TP :

Chromatographie Liquide
Haute Performance

Lahmar Amna
Krir Aya
Sghaier Mabrouka
GCP2
 I. Première partie :
1. Définitions :
La Chromatographie Liquide Haute Performance :

L’HPLC (ou chromatographie en phase liquide haute performance) est une technique d’analyse
séparative, basée sur une migration progressive des composés dans une colonne supportant les
hautes pressions. Elle permet l'identification, la séparation et le dosage de composés chimiques dans
un mélange.
Les interactions servant à retenir et éluer les composés vont se jouer entre :

• L’échantillon à analyser
• La phase mobile : ᲶM
• La phase stationnaire : Ჶs

La phase mobile ou éluant : est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne.
La phase stationnaire : est un support plus ou moins poreux recouvert d'un gel (liquide
greffé) qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés.
2. Principe de Chromatographie Liquide Haute Performance :

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit
dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou
moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase
mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. Le
mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les
composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase
stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont
caractérisés par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

3. Les équipements de Chromatographie Liquide Haute Performance :

Réservoir de la phase mobile (solvant) :

Elle contient la phase mobile (éluant) en quantité suffisante.

 Pompe :

Elle délivre en continu la phase mobile. Elle est définie par la pression qu'elle permet d'atteindre
dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux.

Injecteur :

C'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, nous
utiliserons une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la
colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection
permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

Colonne :

Elle est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en
inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs
généralement de 15 à 30 cm.

Détecteur :

Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés

-détecteur UV-visible (avec lequel on a travaillé) : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à
la sortie de la colonne.

-Réfractomètre : il mesure la variation de l’indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne.

Système d’intégration :

Dans lequel, les données sont collectées par l’intermédiaire soit d’une intégration ou d’une station
d’acquisition. Le signal transmis par le détecteur sera traduit sous forme d’un chromatogramme.

4. Le but :
L’objectif de cette manipulation est de déterminer la teneur du SXM dans les comprimes ‘’Bactrim
Forte’’.

II. Deuxième partie : l’étalonnage du HPLC et traçage de la courbe d’étalonnage :

1. Définition du SMX (Le sulfaméthoxazole) :

Le sulfaméthoxazole (SMX) appartient à la famille des sulfamides, inhibe la conversion de l'acide p-

aminobenzoïque en dihydroptéroate.
 2. Préparation des étalons :
On a préparé cinq solutions filles diluées de volume Vfille=25 ml a partir de la solution mère de
SXM de concentration Cmère= 1000 ppm.
On a calculé le volume prélevé de la solution mère pour chaque étalon en utilisant la relation
entre le nombre de mole prélevé de SXM contenu dans la solution mère et celui de SXM dans
la solution fille.

Lorsqu’on fait une dilution d’une solution mère pour obtenir une solution fille, le nombre de mole de
contenant dans la solution est constant :

Cmère *V prélevé = Cfille *Vfille

D’où V prélevé =( Cfille *Vfille)/ Cmère

Les échantillons 1 2 3 4 5

Les
5 10 20 30 40
concentrations

Le volume
1.25 2.5 5 7.5 10
prélevé

Le protocole de préparation des solutions filles :

-Prélever le volume Vp à partir de la solution mère à l’aide d’une pipette jaugée

-Insérer ce volume dans une fiole jaugée de volume 25 ml.

-Ajouter l’eau distillée jusqu’au trait de jauge.

3. Dosage de SXM par HPLC dans les étalons :

- Fixer le débit de phase mobile qui est égale 1 l/min (50% d’eau et 50% d’ACN) et celui de la
phase stationnaire.
- Fixer trois longueurs d’onde différentes qui appartiennent au UV-Visible dans le système.
- Prélever un volume de 20 µl de chaque échantillon par une seringue spécifique.
- Injecter ce volume dans le système d’injection et le faire tourner pour commencer l’analyse.
- A partir du chromatogramme présenté sur l’écran de l’ordinateur, déterminer l’air le plus élevé
pour chaque échantillon selon une longueur d’onde spécifique.

Les échantillons 1 2 3 4 5

Les
0 10 20 30 40
concentrations

Les airs 0 577.7577 1481.9 2400.9 3704.3

 Air = f (concentration)
4000

3500 y = 102,99x - 533,44

R² = 0,9913
3000

2500
Air

2000

1500

1000

500

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Concentration

-Cette courbe illustre que les concentrations et les airs sont proportionnelles.

-A partir de nos résultats de dosage, on obtient une courbe croissante et elle est linéaire de
l’équation suivante : y = 102,99x - 533,44

4. Détermination de teneur massique de SXM par HPLC dans le comprimé ‘’Bactrim Forte’’

-On a prélevé un volume de 20 µl d’une solution contient 0.1 g de comprimé ‘’Bactrim forte’’.

-On a injecté ce volume dans le système d’injection.

-A l’aide du chromatogramme présenté sur l’écran de l’ordinateur, on a trouvé l’air est égale 10000
mm.

-Cet air est très grande, d’où, il faut diluer la solution 5 fois.

-Après le deuxième dosage, on a trouvé l’air de la solution dilué est égale 2 505,428 mm2.

- En utilisant l’équation de la courbe d’étalonnage, on a :

𝑦+533.44 2505.428+533.44
Cdilué= x = AN : Cdilué= = 29.51 ppm
102.99 102.99

-Détermination de la concentration de la solution initiale contenant le comprimé :

𝐶𝑚è𝑟𝑒
On n= 𝐶𝑓𝑖𝑙𝑙𝑒
➔ Cmère = n * 𝐶𝑓𝑖𝑙𝑙𝑒 AN : Cmère = 5 * 29.51 = 147.55 ppm

-Détermination de la teneur de SXM présenté dans la solution de comprimé :

𝑚𝑆𝑋𝑀 147.55 𝑔
On a CSXM = 𝑉𝑇
➔ mSXM = CSXM* VT AN : mSXM = 106 𝑔
* 500 g = 0.0737

0.0737
➔% SXM = 0.1
*100 = 73.7%

D’après nos résultats, on conclure que la quantité du sulfaméthoxazole est plus élevé que celle du
Triméthoprime dans le comprimé ‘’Bactrim Forte’’.
Conclusion :
La HPLC a la possibilité de séparer et d’identifier les composés qui sont présents dans ou échantillon
qui peuvent être dissous dans un liquide en concentrations infimes. Cette précision permet d’utiliser
la HPLC dans une variété d’applications industrielles et scientifiques comme les produits
pharmaceutiques, l’environnement, la médecine légale et les produits chimiques.