Unité de biochimie

TP N 05 :
Dosage de cré atinine par mé thode
colorimé trique de jaffé (en point final)
avec dé poé tisation

2022/2023
I. Introduction :..................................................................................................................................1
II. Phase pré analytique :....................................................................................................................1
1. Condition de prélèvement :........................................................................................................1
2. Conservation :.............................................................................................................................2
III. Phase analytique :......................................................................................................................2
1. Méthodes de dosage :................................................................................................................2
A. Méthode colorimétrique de jaffé:..........................................................................................2
B. Méthode enzymatique :.........................................................................................................3
2. Mode opératoire :......................................................................................................................3
i. Réactif et matériel :....................................................................................................................3
ii. Préparation des dilutions :..........................................................................................................4
iii. Dosage proprement dit..............................................................................................................4
iv. Validation des contrôles :...........................................................................................................5
v. Les échantillons sanguins et urinaires :......................................................................................5
 Interprétation :...........................................................................................................................5
IV. Exploration Physiopathologique :...............................................................................................5
1. Variations physiologiques :.........................................................................................................5
2. Variations pathologiques :..........................................................................................................6
 I. Introduction :
La créatinine est le Produit du métabolisme musculaire issue de la déshydratation spontanée de la
créatine musculaire, Elle est éliminée par le rein par filtration glomérulaire, et ni secrétée ni
réabsorbée par le tubule ou elle suit passivement l’eau.

Sa détermination reste donc le meilleur marqueur endogène de la filtration glomérulaire.

C’est le test le plus largement utilisé pour apprécier la fonction rénale car sa valeur est le reflet
du débit de filtration glomérulaire

Pour un individu donné, sa production est constante, sa concentration plasmatique ne dépend

que de son élimination rénale et de sa masse musculaire, les valeurs normales varient en
fonction de l’âge et du sexe

II. Phase pré analytique :

1. Condition de prélèvement :
-Prélèvement sanguin :
-prélèvement à jeun, à distance des exercices physiques.
-Sérum ou plasma héparine

-prélèvement urinaire :
-Urines de 24h (dilution au 20ème ou 50ème)

2. Conservation :
-7jours à +4°C ou plusieurs mois à -20°C

III. Phase analytique :

1. Méthodes de dosage :
A. Méthode colorimétrique de jaffé:
Principe :

La créatinine en milieu alcalin réagit avec l’acide picrique donnant un complexe picrate-
créatinine jaune orangé absorbant à 510nm.
Réaction :

Créatinine +NaOH+acide picrique coloration jaune orangé,

Il ya deux variantes de la réaction :

  Jaffé point final avec déprotéinisation préalable : utilisé dans notre TP
Précipitation des protéines par le TCA ou l’acide tungstique et lecture en point final.
 Jaffé cinétique:
On effectue deux mesures :
- La première après30sec,
- La deuxième après90sec.
La différence entre les deux est proportionnelle à la concentration de la créatinine.
C’est la méthode utilisée au quotidien.

Interférences :

Les méthodes de Jaffé présentent toutes l’inconvénient d’être sujettes à de nombreuses

interférences (chromogènes non spécifiques tels que protéines, glucose…).

Selon leur concentration, ces composés peuvent provoquer une surestimation de 18 à

20 μmol/L de la concentration de créatinine dosée par les méthodes de Jaffé classiques.

A l’inverse, l’augmentation de la bilirubine masque le développement de la coloration et

donne des résultats faussement bas.

B. Méthode enzymatique :
a. Méthode enzymatique colorimétrique :

La créatinine est tout d'abord hydrolysée en créatine. La créatine est alors hydrolysée en
sarcosine, elle-même oxydée pour produire du peroxyde d'hydrogène H2O2.
L'eau oxygénée, en présence de peroxydase oxyde un leucodérivé qui se colore, et la vitesse
de coloration est alors mesurée en cinétique.
La vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration de créatinine présente dans
l’echantillon.

b. Méthode enzymatique en UV cinétique: Mesure à 340 nm

La cinétique décroissante de disparition du NADH suivie à 340 nm est proportionnelle à la
quantité de créatinine initiale présente.
 A. Spectrométrie de masse avec dilution isotopique : méthode de référence
La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible. Il s’agit
d’une méthode de référence très complexe développée pour affecter des valeurs à des
matériaux de référence. Elle est disponible dans quelques laboratoires hautement
spécialisés répartis à travers le monde.

2. Mode opératoire :

i. Réactif et matériel :
-Spectrophotomètre réglé à λ =520 nm .
-Cuve de dosage d’1cm de trajet optique ;
-Equipment du laboratoire : Portoir, Tubes secs, Pipettes
-Réactifs :
• Réactif R1 : TCA (trichloroacétate) 0,2 N
• Réactif R2 : Acide picrique 35 mmol /l
• Réactif R3 : NaOH 1,6 N
- Blanc, Contrôles (PN, PP), standard ou CFAS.

ii. Préparation des dilutions :

A partir de la solution mère de créatinine à 160 mg/l, on prépare une gamme d’étalonnage
(dilutions à partir de la solution mère).
C’est ainsi qu’on obtient le tableau suivant :

Cf (mg/l) 2 4 8 12 16 32 40 80 120 140 160

Cm 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160
(mg/l)
Vf (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Vm (ml) 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2 0.4 0.5 1 1.5 1.75 2

