Labos 7 et 8 – Immunologie

Préambule

3 activités se tiendront lors du labos 7 :

 Pratique formative du protocole d’immunologie. Lors de cette expérience, les globules rouges de
mouton seront remplacés par un colorant et les autres solutions seront remplacée par de l’eau. Cette
pratique permettra de vérifier la qualité du pipetage et des dilutions en série.
 Début du projet «serre» avec la mise en terre des graines de soja (jour «0»).
 Atelier de rédaction du rapport pour le projet «serre».

Introduction

Notre corps possède plusieurs mécanismes de défense contre tout ce qui lui est étranger. Certaines de ces
défenses sont spécifiques, d’autres sont non spécifiques. Au cours de cette séance de laboratoire, l’étudiant
pourra réaliser que ces mécanismes ne sont pas mutuellement exclusifs. Il se familiarisera ainsi avec certaines
composantes d’une réponse immunitaire à médiation humorale. Dans ce laboratoire, nous étudierons les
défenses immunitaires déployées par une souris contre des globules rouges de mouton qui lui ont été injectés.

Principe

 Plasma = portion liquide du sang débarrassé des cellules sanguines.

 Sérum = Plasma débarrassé des protéines de coagulation. Dans certaines circonstances, le sérum peut
avoir été chauffé à 60° pour éliminer le complément.
 Anticorps (Ac) = immunoglobuline de souris de type IgG (anti-GRM). Les Ac que nous utiliserons ici
proviennent directement d’un sérum non-purifié. Le sérum contenant les Ac d’intérêt a été préparé en
injectant des souris plusieurs fois avec des GRM. Ceci déclenche une réaction immunitaire robuste et
permet l’obtention d’une quantité appréciable d’Ac. Le sang est ensuite prélevé, centrifugé pour éliminer
les cellules et chauffé pour éliminer le complément.
 GRM = globules rouges de mouton. Ce sont eux qui ont été utilisés pour immuniser des souris et
générer du sérum porteur d’Ac.
 Antigène (Ag) = Strictement parlant, ce sont des molécules membranaires à la surface des GRM qui ont
élicité une réponse immunitaire. Ces molécules n’ont pas été formellement identifiées mais permettront
aux Ac de se lier aux GRM.
 Complément = complément de cobaye. Noter que chez les mammifères, les molécules immunitaires
sont très semblables et le complément de Cobaye peut facilement être activés par les anticorps de souris,
assumant qu’ils soient liés à leurs épitopes.

Dans cette expérience, les Ac présents dans le sérum vont se fixer sur les Ag à la surface des GRM. Le
complément sera ensuite ajouté et sera automatiquement activé au prorata des complexes Ag/Ac formés. Une
fois activé, le complément effectuera la lyse des GRM, les membranes cellulaires seront percées, et
l’hémoglobine rouge sera libérée en solution. Les GRM plus ou moins lysés seront centrifugés et évalués pour
la quantité d’hémolyse observée.

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Un surnageant totalement clair et un gros culot de GRM témoignera de l’absence d’hémolyse tandis qu’un
surnageant coloré (rouge-orangé) et l’absence de culot témoignera d’une hémolyse totale. Un surnageant de
couleur intermédiaire jumelé à un culot plus ou moins gros témoignera d’une hémolyse partielle.

En plus de voir l’effet du complément sur la réaction immunitaire, une dilution en série du sérum sera effectuée
afin de trouver le titre, qui correspond à la plus haute dilution qui donne encore des traces d'hémolyse.
L’efficacité de la réaction sera déterminée en centrifugeant les GRM plus ou moins hémolysés. Le critère
qualitatif utilisé sera la disparition du culot de cellules jumelée à l’augmentation de l’opacité du surnageant
lorsque la concentration de l’Ac augmente.

Semaine 7, Pré-laboratoire

À lire

 PowerPoint de la semaine 7 avec une emphase particulière sur les anticorps et le complément (Fig.
43.20).
 Texte complet des séances de labo 7 et 8.

À faire

 Organigramme : Faire un organigramme résumant les étapes de la manipulation et permettant de la

réaliser sans devoir se référer au protocole. Utilisez le protocole de la semaine 8 en remplaçant les
globules rouges, le complément et le PBS 1x par de l’eau et le sérum par du colorant Apple-Green
#H25-010 (200 mg/L). Omettez les étapes 14, 17 et 18.
 Préparez un tableau montrant le contenu des tubes et laissez une colonne vide pour noter vos résultats
 Prenez connaissance du prélab pour le labo 8 et soyez sûr–e de pouvoir répondre aux questions
formatives.
 Préparez toutes vos questions techniques et théoriques concernant le labo 8. Je ne prévois pas donner
d’explication sur ce labo en dehors de la séance de labo 7.

