UNIVERSITE SULTAN MOULAY SLIMANE

Faculté des Sciences et Techniques Beni-Mellal

Département des Sciences de la Vie

Licence Sciences et Techniques

Technologie et Qualité des Produits Agroalimentaires

Travaux Pratiques de Génie Enzymatique

Année Universitaire 2016 - 2017

Pr. Mustapha. ZEDDOU

 SOMMAIRE

TP 1. Extraction de l’Invertase, réalisation d’une gamme étalon pour le dosage

du sucre par la méthode au DNS, et détermination de la vitesse initiale de la

réaction catalysée par l’invertase.

Ø Partie I : Il s’agit dans un premier lieu d’extraire l’Enzyme Invertase à

partir de la paroi de Saccharomyces Cerevisiae présente dans la levure

boulangère.

Ø Partie II : Réaliser une gamme étalon pour le dosage des sucres par la

méthode colorimétrique à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS).

Ø Partie III : Déterminer la vitesse initiale de la réaction de transformation

du saccharose en sucre inverti, catalysée par l’invertase.

TP 2. Immobilisation de l’invertase en bille d’alginate. Utilisation en

bioréacteur

1- Inclusion de l’enzyme dans l’alginate

2- Détermination de l’activité libre mise en jeu

3- Détermination de l’activité immobilisée

4- Cycles en bioréacteur
TP 1. Extraction de l’Invertase, réalisation d’une gamme étalon pour le

dosage du sucre par la méthode au DNS, et détermination de la vitesse

initiale de la réaction catalysée par l’invertase.

I- Généralité

Le saccharose est un disaccharide non réducteur, dextrogyre ([ ]20= +66,5° ). Il

est formé de Glucose et de Fructose liés par leurs carbones anomériques. Il est

obtenu à partir de la canne à sucre, de la betterave ainsi que d’autres plantes,

et est extensivement utilisé comme aliment et édulcorant.

L’invertase ou ß-fructofuranosidase est l’Enzyme qui catalyse l’hydrolyse du

saccharose en un mélange équimolaire de glucose et de fructose selon la

réaction :

Le mélange est ainsi formé de deux sucres réducteurs dont le pouvoir rotatoire

global est levogyre ([ ]20= -20° ). Il s’agit d’un sucre invertis, est l’enzyme qui

catalyse la réaction est ainsi appelée invertase. L’activité Enzymatique de

l’invertase peut être suivie en dosant les sucres libérés en utilisant les

méthodes suivantes :

• méthode polarimétrique : En mesurant la variation du pouvoir rotatoire

en fonction du temps d'hydrolyse.

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 • La méthode au ferrocyanure de potassium

• La méthode à la glucose-oxydase

• Par réduction à la liqueur de Fehling ou au réactif de Barfoed

• La méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique ou DNS (méthode utilisée

dans le présent TP).

L'activité enzymatique est une mesure de la quantité d'enzymes active dans

une préparation. En biochimie, l'unité enzymatique (symbole U) est une unité

d'activité enzymatique représentant la quantité d'enzyme nécessaire pour la

transformation d’ 1 µmol de substrat en une minute dans des conditions de

pH et T qui doivent être précisées avec la mesure.

Pour des solutions contenant des enzymes, on peut également exprimer des

activités volumiques en terme d'U/mL.

L'activité spécifique des préparations plus ou moins purifiées s'exprime

souvent en U/g de protéines totales.

II- But du TP1

Ø Partie I : Il s’agit dans un premier lieu d’extraire l’Enzyme Invertase à

partir de la paroi de Saccharomyces Cerevisiae présente dans la levure

boulangère.

Ø Partie II : Réaliser une gamme étalon pour le dosage des sucres par la

méthode colorimétrique à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS).

Ø Partie III : Déterminer la vitesse initiale de la réaction de

transformation du saccharose en sucre inverti, catalysée par l’invertase.

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Partie I : Extraction de l’invertase

Une enzyme exprimée par une cellule peut être intra-cellulaire, extra-cellulaire

ou membranaire. L’invertase étant une enzyme intra-cellulaire, son extraction

nécessite la rupture de la membrane cellulaire.

