TP N 02 :

Dosage enzymatique ciné tique de l’uré e

2022/2023
 I. Introduction :
L’urée est le produit de dégradation des acides aminés. Elle est exclusivement synthétisée
au niveau du foie via le cycle de l'urée (25 - 35 g/jour) et excrétée à 90% par les reins et à
10% par le tractus intestinal et la peau. C’est la forme principale d'élimination des déchets
azotés, par l’urine
Le dosage de l’urée dans le sang permet, avec d’autres mesures, d’évaluer la fonction rénale,
particulièrement la présence d’une insuffisance rénale. Il est aussi prescrit pour surveiller la
fonction rénale des personnes atteintes de diabète ou ayant subi un infarctus du myocarde. En
effet, lorsque les reins ne fonctionnent plus normalement, il y a une augmentation dans le sang
des concentrations d’urée, de créatinine et d’acide urique. Certaines pathologies du foie
peuvent également affecter le taux d’urée dans le sang.

Le dosage de l'urée dans les urines complète l'exploration de la fonction rénale et permet
éventuellement d'estimer l'apport alimentaire en protéines. Le rapport urée urinaire/urée
sanguine peut aider le médecin à déterminer la cause de l'insuffisance rénale. Le dosage de
l’urée peut en outre permettre d’évaluer l’efficacité de la dialyse.

II. Phase pré-analytique :

1- Prélèvement :
L’urée peut être dosée sur un prélèvement sanguin ou urinaire.

Urée sanguin :

Le dosage de l’urée dans le sang (urémie) s’effectue sur un prélèvement sanguin veineux,
généralement effectué au pli du coude.

Il faut de préférence être à jeun et éviter les repas trop riches en protéines les jours précédents.

L'urée est une molécule très hydrosoluble et très diffusable (concentration identique dans le
plasma et les globules rouges), donc les résultats obtenus à partir du plasma, du sérum ou du
sang totale sont équivaut.
Le sang doit être recueilli dans des tubes avec ou sans anti-coagulant. Le fluorure de soduim
est à éviter car il inhibe l'uréase utilisée par les méthodes enzymatiques.
Urée urinaire :
Le dosage est effectuée soit sur un échantillon des urines de 24h, soit sur une miction (diluer
au 1/50ème )

2- Conservation :
Sang totale : jusqu'à 1h en absence d'anticoagulant et 6h en son présence.
Sérum ou plasma :
1 semaine au frigo a +4 °C
Jusqu'à 6 mois au congélateur (-20 °C)
Urines :
Consommation possible par les germes possédant une uréase.
Les urines peuvent être conservées pendant 07 jours à +4 °C ou 1 mois à -20 °C.

III. Phase analytique :

1- Méthodes de dosage :

i. Dosage par méthode enzymatique à l’uréase Détermination UV en Cinétique :

utilisé dans notre TP

Principe :

Méthode enzymatique basée sur le principe de réaction décrit par Talke et Schubert : La
diminution de l’absorbance suite à la conversion du NADH en NAD+ à 340 nm est
proportionnelle à la concentration en urée dans l’échantillon.

La diminution de l’absorbance (la disparition du NADH2) est suivie à 340 nm soit en

cinétique, soit en point final. Le delta DO est proportionnelle à la concentration de l’urée.

Technique automatisable, sensible, spécifique.

ii. Autres méthodes de dosage :

a) Dosage enzymatique à l'uréase couplée à une réaction colorée : Réaction de

Berthelot
-l’absorbance de ce complexe est proportionnelle à la concentration de l’urée dans
l’échantillon est mesurée à 600 nm.
-Méthode spécifique (à cause de l’utilisation de l’uréase) et sensible (à cause de l’utilisation
du réactif de Berthelot) mais elle est longue

b) Techniques électrochimiques :Automate Beckman

C'est la méthode potentiométrique qui mesure la modification du pH du milieu réactionnel
sous l'action de l'uréase.

c) Techniques utilisant la réflectométrie :

Le sérum est mis en contact avec l'uréase et l'ammoniaque produite diffuse à travers une
membrane semi-perméable dans la couche chromogène où elle réagit pour former un
complexe coloré dont l'intensité est mesurée par réflectométrie.

d) Techniques chimiques :
La plus connue est celle qui utilise la diacétylmonoxime (DAM).
L'urée réagit à chaud avec la DAM, en présence d'ions ferriques, pour former une coloration
rose qui peut être sensibilisée et stabilisée par des adjuvants tels que le thiosemicarbazide.
Cette technique est désormais abandonnée.