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 Semaine 8, Pré-laboratoire

À lire

 PowerPoint de la semaine 7 avec une emphase particulière sur les anticorps et le complément (Fig.
43.20).
 Texte complet des séances de labo 7 et 8.

À faire

 Hypothèse : Rédigez une prémisse/hypothèse pour l’expérience en suivant le format usuel (Compte
tenu que…il est attendu que…).
 Organigramme : Faire un organigramme résumant les étapes de l’expérience et permettant de la
réaliser sans devoir se référer au protocole.
 Complétez les dilutions dans le tableau #1
 À quoi reconnaitriez-vous qu’un tube a une hémolyse partielle ? Maximale ? Nulle ?
 Quel type d’échantillon constitue le tube #1 ? Soyez très précis∙e.
 Que pensez-vous du pH utilisé pour la solution tampon PBS ? Anticipez-vous un problème dans ce
contexte-ci ?

Matériel

Notez qu’en Biochimie, on a coutume de préparer des tampons concentrés que l’on diluera par la suite à une
concentration optimale. Par exemple, un tampon «10x» est 10 fois plus concentré que nécessaire et il sera
typiquement utilisé à une concentration «1x». Dans certaines circonstances, on pourrait aussi vouloir l’utiliser à
d’autres concentrations moins conventionnelles (2x, 0,5x…).

 Tampon PBS 1x (Phosphate buffered saline solution, pH 7,5)

 Antisérum de souris contre les GRM (contient les anticorps) dilué à 1/____ (prenez cette valeur en
note au labo)
 Suspension de GRM (globules rouges de mouton) à 1% v/v dans une solution PBS 1x pH 7,5
 Complément de cobaye fraîchement dilué 1/30 dans du tampon PBS 1x pH 7,5
 10 éprouvettes
 1 portoir
 1 micropipette P500 (fixe) ou P1000
 1 bain-marie à 37°C
 Centrifugeuses (au moins 2 par classe)
 1 marqueur permanent
 Un pot d'ACCEL qui décontaminera les déchets biologiques

 Note : Le sérum sera déjà dilué au départ. Soyez attentifs aux instructions pour voir s’il y a modification
au protocole. Il est important de prendre en note la dilution de départ.

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 Semaine 8, Protocole : Titrage d'un antisérum hémolytique avec et sans complément

L’expérience est individuelle et vous serez noté∙e pour la qualité des résultats :
 Volume identique dans tous les tube (10%)
 Identité correcte du titre (10%)
 Qualité générale de la gradation de l’hémolyse (80%)

1. Notez la dilution initiale du sérum fourni : 1/____

2. Compte tenu de la dilution initiale ci-dessus, déduisez la dilution finale des tubes 1 à 10 et inscrivez-la dans
le tableau 1 ci-dessous.
3. Dans un portoir, placez une rangée de 10 éprouvettes sérologiques préalablement numérotées de 1 à 10 et
incluant vos initiales.
4. Dans les éprouvettes 3 à 10, déposez 0,500 ml de tampon (PBS) (ou eau, labo 7).
5. Dans l’éprouvette 1, déposez 0,500 ml de sérum de souris pré-dilué (ou colorant, labo 7).
6. Dans l’éprouvette 2, déposez 1,000 ml de sérum de souris pré-dilué (ou colorant, labo 7).
7. Transférez 0,500 ml du contenu de l’éprouvette 2 dans l'éprouvette 3 et mélangez doucement au vortex.
8. Transférez 0,500 ml de l’éprouvette 3 dans l’éprouvette 4 et mélangez doucement au vortex.
9. Répétez le processus jusqu’à l’éprouvette10.
10. Prélevez 0,500 ml du tube 10, jetez-le, puis jetez l’embout de plastique.
11. Vérifiez que vous avez bien le même volume de 0,500 ml dans vos 10 tubes. Effectuez ce type de
vérification après l’addition de chaque solution.
12. Les GRM sont fragiles et peuvent être lysés par un pipetage ou un vortex trop vigoureux.
13. Prenez un embout neuf et pipetez délicatement 0,500 ml de la suspension de GRM (ou eau, labo 7) dans
chaque éprouvette et mélangez DOUCEMENT au vortex après chaque addition.
14. Incubez pendant 5 min (température pièce). Durant ce temps, les anti-GRM vont se fixer sur les GRM et
former un complexe Ag/Ac.
15. Prenez un embout neuf et ajoutez 0,500 ml de PBS 1x (ou eau, labo 7) à l’éprouvette 1 et mélangez
DOUCEMENT au vortex.
16. Gardez le même embout et ajoutez 0,500 ml de complément (ou eau, labo 7) aux éprouvettes 2 à 10 et
mélangez DOUCEMENT au vortex après chaque addition.
17. Incubez les éprouvettes dans un bain-marie à 37°C pendant 15 min.
18. Centrifugez toutes les éprouvettes 2 min. à 2000 tours/min. La centrifugeuse doit être balancée et vérifiée
par la tech/prof.
19. Notez l'intensité de l'hémolyse de la façon suivante et soyez sûr–e de bien comprendre la notation suivante :
 Pas d'hémolyse : 0

