colore
en rouge-orangé les groupements basiques de l’hémoglobine
et des granulations éosinophiles.
d’éosine et de bleu de méthylène dans de l’alcool méthylique,
1
ce qui permet la fixation des éléments. Lorsqu’on utilise ce
1 colorant isolément, les noyaux sont colorés en bleu pâle, les
1 cytoplasmes en bleu très clair ou sont incolores, les granulations
2 secondaires des granulocytes en rouge clair pour la lignée
2 neutrophile, en bleu foncé pour la lignée basophile et en rouge-
2
orangé pour la lignée éosinophile. Les hématies sont colorées en
beige rosé.
Le colorant de Giemsa est une combinaison d’éosine et de
dérivés du bleu de méthylène dont l’azur. Il colore les noyaux
en violet, les cytoplasmes en bleu plus ou moins intense ou en
rose selon les cellules et les granulations primaires des granulo-
cytes en rouge-pourpre intense (granulations dites alors
azurophiles).
Ces deux colorants, qui donnent des résultats complémentai-
res, ont été associés par Pappenheimer dans une coloration
panoptique.
Les caractéristiques tinctoriales des différents composants
cellulaires sont résumées dans le Tableau 1.
■ Méthode
Préparation des colorants
Les solutions de colorants sont obtenues en mélangeant des
quantités adéquates de solution mère avec un tampon de pH
voisin de 7. Un rapport de 1/15 et un pH de 6,8 sont
recommandés [2].
Si l’on peut préparer soi-même les solutions mères [2], on les
trouve prêtes à l’emploi chez de nombreux fabricants. Il peut
être utile de tester plusieurs marques avant d’obtenir des
conditions optimales de coloration et de différenciation [3].
Différents tampons sont utilisables : tampon HEPES, tampon
phosphate ou autre tampon de molarité basse. On peut les
préparer soi-même ou utiliser des formes concentrées (compri-
més, solution) à diluer dans de l’eau distillée.

Encyclopédie Médico-Biologique 1
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Tableau 1. Le problème le plus fréquemment rencontré est celui d’une

Affinités tinctoriales de différents constituants cellulaires après coloration coloration anormale du frottis qui apparaît trop foncé ou au
panoptique. contraire trop pâle. Dans le cas d’une coloration trop foncée, il
Noyau Violet convient de vérifier que le frottis n’est pas trop épais, le temps
Nucléole Bleu de coloration trop long ou le temps de lavage insuffisant. Mais
c’est le plus souvent un pH trop alcalin des solutions colorantes
Corps de Jolly Violet
ou du tampon de rinçage qui est en cause. Le frottis est alors
Cytoplasme Bleu +/- intense
surcoloré : les hématies ont un aspect bleu-vert, les cytoplasmes
Granulations primaires, corps Pourpre/violet-pourpre
deviennent grisâtres, les granulations éosinophiles sont grises ou
d’Auer
bleues tandis que les neutrophiles sont très foncés pouvant
Granulations neutrophiles Violet clair/rose
simuler des granulations toxiques (Fig. 3).
Granulations des plaquettes
Inversement, une coloration trop pâle peut être due à un pH
Granulations éosinophiles Orange trop acide, les composants basophiles n’étant alors pas bien
Granulations basophiles, Violet foncé/noir colorés : les hématies sont rouge-orangé, les granulations
granulations toxiques éosinophiles rouge brillant alors que les noyaux apparaissent
Corps Döhle Bleu pâle plus pâles. Enfin, le temps de lavage ne doit pas être excessif.
Hématies Beige rosé L’analyse d’un frottis comportant celle des hématies, ces
éléments doivent être fixés soigneusement et ne pas apparaître
réfringents. Si les hématies paraissent réfringentes, il faut penser
Les solutions colorantes doivent être renouvelées quotidien-
à une fixation défectueuse par le May-Grünwald, soit que la
nement, voire plus souvent si un grand nombre de lames sont
qualité du colorant n’est pas correcte (le méthanol entrant dans
colorées. En effet, la précipitation de l’éosine par l’azur B au
sa composition ne doit pas contenir plus de 3 % d’eau) soit
cours du temps décroît le pouvoir colorant, la coloration
violette des noyaux devient alors bleue [2]. qu’il n’a pas été renouvelé assez fréquemment (Fig. 4).
Le fond de la lame entre les éléments cellulaires doit être
clair. Si ce n’est pas le cas, il faut vérifier que l’anticoagulant
Réalisation technique [3] utilisé pour l’hémogramme est bien l’EDTA et non l’héparine et
La coloration doit être effectuée avec des colorants dilués que le rinçage des lames a été suffisant (Fig. 5). Mais on peut
dans de l’eau tamponnée, renouvelés quotidiennement, sans aussi observer ce phénomène en présence d’une importante
rinçage entre les trois premières étapes. hypergammaglobulinémie, en particulier de type IgM.
On peut déposer les colorants sur les lames disposées à plat On peut parfois observer sur les lames des dépôts gênant
ou plonger les lames verticalement dans un bac à coloration, l’analyse cytologique. Ces dépôts sont le fait de l’instabilité des
technique qui est souvent utilisée dans les colorateurs colorants qui précipitent dans le temps, d’où la nécessité de
automatiques.
changer régulièrement les colorants. Enfin, la qualité des lames
La technique suivante, qui donne les meilleurs résultats, est
et leur propreté sont également des facteurs importants condi-
facilement transposable sur un colorateur automatique :
tionnant celles du frottis. Il a été décrit des anomalies artefac-
• May-Grünwald pur : 2 minutes ;
• May-Grünwald dilué au 1/2 en eau tamponnée : 3 minutes ; tuelles des hématies (hématies cibles) liées à des lames
• Giemsa dilué au 1/10 en eau tamponnée : 3 fois 5 minutes ; insuffisamment nettoyées [9].
• eau tamponnée pour le rinçage : 2 fois 2 minutes.
Essuyer si besoin est le dos des lames avec un essuie-tout non
pelucheux et laisser ensuite les lames égoutter et sécher à l’air
au moins 5 minutes avant de les examiner au microscope.
Coloration rapide : des kits dits de « coloration rapide »,
disponibles dans le commerce, peuvent rendre certains services
mais il convient de les tester et de s’assurer qu’ils donnent une
qualité comparable à la coloration de référence avant de les
utiliser (Fig. 1).