 Dosage de l'urée urinaire :

Les techniques de dosage par voie enzymatique sont les plus employées pour doser l'urée
urinaire. Elles peuvent conduire à des résultats erronés lorsque l'ammoniurie est importante.
La réalisation d'un blanc de l'échantillon, préalable au dosage, permet d'éliminer ce défaut. Par
ailleurs, le domaine restreint de mesure de ces techniques oblige à une prédilution
extemporanée importante de l'urine.

IV. Valeurs usuelles :

 Sang :

-Nourrisson : 0.05-0.15 (g/l)

- enfant : 0.15-0.25 (g/l)

-adulte : 0.15-0.5 (g/l)

 Urine :
-Enfant et nourrisson : 2-4 (g/24h)

-Adulte : 15-30 (g/24h)

V. Mode opératoire :
1. Réactif et matériel :
-Spectrophotomètre réglé à λ =340 nm .
-Cuve de dosage d’1cm de trajet optique ;
-Equipment du laboratoire : Portoir, Tubes secs, Pipettes
-Bain marin réglée à 37 ° C.
-Réactifs : Réactif de travail (RT: R1 et R2) (prêt à l'emploi), Blanc, Contrôles (PN, PP),
standard.

2. Contrôle de réactif :

DO CFAS PCC1 PCC2 Standard 1 Standardé2

DO à 30s 1.230 1.437 1.035 0.863 0.944

DO à 90s 1.296 1.433 1.029 0.857 0.936

ΔDO 0.004 0.004 0.006 0.006 0.008

Concentration 0.266 (ST1) 0.4 (ST1)

trouvée par calcule / 0.25(ST2) 0.375(ST2) / /
(g/l)
Concentration 1.02 [0.388-0.428] [1.18-1.30] 0.4 0.5
réelle (g/l)

En connaissant les concentrations des 2 standards: [St1]=50 mg/l et [St2]=40 mg/l ; Par une
simple règle de trois, on peut déterminer les concentrations des echantillons et controles.

C Etalon DO Etalon
C Ech DO Ech

C Ech= (C Etalon. DO Ech) / DO Etalon

  Validation des contrôles :
En utilisant la concentration et les DO du standard 1 on trouve :
[pcc1]=0.266 [pcc2]=0.4
La norme de PCC1 est [0.388-0.428] -------------------------- Non validé.
La norme de PCC 2 est [1.18-1.30] ---------------------------- Non validé.

3. Préparation des dilutions :

A partir de la solution mère d’urée à 5 g/l, on prépare une gamme d’étalonnage. C’est ainsi qu’on
obtient le tableau suivant :

Cf (g/l) 0.1 0.15 0.25 0.35 0.5 1 2 3 5

Cm (g/l) 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Vf (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1

Vm (ml) 0.02 0.03 0.05 0.07 0.1 0.2 0.4 0.6 1

V eau 0.98 0.97 0.95 0.93 0.9 0.8 0.6 0.4 0

distillée

 Un exemple de calcul :
Cm .Vm = Cf . Vf
Vm = (Cf . Vf)/ Cm = (0,35 . 1)/4= 0,07 ml

Donc, on prélève 0,07 ml de la solution mère (Vm) et on ajoute 0,93 ml d’eau distillée pour
obtenir un volume final de 1 ml de concentration 0.35g/l.

 Lecture au spectrophotomètre à 340nm :

dilution 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DO (30s) 0.569 0.556 0.539 0.551 0.581 0.995 0.558 0.573 0.997
DO (90s) 0.561 0.552 0.533 0.547 0.573 0.989 0.556 0.567 0.987
ΔDo 0.008 0.004 0.006 0.006 0.008 0.006 0.002 0.006 0.010
 4. Les échantillons sanguins et urinaires :

Echantillon Sérum1 Sérum2 Sérum3 Urine1 Urine2

ΔDo 0.002 0.004 0.007 0.002 0.006
Concentration(g/l) 0.13 0.26 0.46 6.66 20
Concentration trouvé 0.55 0.31 1.01 8 14
par l’automate (g/l)

VI. Exploration physiologique et physiopathologique :

 L'urée sanguine est augmentée dans :

-diète hyperprotéinée

-augmentation du catabolisme protéique

-hémorragie gastro-intestinale

-atteintes rénales (glomérulonéphrite, pyélonéphrite, ischémie)

-syndrome urémique

-insuffisance cardiaque

-obstruction des voies urinaires

 L'urée sanguine est diminuée dans les insuffisances hépato-cellulaires :

-hépatite toxique

-tumeur hépatique

-alcoolisme