Immunohistochimie (IHC)

L'immunohistochimie (IHC) est une méthode qui permet de détecter des protéines ou d'autres
antigènes dans des sections de tissu. À cet effet, les sections sont exposées à des anticorps marqués
dirigés contre des épitopes de la protéine cible. Il est alors possible de visualiser une cible à l'aide
d'un marqueur, par exemple, d'un colorant fluorescent, d'une enzyme, d'un traceur radioactif ou d'or
colloïdal.

L'application des anticorps peut se faire de deux manières distinctes : par méthode directe, c'est-à-
dire en liant un anticorps conjugué à un marqueur à sa substance cible, ou par méthode indirecte, en
incubant l'anticorps primaire dans la substance cible, puis en liant un anticorps secondaire marqué à
l'anticorps primaire.

Préparation du tissu

La préparation de l'échantillon de tissu revêt une importance capitale car toute manipulation
inappropriée est susceptible d'altérer la structure du tissu, de réduire l'affinité de liaison de
l'anticorps, voire d'empêcher totalement la liaison. Pour ce faire, on utilise des fixateurs tels que le
periodate lysine paraformaldéhyde (PLP) ou le formol.

Récupération de l'Antigène

On distingue principalement deux approches distinctes, à savoir le traitement thermique, appelé «

récupération d'épitopes induite par la chaleur » (HIER), et la « récupération d'épitopes induite par la
protéolyse » (PIER). Pour appliquer ces techniques, les sections de tissu doivent avoir été
déparaffinées et réhydratées au préalable.

Les échantillons émergés sont exposés à la chaleur pendant une durée variable (généralement, entre
10 et 60 minutes), avant d'être doucement refroidis.

La récupération PIER utile des enzymes digestives, telles que la protéinase K, la trypsine, la pepsine et
diverses autres protéinases.

La durée d'incubation et les concentrations optimales doivent être testées

Méthodes de Coloration

Méthode directe

Un anticorps marqué (avec un substrat chromogène par exemple) réagit directement avec l'antigène
présent dans le tissu.

L'avantage de cette méthode réside dans le fait qu'un seul anticorps est nécessaire, ce qui rend
l'application rapide et ne génère que peu de liaisons non spécifiques. Cependant, puisque un seul
anticorps se lie à un épitope, l'intensité du signal est faible. En présence de faibles quantités
d'antigènes, il se peut que le signal soit trop faible.

Méthode indirecte (en deux étapes)

La méthode indirecte a été mise au point pour palier au problème de la faible intensité du signal de
la méthode directe. L'anticorps primaire se lie à l'antigène, puis un anticorps secondaire (marqué) se
lie à l'anticorps primaire. Le signal est amplifié du fait que plusieurs anticorps secondaires sont liés à
un anticorps primaire unique.

Méthode en trois étapes

Pour amplifier davantage le signal, il est possible d'utiliser un anticorps supplémentaire qui vient se
lier à l'anticorps secondaire. Cette méthode entraîne une troisième couche d'anticorps, qui sont tous
marqués. Cette méthode peut être utile pour colorer les antigènes ayant un nombre d'épitopes
limité.

Méthode PAP

la méthode peroxydase anti-peroxydase est très peu utilisée, cependant, elle s'est auparavant
révélée populaire dans les laboratoires de pathologie. Il s'agit d'une méthode indirecte qui se base
sur une troisième couche d'anticorps, liés à la peroxydase, venant se lier à un anticorps de la
deuxième couche non conjugué

Méthodes du complexe (strept)avidine-biotine (ABC)

L’une des méthodes les plus couramment employées pour la coloration se fonde sur l'affinité élevée
de l'avidine (œuf de poulet) et la streptavidine (Streptomyces avidinii) vis-à-vis de la biotine. Le
principe de base est que l'avidine (ou la streptavidine) réagit avec un anticorps secondaire biotynilé,
ce qui s'ensuit d'une réaction à la peroxydase de raifort.

Méthodes polymériques

Les méthodes polymériques utilisent de grands polymères liés à l'anticorps pouvant se lier à un grand
nombre de molécules, selon une moyenne, en général, de dix anticorps pour 70 enzymes environ.
Cette configuration permet d'amplifier considérablement le signal, et donc d'obtenir une sensibilité
accrue, une réduction des liaisons non spécifiques et une diminution du signal de fond. Elle permet
également la colorationsimultanée de deux antigènes différents.

Protocole : Mise au point de l’anticorps

Lecture de la fiche technique

 Espèce chez laquelle est fabriqué l’anticorps (Source/Purification)

 Stockage (Frigo/Congélateur)

 Lot (aliquote* ou pas)

 Volume d’anticorps disponible

 Dilution (Soit proposé dans la fiche technique, soit se rapporter à un article publié)

Réhydratation

Tout d’abord, pour réaliser une réaction antigène/anticorps, il faut réhydrater les tissus paraffinés sur
la lame. Donc faire les étapes inverse où l’on met le tissu dans de la paraffine.

1. 4 min dans chaque bain

 o Xylène* (3 bains)

o Alcool absolu (2 bains)

o  Alcool 90°C (1 bain)

o   Alcool 70°C (1 bain)

2. Plonger la lame immédiatement dans un récipient d’eau (pour que les tissus réhydratés ne
sèchent pas), et faire rincer pendant 3 min en faisant couler l’eau du robinet dans le
récipient.