■ Contrôle de la qualité
Pour s’assurer de la qualité de la coloration, il faut d’abord
vérifier la qualité du frottis.
À l’œil nu, le frottis correctement coloré apparaît bleu pâle
légèrement teinté de rose. Des frottis colorés en bleu soutenu
peuvent être observé en cas d’hypergammaglobulinémie ou de
processus nécrotique.
Seul le frottis est coloré, la zone intercellulaire doit rester
transparente et claire.
Au microscope, par des analyses morphométriques, on peut
déterminer des critères quantitatifs pour juger d’une bonne
coloration (rapports des colorations rouge/vert, rouge/bleu entre
1,2 et 1,4 et vert/bleu voisin de 1) [4] mais en pratique on se
contente d’une analyse simple : les hématies doivent apparaître
beige rosé, non réfringentes et les autres éléments doivent être
colorés selon leurs constituants cellulaires (Tableau 1). La zone
intercellulaire doit rester transparente et claire (Fig. 2).

■ Problèmes techniques
Différents problèmes peuvent modifier l’affinité tinctoriale
des colorants, nuire à la qualité de la coloration et gêner la
lecture et l’interprétation du frottis [2, 5-8].

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Figure 1.
A. Coloration obtenue avec le réactif Hemoquick® (Labo Moderne).
B. Superposable à celle du May-Grünwald-Giemsa.

■ Références
[1] Krafts Woronzoff-Dashkoff K. The Wright-Giemsa stain Secrets
revealed. In: Interpretation of the peripheral blood film- Clinics in
laboratory medecine. Philadelphia: WB Saunders; 2002. p. 15-23.
[2] International Committee for Standardization in Haematology. ICSH
reference method for staining of blood and bone marrow films by azure
B and eosin Y (Romanowsky stain). Br J Haematol 1984;57:707-10.
[3] Sultan C, Priolet G, Beuzard Y, Rosa R, Josso J. Examen qualitatif des
cellules sanguines sur frottis. In: Techniques en hématologie. Paris:
Flammarion Médecine-Sciences; 1978. p. 40-2.
[4] Benattar L, Flandrin G. Analyse morphométrique, coloration de May-
Grünwald-Giemsa et contrôle de qualité. Introduction des méthodes
objectives dans l’observation microscopiques. Hématologie 1998;4:
233-8.
[5] Bain BJ. Blood sampling and film preparation. In: Blood cells. A
practical guide. Oxford: Blackwell Sciences; 1995. p. 1-4.
[6] Bessis M. Confection, coloration et examen des frottis. In: Cellules du
sang normal et pathologique. Paris: Masson; 1972. p. 17-25.
[7] Dacie JV, Lewis SM. Preparation and staining methods for blood and
bone-marrow films. In: Practical haematology. Edinburgh: Churchill-
Livingstone; 1984. p. 50-61.
[8] Perkins SL. Examination of the blood and bone marrow. In: Wintrobe’s
clinical hematology. Philadelphia: Lippincott-Williams and Wilkins;
2004. p. 2-5.
[9] Exner M, Schwarzinger I. Targeting the dust. Br J Haematol
2001;114:739.

M. Imbert, Professeur (michele.imbert@hmn.ap-hop-paris.fr).

M. El Khoury.
Hôpital Henri Mondor, 51, avenue du Maréchal-de-Lattre-de-Tassigny, 94010 Créteil cedex, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Imbert M., El Khoury M. Coloration de May-Grünwald-Giemsa. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris),
Encyclopédie Médico-Biologique, 90-15-0035, 2006.

Encyclopédie Médico-Biologique 3
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Figure 2.
A, B, C. Exemple de coloration de May-Grünwald-Giemsa correcte avec des
hématies beige rosé, non réfringentes, les autres éléments colorés selon leurs
constituants cellulaires et une zone intercellulaire transparente et claire.

Figure 3.
A, B. Coloration réalisée avec un tampon au pH trop alcalin. Le frottis est alors surcoloré : les hématies ont un aspect bleu-vert, les cytoplasmes deviennent
grisâtres.

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Figure 4.
A, B. Hématies réfringentes sur un frottis mal fixé par le May-Grünwald soit que la qualité du colorant ne soit pas correcte (le méthanol entrant dans sa
composition ne doit pas contenir plus de 3 % d’eau) soit qu’il n’a pas été renouvelé assez fréquemment.

Figure 5. Exemple de coloration mal rincée (A, B) ou de coloration réalisée à partir d’un prélèvement fait sur héparine et non sur EDTA (C, D). Le fond de
la lame entre les éléments cellulaires n’est pas net. On peut aussi observer ce phénomène en présence d’une importante hypergammaglobulinémie, en
particulier de type IgM.

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