Matériel et réactifs

- levure boulangère (Saccharomyces Cerevisiae)

- pipettes

- éprouvettes

- mortier

- centrifugeuse

- tubes à centrifuger

- bicarbonate de sodium à 0,1M (préparation : 8,4 g dans 1L eau distillée).

- Tampon acétate de Na à 0,05M, pH 4,7 (4,1 g d’acetate de Na dans 1 l d’eau

distillé, ajuster le pH à 4,7 avec l’acide acétique dilué).

Mode opératoire

• Suspendre 200 g de levure boulangère dans 40 ml de bicarbonate de

sodium à 0,1M

• Incuber à 35-40°C pendant 24H

• Prélever l’équivalent de 10 g de levure (prélever à partir du culot

patteux)

• Mettre dans un mortier et broyer vigoureusement contre la paroi du

mortier pendant 5 minutes.

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 • Mettre le broyat dans un tube à centrifuger compléter à 20 ml et

équilibrer à l’aide du tampon acétate pH 4,7 et centrifuger à 5000 tr/min

pendant 5 min

• Récupérer le surnageant contenant les différentes molécules solubles,

entre autre l’invertase.

• Noter le volume total de surnageant (éprouvette).

• Ce surnagent va constituer votre solution mère d’enzyme et devra être

conserver sur glace pour les manipulations ultérieures.

Partie II : Réalisation d’une gamme étalon pour le dosage des sucres par la

méthode colorimétrique à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS).

Le 3,5-DNS (acide 3,5-dinitrosalicylique), de couleur jaune, forme

quantitativement à chaud et en milieu alcalin avec les sucres réducteurs, un

dérivé rouge orangé dont l'absorbance est mesurée à 540nm.

Matériel et réactifs

• Réactif au DNS : Mettre 150 g de tartrate double de Na et K dans un

flacon de 500 ml. Ajouter 8 g de NaOH. Dissoudre complètement le

mélange en chauffant légèrement dans 250 ml d’eau distillée. Ajouter 5 g

de DNS, couvrir avec du papier aluminium et attendre la dissolution du

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 DNS. Laisser refroidir et compléter à 500 ml avec de l’eau. Boucher

hermétiquement et conserver à l’abri de la lumière à T° ambiante.

• Solution équimolaire de fructose et de glucose à 0,005 mol/l (1g de

glucose + 1 de fructose dans 1l d’eau)

• Solution de saccharose à 0,1 M (3,42 g de saccharose dans 100 ml d’eau).

• Tampon acétate de Na à 0,05M, pH 4,7 (4,1 g d’acétate de Na dans 1 l

d’eau distillé, ajuster le pH à 4,7 avec l’acide acétique dilué).

• Tubes à essaie

• Bain marie bouillant

• Spectrophotomètre

Réalisation de la gamme étalon

N° du tube 0 1 2 3 4 5

Solution équimolaire de glucose 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

et fructose à 0,005 mol /l (ml)

H20 (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Tompon acétate pH 4,7 (ml) 1 1 1 1 1 1

Solution de saccharose à 0,1 M 1 1 1 1 1 1

(ml)

Réactif DNS (ml) 3 3 3 3 3 3

Boucher et vortexer et porter au bain marie

bouillant (5min)

H20 (ml) 6 6 6 6 6 6

Vortexer et laisser reposer 10 min à T° ambiante.

Lire les absorbances (DO) à 540 nm. Le témoin étant le tube 0.

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Résultats :

Sur Excel, tracer la courbe DO en fonction du nombre de mole du mélange

équimolaire glucose, fructose en µM / tube. Déterminer l’équation de cette

droite.

Remarque : Le développement de la coloration à 100°C et les mesures

d'absorbance devront en réalité être menés simultanément pour les essais et la

courbe étalons. Cependant, pour des raisons d’organisation, nous utiliserons

cette gamme étalon pour les manipulations qui suivront.