3. Plonger la lame dans un récipient d’eau distillée

Prétraitement

1. Diluer le pH9 au 1/10 (50 ml de tampon + 500 ml d’eau distillée) dans une éprouvette
de 500 ml. Mettre la lame dans le pH9 dilué.

2. Faire chauffer au micro-onde « programmé sur vapeur », la lame dans le pH9 dilué, pendant
30 min en ne fermant pas totalement le bocal (pour que la vapeur puisse s’échapper).

3. Attendre que la solution pH9 dans le bocal refroidisse pendant 20 min.

4. Rincer la lame dans un récipient d’eau pendant 3 min.

5. Faire une délimitation des tissus, à l’aide d’un marqueur hydrophobe.

6. Déposer de H2O2 (permet de neutraliser les peroxydases endogènes (dans le tissu) en vue de
la coloration au DAB [peroxydases oxydent DAB produit coloré]) jusqu’à remplir le cadrant de
délimitation et laisser reposer 10 min dans une chambre humide (car anticorps PEA3 agit de
nuit).

7. Pendant ce temps faire une dilution adaptée de l’anticorps PEA3.

8. Rincer la lame dans un récipient d’eau.

9. Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.

10. Faire tremper la lame dans un récipient contenant un tampon de réaction (tampon de lavage
qui permet à l’anticorps de mieux se répartir sur la lame car il a un effet «mouillant»)
pendant 5 min.

11. Déposer l’anticorps (permet la fixation spécifique de l’anticorps (de souris) sur la protéine
ETV4 [marquage nucléaire]) dans le cadrant de délimitation à l’aide d’une pipette et faire
reposer la nuit au frigo.

Révélation

1. Rincer la lame avec du tampon de réaction.

2. Laisser la lame 3 min dans un récipient contenant du tampon de réaction.

3. Mettre l’anticorps de chèvre Rabbit/Mouse (cette chaîne de dextranes  sur laquelle est
couplée à l’anticorps de chèvre anti lapin/souris et est fixée un grand nombre de
peroxydase, permet la fixation d'anticorps de chèvre sur les anticorps de souris [amplifie le
signal donne une meilleure vue à l’observation microscopique]) pendant 30 min.
 4. Rincer avec du tampon de réaction.

5. Laisser la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction.

6. Préparer la dilution de la DAB (1 ml de tampon DAB + 1 goutte de DAB) à l’aide d’une pipette
compte-goutte.

7. Mettre la révélation à la DAB (révélation de l’anticorps secondaire, par l’action enzymatique

des peroxydases + DAB [produit coloré], donc localisé là où la protéine ETV4 est fixée sur
l’anticorps primaire) sur le cadrant de délimitation et laisser reposer 8 min dans une boite
hydratée cachée de la lumière.

8. Rincer la lame dans un récipient d’eau.

9. Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.

Contre-coloration

1. Plonger la lame pendant 5 à 10 secondes (si le tissu est grand) ou moins dans de
l’hématoxyline (permet de colorer les noyaux/cytoplasme/membranes qui ne sont pas
relevés par l’anticorps).

2. Rincer à l’eau jusqu’à ce que le colorant parte.

3. Mettre la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction (virage bleu des
noyaux/cytoplasme/membranes) pendant 2 min.

4. Déshydrater (Alcool 70°C Alcool 90°C Alcool absolu [x2] Xylène [x3]) et monter sous lamelle.
 Examen histologique extemporané

Il s’agit d’un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé,
pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic
susceptible de modifier le déroulement de l’acte chirurgical.

Les motifs les plus fréquents de demandes d’examens histologiques extemporanés sont :

 déterminer la nature inflammatoire ou tumorale d’une lésion et, en cas de tumeur, sa nature
bénigne ou cancéreuse pour déterminer l’importance du geste d’exérèse chirurgical ;

 s’assurer qu’une biopsie chirurgicale a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de

la maladie ;

 s’assurer que des limites de résection sont saines.

La technique utilise la macroscopie et, le plus souvent, des coupes au cryomicrotome (crystat) et une
coloration rapide, ce qui permet un résultat en moins de 30 min (figure 1.14).

Figure 1.14 : Examen histologique extemporané

A. Étude macroscopique du prélèvement frais.

B. Un fragment est prélevé et fixé sur un portoir.
C. Le fragment congelé est coupé dans un cryostat.
D. Coupe de tissu congelé colorée au Bleu de toluidine.
Cependant au cours d’un examen extemporané, la morphologie tissulaire n’est pas d’aussi bonne
qualité qu’après une fixation et inclusion en paraffine, en raison de la congélation qui altère la
morphologie cellulaire. En outre, pour respecter un délai de réponse court, il n’est pas possible
d’examiner en totalité une lésion volumineuse. Le diagnostic fourni par un examen extemporané
n’est donc pas aussi fiable qu’un diagnostic histologique conventionnel : il ne doit être considéré que
comme un diagnostic de présomption.

NB/Les tissus calcifiés ne peuvent être coupés dans un cryostat et ne peuvent donc pas faire l’objet
d’un examen histologique extemporané.

 Techniques

Le prélèvement doit être adressé immédiatement, à l’état frais, sans fixateur ni sérum physiologique.

Le plus souvent, l’examen extemporané est histologique ; il est effectué sur un tissu frais durci par
congélation (-20 °C environ) et coupé avec un microtome à congélation (microtome dans une
enceinte réfrigérée) et coloration rapide de la coupe. Cette technique permet un résultat en général
en moins de 30 minutes.