CHU BAB-EL-OUED LABOTOIRE CENTRALE

UNITE DE BIOCHIMIE

TP N° 7
Dosage des protéines urinaires et du LCR
méthode au Rouge de pyrogallol

courbe d'étalonnage
1,5

0,5

0
0 2 4 6

Responsable du TP : TP réalisé par :

-Dr RACHID -Dr Yahia cherif. A

 I. Introduction
La concentration de protéines dans le liquide céphalorachidien (LCR) mesurent couramment l’intégrité de la
barrière hémato-encéphalique. Des concentrations élevées sont associées à des processus inflammatoires.
Ces valeurs sont augmentées en cas de méningite bactérienne, de tuberculose, d’abcès cérébral, d’accident
vasculaire cérébral, d’encéphalomyélite et d’autres processus dégénératifs qui causent la maladie
neurologique. Des concentrations élevées de protéines se retrouvent dans l’urine en cas de lésion rénale, tels
que le syndrome néphrotique, la glomérulonéphrite, l’insuffisance rénale et des tumeurs rénales malignes.
Un test de laboratoire unique ne peut pas établir un diagnostic. Les résultats doivent être évalués dans le
contexte de toutes les données cliniques et de laboratoire obtenus.

II. Modalités de prélèvements

Urines (miction ou recueil fractionné).
Urines de 24 h : Urines fraîchement collectées, conservées à 2-8°C, Sans conservateur, centrifugées 10
minutes à 3000 tr/min et dont le pH est ajusté à 7,0
-Stabilité dans les urines : • plus d’un an à – 20°C.

NB : Le dépistage d’une protéinurie se fait par bandelette réactive. En présence de protéines anioniques, il y a un
virage de couleur de l’indicateur, passant du jaune-vert au bleu.
Le seuil de détection est de 150 mg/l
Les résultats sont exprimés de façon semi-quantitative :
Négatif (<0.15 g/l) ; Traces (0.15 g/l) ; + (0.3 g/l) ; ++ (1 g/l) ; +++ (3g/l) ; ++++ (20-30g/l).

LCR : Fraîchement collecté, et centrifugé avant analyse.

-Stabilité dans le LCR :
• jusqu’à 72 h à 2-8°C.
• 6 mois à - 20°C.
• indéfiniment à – 70°C.

I. Méthode de dosage :
La méthode décrite est celle de Fujita modifiée par Watanabe et al. Le rouge de Pyrogallol combiné au
molybdate de sodium forme un complexe coloré rouge qui absorbe à 460 nm. En milieu acid PH 2,5, la
fixation de ce complexe sur les groupements aminés des protéines déplace le pic d’absorption à 600 nm.
L’intensité de la coloration bleue mesuré à 600 nm (580-620) est proportionnelle à la concentration en
protéines dans l’échantillon.

Avantages Inconvenants
-bonne sensibilité
-bonne linéarité -interférence de HB
-automatisable

1- Mode opératoire
Préparation des solutions filles
A partir d’une solution d’albumine à 5 g/l on prépare une gamme d’étalonnage (dilutions à partir de la
solution mère).
C’est ainsi qu’on obtient le tableau suivant :
 N° 1 2 3 4 5 6 7 8
Cf (g/l) 0,04 0,2 0,25 0,5 1 2 3 4
Vm (ml) 8x10¯³ 4x10¯² 5x10¯² 0.1 0,2 0,4 0,6 0,8
Veau (ml) 0,992 0,960 0,95 0,9 0,8 0.6 0,4 0,2
distillé
V final (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1

Un exemple de calcul :

Cm .Vm = Cf . Vf

Vm = (Cf . Vf)/ Cm = (0,5 . 1)/5= 0,1 ml

Donc, on prélève 0,1 ml de la solution mère (Vm) et on ajoute 0,9 ml d’eau distillée pour obtenir un
volume final de 1 ml.

Le protocole

✓ Matériel nécessaire :
-Spectrophotomètre réglé à λ =600 nm (580-620 nm)
-Cuve de dosage d’1cm de trajet optique ;
-Equipment du laboratoire : Portoir, Tubes secs, Pipettes
-Réactifs : prêt à l’emploi

✓ Dosage proprement dit

20 µl d’échantillon + 1ml de réactif, Mélanger et laisser reposer pendant 10 minutes à température

ambiante (20-25ºC). Lire l’absorbance

Lecture des densités optique de chaque solution au spectrophotomètre à une longueur d’onde λ= 598nm

✓ Limites de détection et linéarité :

Limite de détection (théorique) : 40 mg/l

Limites de linéarité (théorique) : 2000 mg/L en utilisant la technique normale.
Remarque : sur le tableau est mentionné l’absorbance corrigée après soustraire l’absorbance du
blanc réactif qui est 0,187 A

N° B 1 2 3 4 5 6 7 8
Cf 0 0,04 0,2 0,25 0,5 1 2 3 4
(g/l)
DO 0,187 0,069 0,134 0,15 0,202 0,38 0,652 0,713 0 ,778

Après la détermination des DO, on trace la courbe DO = f(C)

Commentaire de la courbe
La courbe tracée est une droite qui passe par l’origine.

- La relation entre l’absorbance et la concentration est linéaire de type Y = a X

- La linéarité pratique est de 2 g/l
 Par extrapolation des absorbances mesurées par spectrophotomètre à λ=600 nm sur la courbe
d’étalonnage, nous avons trouvé les résultats suivants :

o Les contrôles PCC1 et PCC2

Echantillons PCC1 PCC2

DO 0,129 0,495
Concentration (g/l) 0, 2 1,3

Interprétation

La norme de precinorm TPC 3 [0.170-0.314] et TPU3 [0.157-0.259] C’est validé

La norme de Pricipath TPC3 [1.23-2.25] et TPU3 [1.17-1.89] C’est validé

Interprétation
• Valeur usuelle
-Dans les urines (miction) < 0,15 g/L
-Dans le LCR
Prématuré 0,15 - 1, 3 g/L Nouveau-né 0,40 - 1,2 g/L
< 1mois 0,20 - 0,80 g/L > 1 mois- jusqu’à adulte 0,15 - 0,40 g/L

II. Exploration Physiopathologique :

-Le dosage des protéines urinaires est un élément essentiel dans la démarche diagnostique et le suivi
thérapeutique des patients atteints de pathologies glomérulaires ou tubulaires, ou présentant des
protéinuries dites de « surcharge » (présence de chaînes légères associées à une gammapathie
monoclonale, hémoglobinurie observée lors d'épisodes d'hémolyse...). La protéinurie est élevée dans ces
cas.

-De même, le dosage de la protéinorachie est une aide dans le diagnostic de méningites, encéphalites,
poliomyélite, neurosyphilis, tumeurs du système nerveux central ou hémorragies cérébrales. La
protéinorachie est élevée dans ces cas.