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  Hémolyse maximale : (# du premier tube traité au complément et sans trace d’hémolyse) – (# du
dernier tube ayant une hémolyse maximale)
 Hémolyse intermédiaire : réduisez d’une unité pour chaque éprouvette suivant la dernière éprouvette
ayant une hémolyse maximale.
 Exemple : On observe une première trace d’hémolyse dans le tube 8, donc le tube 9 est le premier tube
sans hémolyse; On observe une hémolyse maximale dans les tubes 2, 3 et 4. On note les résultats comme
suit :
o Hémolyse maximale = 9-4 = 5+ pour les tubes 2, 3 et 4.
o Hémolyse intermédiaire = 4+, 3+, 2+, et 1+ pour les tubes 5, 6, 7 et 8 respectivement.
o Hémolyse nulle = 0 pour les tubes 9 et 10.
20. Établir et noter le titre des anticorps (anti-GRM) dans le sérum de souris (dilution finale donnant la
première trace d’hémolyse, tube 8 dans l’exemple ci-haut.

Tableau 1 : Hémolyse des GRM en fonction de la dilution du sérum de souris

anti-GRM par observation visuelle
Dilution
Numéro de Dilution Hémolyse
finale du Complément
l'éprouvette en série (Unités arbitraires)
sérum
1 1 –
2 1 +
3 1/2 +
4 1/4 +
5 +
6 +
7 +
8 +
9 +
10 +

Questions formatives : Immunologie

Répondre aux questions formatives suivantes qui pourraient revenir à l’examen de labo :

 Qu’est-ce que le tube #1 démontre ?

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  Que pourriez-vous conclure si le tube #1 montrait de l’hémolyse ? Il existe plusieurs possibilités
plausibles. Imaginez une façon de tester votre ou vos hypothèses pour expliquer ce résultat.
 La présence d’une hémolyse faible ou modérée dans le tube 1 invaliderait-elle l’expérience ? Expliquez
clairement.
 Expliquez pourquoi certains tubes ne contiennent pas d’hémolyse.
 Si vos résultats confrontent l’hypothèse, comment l’expliquez-vous ? Les résultats pourraient-ils être
expliqués autrement que par l’hypothèse de départ ? Autrement que par des erreurs de manipulation ?
 Quelles sont les conditions essentielles à la formation d’un complexe d'attaque membranaire par le
complément ?
 Y a-t-il eu des erreurs de manipulations ? Si oui, préciser lesquelles ainsi que leurs conséquences.
 Si nous faisions l’expérience pour la première fois, il serait utile de tester un certain nombre de témoins
tels que décrits dans le tableau 2 ci-dessous. Faite une prédiction de la couleur prévue du surnageant en
utilisant la clé suivante :
o 0 = aucune couleur
o + = couleur intermédiaire
o ++ = couleur maximale.
Expliquez ensuite ce que chaque témoin vous permettrait de déterminer.
Tableau 2 : Composition de divers témoins pour tester une réaction Ac/Ag/complément sur des GRM et
résultats anticipés
Couleur du
Échantillon GRM Sérum Complément H2O pure
surnageant
A - + - -
B - - + -
C - + + -
D + - - -
E + + - -
F + - + -
G + - - +