MINISTERE DE LA SANTE

DE L’HYGIENE PUBLIQUE ET
DE L’ACCES UNIVERSEL AUX SOINS

GUIDE NATIONAL DE DIAGNOSTIC

BIOLOGIQUE DU PALUDISME

Février 2021
Préface

II
Equipe de rédaction

 Prof. Améyo M. DORKENOO, Maître de conférences agrégée en Parasitologie-Mycologie

à la Faculté des Sciences de la Santé-UL-Togo et chef de Division des Laboratoires au
Ministère de la Santé, de l’Hygiène Publique et de l’Accès Universel aux Soins ;

 Dr. Yao AGBO, Médecin-biologiste au CHR Lomé Commune, Maître-Assistant de

Parasitologie –mycologie à la Faculté des Sciences de la Santé-UL- Togo ;

 Dr. Tinah ATCHA-OUBOU, Médecin de Santé Publique, Coordonnateur du Programme

National de Lutte contre le Paludisme (PNLP) ;

 M. Kossi YAKPA, Ingénieur des Travaux Biologiques de Santé publique, PNLP ;

 Dr. Essoham ATABA, Biologiste, PNLP ;

 M. Efoé SOSSOU, Ingénieur Biologiste ; Responsable Qualité, Laboratoire Microbiologie

CHU SO ; Master en Management de la Qualité (IMARQ-BF) ; Auditeur Qualité National
SLIPTA ; MSc Sciences Biomédicales ;

 M. ABOU KERIM Aguérégna, Ingénieur des Travaux Biologiques, Institut National

d’Hygiène (INH) ;

 Mme Kafui AKUTSA, Ingénieur des Travaux Biologiques, CHP Kpalimé ;

 M. Emmanuel KANTCHIRE, Ingénieur des Travaux Biologiques, MSc Professionnel en

Management de la Qualité ; Laboratoire de Parasitologie CHU Campus ;

 Mme Abla KUTOATI, Technicienne Supérieure de Laboratoire, INH.

III
 Table des matières

Préface ................................................................................................................................................. II
Equipe de rédaction ............................................................................................................................ III
Sigles et abréviations ........................................................................................................................... V
Liste des figures ................................................................................................................................ VI
Introduction .......................................................................................................................................... 2
1. Rappels sur le paludisme .............................................................................................................. 4
2. Diagnostic biologique du paludisme par le TDR .......................................................................... 8
2.1. Principe .................................................................................................................................. 8
2.2. Indications ............................................................................................................................. 8
2.3. Matériel .................................................................................................................................. 8
2.4. Mode opératoire ..................................................................................................................... 9
2.5. Résultats et interprétation .................................................................................................... 11
3. Diagnostic biologique du paludisme par la microscopie ............................................................ 14
3.1. Principe ................................................................................................................................ 14
3.2. Indication ............................................................................................................................. 14
3.3. Matériel ................................................................................................................................ 14
3.4. Mode opératoire ................................................................................................................... 15
3.4.1. Prélèvement et confection des étalements .................................................................... 15
3.4.2. Coloration ..................................................................................................................... 17
3.4.3. Recherche et décompte des parasites ........................................................................... 19
3.4.4. Identification des espèces plasmodiales ....................................................................... 21
4. Diagnostic biologique du paludisme par d’autres techniques ..................................................... 30
4.1. Diagnostic biologique du paludisme par des méthodes basées sur la biologie moléculaire ... 30
4.1.1. Principe ............................................................................................................................ 30
4.1.2. Indications ........................................................................................................................ 30
4.1.3. Les techniques disponibles .............................................................................................. 30
4.2. Techniques autres que la biologie moléculaire ....................................................................... 31
5. Quelques aspects du contrôle qualité appliqués au diagnostic biologique du paludisme ........... 33
5.1. Contrôle de qualité du diagnostic par microscopie ............................................................. 33
5.1.1. Définition ......................................................................................................................... 33
5.1.2. Contrôle interne qualité.................................................................................................... 33
5.1.2.1. Procédures de Contrôle Qualité Interne (CQI) des lames de GE et FM................... 33
5.1.2.2. Procédure du Contrôle Qualité interne de la coloration ........................................... 34
5.1.3. Contrôle de qualité externe .............................................................................................. 35
5.1.3.1. Contrôle qualité interne externalisé .......................................................................... 35
5.1.3.2. Evaluation externe de la qualité................................................................................ 35
5.2. Contrôle de qualité du diagnostic par les TDRs .............................................................. 35
5.2.1. A la réception des lots .................................................................................................. 35
5.2.2. Après la distribution ..................................................................................................... 36
5.2.3. In situ ............................................................................................................................ 36
Conclusion .......................................................................................................................................... 38
Remerciements ................................................................................................................................... 39
Références .......................................................................................................................................... 40
ANNEXES .......................................................................................................................................... ii

