ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCE DE L’ALIMENT ET DES INDUSTRIES

AGROALIMENTAIRES

Niveau : 3ème année

Module : Biochimie alimentaire

Compte rendu du TP.3.

Dosage des protéines par la méthode de Bradford.

Réalisé par :

-Chebout Affaf

-Djebalia Aicha Nakhla Widad

-Bourenane Melyssa

-Diri Nedjima

-Derder Anissa

Groupe : 03
Plan du travail :

1. Introduction
2. Matériel et méthodes
2.1 Produits et réactifs
2.2 Matériel
2.3 Principe de la technique
2.4 Protocol expérimental
3. Résultats et discussion
4. Conclusion
Introduction :

Les protéines sont des composants importants pour l'alimentation animale, dont leur quantité
diffère d’un aliment à l’autre, et pour la déterminer, il existe plusieurs techniques de dosages
protéiques utilisées aux laboratoires biochimiques, parmi les, La méthode de Bradford qui est
une méthode d'analyse spectroscopique utilisée pour mesurer la concentration des protéines
en solution.

Objectif du TP :

- Compréhension du principe des méthodes de dosage spectrophotométriques.

- Détermination de la quantité des protéines dans un milieu.
Matériel et méthodes :

a-Matériel et produit :

❖ Verrerie.
❖ pH-mètre.
❖ Spectrophotomètre UV-visible.
❖ Centrifugeuse.
❖ Plaque agitatrice.
❖ Vortex.
❖ Tube à essai.
❖ Micropipettes.
❖ BSA (Bovin Serum Albumin): protéine de référence soluble à 100% .
❖ Réactif de Bradford (G250) : bleu de Coomassie préalablement préparé (capacité de se
fixer à quelques acides aminés).
❖ Eau distillée à pH8.
❖ Eau distillée.

b-Méthode : La méthode colorimétrique de Bradford.

-Principe :

La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, établit sur le changement d'absorbance

qui se fait à 595 nm, en basant sur le changement de la couleur du bleu de Coomassie après
liaison avec les acides aminés basiques (arginine, histidine, lysine) et les résidus hydrophobes
des acides aminés aromatiques présents dans les protéines ; dont l'absorbance est
proportionnelle à l’intensité de couleur, indiquant donc la concentration en protéines dans
l'échantillon.

-Protocol :

NB : durant le TP , les étudiants on prélever 1 ml de plus de chaque solution

demandée , exemple : L’ajout de 3 ml de bleu de Coomassie au lieu de 2 ml.

1/ Courbe D’étalonnage :

Les concentrations sont déterminées par référence à une gamme étalon de BSA, dont la
concentration varie de 0 à 100 ug/mL, préparée dans les memes conditions opératoires que les
échantillons.

- Préparer une solution mère de BSA (0.5mg/ml) : 50 mg dans 100 ml.

- Préparer des dilutions (10ml) de la solution mère de BSA : 100, 80, 60, 50, 40, 20, 0
ug/ml.
 Concentration(ug/ml) 100 80 60 50 40 20 0

V1 (DM, ml) 2 1.6 1.2 1 0.8 0.4 0

Eau (ml) 8 8.4 8.8 9 9.2 9.6 10

Volume total (ml) 10 10 10 10 10 10 10

« Tableau qui représente les différentes dilutions préparées à partir d’une solution
mère »

- Prélevez 1ml de chaque concentration et mettez les dans un tube à essai.