Partie III : Détermination de la vitesse initiale de la réaction de

transformation du saccharose en sucre inverti, catalysée par l’invertase.

Cette expérience est réalisée dans des conditions définies (pH = 4,7 et T° = 30°).

Des quantités constantes d’enzyme diluée et de substrat sont mises en contact

à des temps variables. On suit la formation du P en fonction du temps. La zone

pendant la quelle la vitesse est constante, correspond aux condition initiales, et

permet la détermination de la vitesse initiale de la réaction.

Matériel et réactifs

• Extrait enzymatique dilué (Chaque binôme devra travailler sur une

dilution qui lui sera indiquée : 1/10, 1/25, 1/50 ou 1/100. Ces dilution se

feront dans du tampon acétate pH 4,7)

• Réactif au DNS

• Tubes à essaie

• Solution de saccharose à 0,1 mol/l

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 • Tampon acétate de Na à 0,05M, pH 4,7

• Bain Marie réglé à 30°C

Mode opératoire

N° de tube 0 1 2 3 4 5

Solution de saccharose à 0,1 M 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

(ml)

H20 (ml) 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8

Tampon acétate pH 4,7 (ml) 1 1 1 1 1 1

Préincuber 5 min à 30°C

Réactif au DNS (ml) 3 0 0 0 0 0

Extrait enzymatique à la 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

dilution indiquée (ml)

incubation à 30°C pendant 0 1 5 7 10 15

(min)

Réactif au DNS (ml) 0 3 3 3 3 3

Vortexer, fermer les tubes et porter 5 min au bain

marie bouillant.

Refroidir et ajouter

H20 (ml) 6 6 6 6 6 6

• Vortexer et laisser reposer 10 min à T° ambiante.

• Lire les absorbances (DO) à 540 nm. Le témoin étant le tube 0.

• Tracer la courbe [ P ] = f (t en min)

Déterminer l’activité enzymatique volumique de l’invertase en U/ml d’enzyme

diluée et d’enzyme non diluée.

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TP 2. Immobilisation de l’invertase en bille d’alginate. Utilisation

en bioréacteur

La méthode d’immobilisation qui sera utilisée durant ce TP est l’inclusion dans

un gel d’alginate.

L'alginate est extrait d'algues brunes; ce sel de l'acide alginique est un

polymère de 2 acides hexuroniques : l'acide β-D mannuronnique et l'acide α-L-

guluronique, liés par des liaisons 1-4-glycosidiques (100 . 1000 unités). Le sel

de sodium de l'acide alginique est hydrosoluble mais le remplacement des

ions Na+ par des cations divalents Ca2+, permet le pontage des segments

homogènes par leurs groupements carboxyliques surtout d'acide α-L-

guluronique (gélification ionotropique).

Dans la fabrication des gels, il y a d'abord une dimérisation de la molécule par

la partie guluronique puis agrégation ultérieure des dimères obtenus par

d'autres ions calcium.

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Par réacteur on entend tout récipient dans lequel se déroule au moins une

étape mettant en jeu des micro-organismes ou des enzymes:

• Lorsque cette étape fait appel à des micro-organismes qui se

développent en consommant une partie d’un réactif appelé substrat et en

transformant l’autre en divers produits, le réacteur employé est un

fermenteur ;

• Si cette étape est une réaction biochimique catalysée par des enzymes

transformant un substrat en produit, elle est réalisée dans un réacteur

enzymatique.

Ce TP comportera trois étapes :

5- Inclusion de l’enzyme dans l’alginate

6- Détermination de l’activité libre mise en jeu

7- Détermination de l’activité immobilisée

8- Cycles en bioréacteur

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1- Inclusion de l’enzyme dans l’alginate

Réactifs :

• Extrait enzymatique (toujours conserver sur glace)

• Tp4,7 tampon acétate pH 4,7 a 0,05 M

• Saccharose 0,5 M

• Alginate. 2% (dissoudre 4g d’alginate dans 200 ml de tampon

acétate pH 4,7).