IV
Sigles et abréviations
AN : Acide nucléique
CIQ : Contrôle Interne de la Qualité
CPS : Chimioprévention Saisonnier du Paludisme
CQ : Contrôle de Qualité
DAOM : Déchets Assimilés aux Ordures Ménagères
DASRI : Déchets d'Activités de Soins à Risques Infectieux
FiO2 : Fraction inspirée en Oxygène
FM : Frottis Mince
FS : Formation Sanitaire
GB : Globules blancs
GE : Goutte Epaisse
HRP2 : Histidin Rich Protein 2
INH : Institut National d’Hygiène
LAL : Lutte anti larvaire
MGG : May Grunwald Giemsa
MID : Moustiquaires à imprégnation durable
NB : Numération blanche
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PaO2 : Pression partielle d'oxygène
PCR : Polymerase Chain Reaction
pd : Paire de base
PIB : Produit intérieur brut
PID : Pulvérisation intradomiciliaire
pLDH : Plasmodium lactate déshydrogénase
PNDS : Plan National de Développement Sanitaire
PNLP : Programme National de Lutte contre le Paludisme
SCAPE : Stratégie de Croissance Accélérée et de Promotion de l'Emploi
SpO2 : Saturation pulsée en oxygène
TA : Tension artérielle
TDR : Test de Diagnostic Rapide
TPI : Traitement Préventif Intermittent
VM : Ventilation mécanique
VNI : Ventilation non invasive

V
Liste des figures

Figure 1 : Cycle biologique du paludisme [5] ...........................................................................................5

Figure 2 : Composition du kit de TDR ......................................................................................................8
Figure 3 : Différentes parties de la cassette............................................................................................ 11
Figure 4 : Frottis minces et gouttes épaisses mal confectionnés ........................................................... 17
Figure 5: Coloration dans un bac ........................................................................................................... 19
Figure 6 : Sens de lecture d’une goutte épaisse et d’un frottis mince .................................................. 19
Figure 7 : Hématie parasitée ................................................................................................................... 21
Figure 8 : Aspect de l'hématie parasitée................................................................................................. 22
Figure 9 : Les trophozoïtes (jeune et âgé) .............................................................................................. 22
Figure 10 : Les schizontes ........................................................................................................................ 23
Figure 11 : Les gamétocytes .................................................................................................................... 23
Figure 12 : Microscope optique ................................................................................................................. iii

VI
Introduction
Introduction

Le paludisme demeure un problème de santé publique en Afrique Subsaharienne. L’Organisation

mondiale de la santé (OMS) estime que 3,2 milliards de personnes sont touchées dans le monde et
selon son rapport de 2019, le paludisme a été responsable de 405 000 décès dans le monde dont
94 % en Afrique subsaharienne [1]. Les femmes enceintes et les enfants de moins de cinq ans sont
particulièrement vulnérables.

Au Togo, le paludisme est endémique et demeure la première cause de morbidité et de mortalité.

Selon le rapport annuel 2019 du Programme national de lutte contre le paludisme (PNLP), il a
représenté 36% des consultations externes et 20% des hospitalisations dans les formations
sanitaires. Les cas notifiés chez les enfants de moins de 5 ans représentent 36 % en soins externes
et 58 % en hospitalisation avec une mortalité associée de 73% [2]. Selon la Stratégie de croissance
accélérée et de promotion de l'emploi (SCAPE) 2013-2017, le paludisme est responsable d’une
perte économique supérieure à 1% du Produit intérieur brute (PIB) du Togo [3].

Le plan stratégique national de lutte contre le paludisme 2017-2022 étendu à 2023 du Togo, a pour
objectifs de réduire l’incidence du paludisme d’au moins 50% et le taux de mortalité spécifique au
paludisme d’au moins 40% par rapport à 2015 [4]. L’atteinte de ces objectifs passe nécessairement
par un traitement efficace des cas conditionné par un accès rapide à un diagnostic de qualité. Pour
y arriver, l’élaboration d’un guide national de diagnostic biologique du paludisme, document de
référence destiné aux biologistes, est une des conditions de réussite.