- Ajouter 2 ml de réactif de Bleu de Coomassie.
- Vortexer les tubes et incuber à l’obscurité pdt 5min.
- Lire l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un spectophotomètre UV-Visible, tout en
considérant le tube à concentration 0 en BSA comme Blanc. (voir tableau ci-dessous)

Concentration (ug/ml) 0 20 40 50 60 100

Absorption 0.00 0.314 0.585 0.628 0.705 0.810

2/Dosage des protéines d’une suspension préparée :

- Procéder exactement comme la courbe d’étalonnage mais cette fois-ci avec une
solution protéique préparée.
- Prélever 2 ml de réactif de bleu de Coomassie.
- Ajouter 1 ml de la suspension protéique et le mettre dans un tube à essai.
- Vortexer les tubes et incuber à l’obscurité pdt 5min.
- Lire l’absorption à 595 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible. (voir tableau
ci-dessous)

Tube 1 2

Absorption 0.648 0.794

Moyenne M= 0.721
►Réponses aux questions du compte rendu :

- Courbe d’étalonnage :

- Calcul de la concentration de la suspension en protéine en utilisant les deux

méthodes et en exprimant la quantité en mg :

●méthode 01 : Après extrapolation , la concentration de la solution fille = 75ug/ml

Donc : avant dilution = 75×10 = 750 ug/ml

Sachant que la solution mère est en mg/100 ml, donc :

750 ug/ml × 100/100 = 75000 ug/100 ml = 75 mg/100ml

Alors la concentration = 0.75 mg/ml

●méthode 02 : On a Y = a.x+b → absorption = pente×[C]+b

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑝𝑡𝑖𝑜𝑛−𝑏 𝑌𝑥2−𝑌𝑥1 0.7−0.460
[C]= → pente = = = 7.5× 𝟏𝟎−𝟑 .
𝑃𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥2−𝑥1 72−40

0.721−0.157
[C] = = 75.2 ug/ml → avant dilution = 752ug/ml (solution fille)
7.5×10−3

C = 0.752 mg/ml (solution mère)

 - Les avantages et les inconvénients de la technique de dosage utilisée :

Avantages Inconvénients

- Rapide. - Elle est linéaire sur un intervalle

- Sensible.
- Homogène.
- Précise.
- moins sensible aux interférences
par divers agents présents dans les
échantillons de protéine ;
contrairement aux autres méthodes
de mesure des protéines.
étroit, typiquement de 2 µg/ml à
120 µg/ml, ce qui rend nécessaire
des dilutions préliminaires de
l'échantillon tissulaire avant
analyse.
- Les acides aminés, les peptides et
les protéines de bas poids
moléculaire (<3000 Da) ne sont pas
détectés par cette méthode.

- Principes d’autres techniques de dosage des protéines :

Technique Principe

- Méthode de dosage indirecte de la concentration des protéines via

leur contenu azoté : l’échantillon est soumis à une hydrolyse à l’acide
Johann Kjeldahl sulfurique chaud qui libère le contenu azoté.
(1883)

-Les ions cuivriques interagissent avec la liaison peptidique à pH

alcalin et forment un complexe violet dont l’absorbance est mesurée à
Biuret (1949) 540 nm.

-Méthode qui combine le réactif du biuret et celui de Folin-Ciocalteu

(1927) : l’acide phosphotungstomolybdique réagit avec les résidus
Lowry (1951) Tyr et Trp , il se forme un complexe bleuté dont l’absorbance est
mesurée entre 500 nm et 750 nm ( ça dépendra du dosage en
protéines).

- On mesure l'absorption à 280 pour faire un dosage quantitatif ou

semi-quantitatif d'une solution protéique. Le tryptophane absorbe
Dosage de protéines fortement à 280 nm de même que, dans une moindre mesure, la
totales par mesure tyrosine. La phénylalanine et la cystine ont aussi de faibles
d’absorbance à 280nm absorptions dans cette région de l'U.V. rapproché. Il est donc possible
de doser les protéines en mesurant l'A280 (Layne, 1957).
Conclusion :

❖ Afin de déterminer la quantité de protéines dans une solution , on utilise les techniques
de dosage.
❖ A l’aide d’une courbe d’étalonnage, on peut déterminer la concentration d’une
solution mère.

Références web-graphiques :

❖ http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/prodosage.html
❖ https://fr.vwr.com/store/product/8607299/dosage-de-proteines-bradford-qualite-
proteomique