V eau 1.975 1.95 1.9 1.85 1.8 1.6 1.5 1 0.5 0.25 0
distillée

 Un exemple de calcul :
Cm .Vm = Cf . Vf
Vm = (Cf . Vf)/ Cm = (8 × 2)/160= 0,1 ml
 Donc, on prélève 0,1 ml de la solution mère (Vm) et on ajoute 1,9 ml d’eau distillée pour
obtenir un volume final de 2 ml de concentration 8 mg/l.

iii. Dosage proprement dit

1. Première étape : déproténisation

500 μl de TCA + 500 μl d’échantillon

Mélanger, centrifuger 10 minute puis récupérer le surnageant
2. Deuxième étape : réaction coloré
-500 ul surnagent + 500 ul solution de travail (250ul NaOH + 250ul acide picrique)
-mélange et incuber 20 minutes à température ambiante
-lire l’absorbance au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 520 nm

 Lecture au spectrophotomètre à 520 nm :

Remarque : sur le tableau est mentionné l’absorbance corrigée après soustraire l’absorbance
du blanc réactif qui est 0.159 A
Dilutions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
concentratio 2 4 8 12 16 32 40 80 120 140 160
n
Do 0.021 0.049 0.073 0.108 0.164 0.331 0.419 0.861 1.301 1.432 1.491

Après la détermination des DO, on trace la courbe DO = f(C)

 Commentaire de la courbe :

La courbe tracée est une droite qui passe par l’origine.

- La relation entre l’absorbance et la concentration est linéaire de type Y = a X
- La linéarité théorique est de 150 mg/l
- La linéarité pratique est de 125 mg/l

• Les contrôles PCC1 et PCC2 par exploration :

Par extrapolation des absorbances mesurées par spectrophotomètre à λ=520 nm sur la courbe
d’étalonnage, nous avons trouvé les résultats suivants :

Echantillons PCC1 PCC2

DO 0.135 0.503
Concentration par 13 47
exploration (mg/l)

iv. Validation des contrôles :

Par extrapolation des absorbances mesurées par spectrophotomètre à λ=520 nm sur la courbe
d’étalonnage, on trouve :
[pcc1]= 13 [pcc2]= 47
La norme de PCC1 est [9.4-11.8] -------------------------- Non validé.
La norme de PCC 2 est [32.9-42.1] ---------------------------- Non validé.

v. Les échantillons sanguins et urinaires :

 échantillons sanguins :

échantillon 1 2 3 4 5
Concentration 3 6 10 21 60
DO 0.101 0.127 0.213 0.481 0.777
Concentration 9 12 19 45 73
par exploration
(mg/l)
 échantillons sanguins

Remarque : sur le tableau est mentionné l’absorbance après dilution des urines aux
1/50eme

U1 U2 U3 U4
DO 0.239 0.259 0.305 0.324
Concentration 22 24 28 30
par exploration
(mg/l)
Concentration 1100 1200 1400 1500
calculée

3. Valeurs usuelles :
 Sang :
- Homme : 6 - 13mg/l - Femme : 5- 12mg/l

 Urine de 24H :
- Homme =1040-2350 mg/24H - Femme = 740-1570 mg/24H

IV. Exploration Physiopathologique :

1. Variations physiologiques :
- Augmentation au cours de la vie.
- Diminution lors de la grossesse car on a une augmentation de la filtration glomérulaire.
- Elle augmente après un exercice physique, et doit donc être mesurée au repos.
- En fonction de la masse musculaire : augmentation chez le sujet musclé mais diminution en
cas de fonte musculaire (personnes âgées), ainsi l'augmentation peut être annulée.
 2. Variations pathologiques :
La concentration de créatinine plasmatique est relativement stable au cours du temps chez
un individu donné, et reflète un équilibre (production/élimination), caractéristique de
l’homéostasie du milieu intérieur. C’est pourquoi toute élévation individuelle de la
créatininémie par rapport à un chiffre antérieur doit être considérée comme un résultat
d’une diminution du DFG, et par conséquence comme une altération de la fonction rénale.
Mais une mesure isolée ne permet pas de savoir si le patient est à l’état d’équilibre, et peut
mener à mésestimer la fonction rénale.
-Son élévation ne dépend pas uniquement de la filtration glomérulaire mais également :
 Du taux de production (catabolisme : augmente en cas de fièvre et traumatisme)
 Du volume de distribution
 De sa sécrétion tubulaire rénale.
- Aussi, la concentration sérique de la créatinine est fortement influencée par des facteurs
extrarénaux tels que :
 L’âge, le poids, le sexe, la race, le métabolisme musculaire, et les médicaments.
- Une augmentation de la créatinine retardée par rapport à la baisse du débit de filtration
glomérulaire (DFG)
- Une élévation de la créatinine peut ainsi se voir plusieurs heures à plusieurs jours après la
survenue des premières lésions tubulaires rénales.
- De plus, une altération significative de la fonction rénale peut être associée à des variations
minimes de la créatinine sérique dans certaines situations du fait, par exemple, d’une
augmentation de la sécrétion tubulaire de créatinine.

 La relation entre la créatinémie et le DFG n'est pas linéaire, mais une hyperbole
inverse