• CaCl2 0,15 mol/L

• Réactif DNS

• Seringue de 10 ml

Dans une seringue sans aiguille dont l’orifice a été bouché à l‘aide de parafilm

mélanger :

• 0,5 ml d’invertase diluée (vous devez utiliser la dilution qui

vous a été indiquée dans du TP acétate pH 4,7

• 2,5 ml d’alginate à 2%

Laisser tomber le mélange, goutte à goutte dans 100 ml d’une solution de

Cacl2 0,15 mol/L en agitant légèrement. Il faut chasser tout le mélange !

Laisser séjourner les billes formées pendant 30 minutes dans la solution de

Cacl2 sous agitation très modérée (pendant ce temps mort, rincer 4 tubes à

l'eau déminéralisée et les égoutter sur papier filtre. Evaluer le nombre total de

billes obtenues (une grosse = deux moyennes...): les répartir en quatre lots

égaux en sélectionnant les billes de taille moyenne pour les manipulations.

Placer les billes dans les tubes. Garder les billes non utilisées immédiatement

en tube fermé sur glace.

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 2- Détermination de l’activité libre mise en jeu

Cette manipulation a pour bit de mettre en évidence l’activité libre de la

quantité d’enzyme qui a été utilisée lors de l’immobilisation.

La détermination de l’activité enzymatique libre mise en jeu se fera selon le

protocole suivant :

0,1 ml de Solution de saccharose à 0,1 M

+ 1ml de Tampon acétate pH 4,7 (ml)

+ 1,8 ml H20

+ 0,2 ml Extrait enzymatique dilué

+ Incubation 5min à 30° C

+ 3ml du réactif au DNS

+ Vortexer, fermer les tubes et porter 5 min au bain marie bouillant.

+ Refroidir et ajouter 6 ml d’H20

+ Vortexer et laisser reposer 10 min à T° ambiante.

+ Lire les absorbances (DO) à 540 nm. Le témoin étant le tube 0.

Déterminer l’activité volumique de l’invertase libre mise en jeu en U/ml

d’enzyme diluée et d’enzyme non diluée.

3- Détermination de l’activité immobilisée et réalisation de cycle en

bioréacteur

L’activité immobilisée peut être déterminée comme suite :

+ Placer 1/4 des billes d’alginate dans la cuve (ici ça sera un bécher) avec une

agitation légère et continue.

+ ajouter 0,1 ml de Solution de saccharose à 0,1 M

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+ 1ml de Tampon acétate pH 4,7 (ml)

+ 1,8 ml H20

+ laisser reposer 5 min sous légère agitation (30°C)

+ Prélever la phase liquide et la verser dans un tube à essais contenant 3ml du

réactif au DNS

+ Vortexer, fermer les tubes et porter 5 min au bain marie bouillant.

+ Refroidir et ajouter 6 ml d’H20

+ Vortexer et laisser reposer 10 min à T° ambiante.

+ Lire les absorbances (DO) à 540 nm. Le témoin étant le tube 0.

+ Déterminer l’activité volumique de l’invertase immobilisée U/ml d’enzyme

diluée et d’enzyme no diluée.

Réaliser 5 cycles successifs selon le même protocole sur le même lot de bille

d’alginate et calculer l’activité volumique après chaque cycle.

Remarque : L’activité enzymatique calculée pour le 1er cycle va constituer la

valeur de l’activité immobilisée. Cette valeur sera aussi utilisée pour la

réalisation de la courbe du fonctionnement en cycle avec les valeurs des quatre

autres cycles.

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5- Exploitation des résultats

1- Rendement d’immobilisation. L’immobilisation d’une enzyme

entraine généralement une diminution de l’activité catalytique. Pour avoir une

idée de ce phénomène, on doit calculer le % d’activité immobilisée ou

rendement d’immobilisation.

Unités immobilisées

% d’activité immobilisée = x 100

Activité libre mise en jeu

2- Le fonctionnement du bioréacteur. Il faut tracer la courbe ΔA530nm/

5min = f (numéro du cycle).

Commenter, analyser discuter et conclure (5 lignes max).

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