Matière: Biochimie Alimentaire Responsable de la matière : Dr. REGGAMI.

Y
TP n 05 : Dosage des protéines totales dans un blanc d’œuf par la méthode du biuret

TP n° 05 : Dosage des protéines totales dans un blanc d’œuf par

la méthode du biuret
(Spectrophotométrie indirecte)

1. Introduction
De nombreuses méthodes ont été mises au point pour doser les protéines. La
méthode effectue dans le présent TP dite du biuret ; elle tire son nom de la molécule
le biuret NH2-CO-NH-CO-NH2 (obtenu par condensation de 2 molécules d’urée
NH2-CO-NH2 avec départ d’ammoniac) qui donne une coloration violette en réagissant
avec le sulfate de cuivre CuSO4 dont le maximum d’absorption est à 540 nm. Par suite
de leur analogie de structure avec le Biuret, Les peptides et les protéines donnent la
même réaction. Cette technique a été développée par Gornall et al (1949).

2. Objectif
Le but de cette manipulation est la détermination de la concentration en
protéines dans un liquide biologique (blanc d’œuf).

3. Principe
En milieu alcalin, à froid, les ions cuivriques (Cu2+) forment avec les liaisons
peptidiques un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la teinte bleue
du réactif donne finalement une coloration pourpre (bleu-violet). Cette réaction est
positive dès que la molécule possède 3 à 4 liaisons peptidiques, elle est donc utilisable
pour les protéines et les polypeptides. La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm
après avoir laissé la coloration se développer 30 min. L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des protéines.

4. Matériel et réactifs
- Spectrophotomètre.
- Eau physiologique : solution contenant 9g de chlorure de sodium (NaCl) dans 1L
d’eau distillée.
- Solution standard d’ovalbumine à 10 g/L dans de l'eau physiologique.
- Solution (s) inconnue (s) d’ovalbumine (nous utiliserons des blancs d’œuf).
- Réactif de Gornall :
- Sulfate de cuivre 5H2O : CuSO 4, 5H2O = 1,5g
- Tartrate double de sodium et de potassium : Tartrate double de Na et K = 6g
- Soude : NaOH = 30g
- Iodure de potassium : KI = 1g
- Eau distillée : H2O Q.s.p 1L (Q.s.p = Quantité suffisante pour)
- Béchers de 50 ml
- Fiole jaugée de 250 ml
- Tubes à essai de 15 ml
- Pipettes (1ml, 2ml, 5ml)
- Portoirs pour tubes à essai

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5. Mode opératoire
5.1. Préparation du Réactif de Gornall
• Dissoudre le sulfate de cuivre et le tartrate dans 500ml d’eau distillée.
• Ajouter les 30g de NaOH.
• Ajouter l’iodure de potassium et compléter à 1L avec de l’eau distillée.
* Réactif à conserver à l’abri de la lumière, dans un flacon en polyéthylène
soigneusement fermé.

5.2. Préparation des solutions de concentrations inconnues d’ovalbumine

• Peser les blancs d'œuf (utiliser des béchers). Noter les masses.
• Réaléser des dilutions au 1/50 des blancs d’œuf en eau physiologique.

5.3. Préparation d’une gamme étalon d’ovalbumine

- A partir de la solution étalon d'ovalbumine à 10 g/L, réaliser une gamme de 5
tubes (tubes n° 1-5) contenant de 2 à 10 mg d'ovalbumine par tube.
- Préparer en même temps les tubes expérimentaux qui contiendront une prise
d’essai de solutions inconnues d’ovalbumine (tubes essai 1-5).

Tube n° 0 1 2 3 4 5 E1 E2 E3 E4 E5

Solution étalon d’ovalbumine à 10 g/L (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 0 0 0

Echantillon d’ovalbumine (ml) 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1

Eau physiologique (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 0 0 0

Réactif du Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Albumine / tube (mg) 0 2 4 6 8 10

- Agiter des tubes; Attendre 30 minutes à l'obscurité à température ambiante.

- Lire les absorbances à 540 nm contre le tube témoin de la gamme: tube 0.
- Stabilité de la réaction : 30 min.

6. Résultats expérimentaux
6.1. Etablir un tableau complet de colorimétrie: N° de tube, composition des tubes,
Absorbance, quantités et concentration en ovalbumine par tube.
6.2. Tracer, sur papier millimétré, la courbe d'étalonnage : A = ƒ(quantité de
protéines/tube)
6.3. En déduire la concentration en protéines (en g/L) dans les solutions de blanc
d’œuf puis en déduire la teneur en protéines pour 100 g de blanc d’œuf.

7. Données: Composition moyenne du blanc d'œuf (% en masse) est:

Eau : 85 %
Protéines : 12,9 %
Lipides : 0,3 %
Glucides : 0,8 %
Sels minéraux : 1,0 %

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Préparation de la solution étalon d'ovalbumine à 10 g/L : (fiole jaugée de 250 ml)

- Séparer les blancs des jaunes de 5 gros œufs (la masse d’un blanc d’œuf étant
environ de 20 grammes par œuf)
- Peser 19.37g du mélange de 5 blancs d’œuf (utiliser pour cela une pipette compte
goutte en plastique pour le prélèvement).
- Transférer dans une fiole jaugée de 250 ml.
- Ajuster avec de l’eau physiologique Q.S.P 250 ml.

Un blanc d’œuf contient 12,9 % de protéines (ovalbumine).

La solution étalon d'ovalbumine à préparer 10 g/L.
10 g (ovalbumine) 12,9 %
x g (blanc d’œuf) 100 %
x=10.100/12,9= 77,51g en eau physiologique Q.S.P 1L
19.37g en eau physiologique Q.S.P 250 ml
15.50g en eau physiologique Q.S.P 200 ml

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