C’est dans cette optique que le présent guide conçu, met à la disposition des professionnels de la
biologie médicale des procédures opératoires simples et standardisées pour un diagnostic
biologique de qualité des cas de paludisme dans toutes les structures sanitaires du Togo.

2
Rappels sur le paludisme
1. Rappels sur le paludisme

1.1.Définition
Le paludisme ou malaria est l’infestation de l’homme par des protozoaires du genre Plasmodium,
transmis par la piqure de moustiques femelles infestés du genre Anopheles. C’est une maladie
infectieuse fébrile et hémolysante qui constitue un problème de santé de publique et de
développement économique dans nombreux pays.

1.2.Les agents pathogènes

Il existe de très nombreuses espèces de Plasmodium (plus de 140), touchant diverses espèces
animales mais seules cinq de ces espèces sont responsables de l’infestation de l’homme.
Il s’agit de : Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium
malariae et Plasmodium knowlesi. Toutefois, plusieurs espèces peuvent être considérées dans un
futur proche comme espèces émergentes pouvant entrainer des manifestations cliniques chez
l’homme.

1.3.Cycle biologique
Ce sont des protozoaires intracellulaires dont la multiplication est asexuée ou schizogonique chez
l’Homme et sexuée ou sporogonique chez l’anophèle femelle (Figure 1). Ce cycle possède une
phase sporogonique qui se déroule chez l’anophèle femelle et une phase schizogonique chez
l’homme contaminée, subdivisée en phase exo-érythrocytaire qui se déroule dans le foie et une
phase endo-érythrocytaire qui se déroule dans les hématies.

4
 Figure 1 : Cycle biologique du paludisme [5]

1.4.Répartition géographique
Le paludisme sévit généralement dans les pays de la zone intertropicale, entre le 35ème degré de
latitude nord et le 25ème degré de latitude sud mais des cas importés de paludisme sont rapportés
dans le reste du monde.

1.5.Manifestations cliniques
De façon classique on décrit :
• l’accès palustre simple ;
• l’accès palustre grave ou paludisme grave.
Selon l'OMS, le paludisme grave se définit par la présence d’une ou plusieurs des manifestations
suivantes [6].

1.5.1. Critères cliniques de gravité du paludisme à P. falciparum selon l’OMS

• Toute défaillance neurologique incluant : Obnubilation, confusion, somnolence, prostration,
Coma avec score de Glasgow < 11 ;

5
 • Toute défaillance respiratoire incluant : Si VM ou VNI : PaO2/FiO2 < 300 mm Hg ; Si non
ventilé : PaO2 < 60 mm Hg et/ou SpO2 < 90 % en air ambiant et/ou FR > 32/min ; Signes
radiologiques : images interstitielles et/ou alvéolaires ;
• Toute défaillance cardiocirculatoire incluant : Pression artérielle systolique < 80 mm Hg en
présence de signes périphériques d’insuffisance circulatoire ; Patient recevant des drogues
vasoactives quel que soit le chiffre de pression artérielle ; Signes périphériques d’insuffisance
circulatoire sans hypotension ;
• Convulsions répétées : au moins 2 par 24 heures ;
• Hémorragie : définition purement clinique ;
• Ictère : clinique ou bilirubine totale > 50 μmol/L ;
• Hémoglobinurie macroscopique.

1.5.2. Critères biologiques de gravité du paludisme à P. falciparum

• Anémie profonde : Enfant : Hte < 15%, Hb < 5 g/dL ;
Adulte : Hte < 20% ou 7 g/dL si parasitémie>= 10 000/µL ;
• Hypoglycémie : glycémie < 2,2 mmol/L ;
• Acidose : bicarbonates plasmatiques < 15 mmol/L ou acidémie avec pH < 7,35 (surveillance
rapprochée dès que bicarbonates < 18 mmol/L) ;
• Toute hyperlactatémie : dès que la limite supérieure de la normale est dépassée ; a fortiori si
lactate plasmatique > 5 mmol/L ;
• Hyperparasitémie : dès que parasitémie > 4 % ;
• Insuffisance rénale : créatininémie > 265 μmol/L ou urée sanguine > 17 mmol/L, et diurèse
< 400 mL/24 heures malgré réhydratation.

1.6.Diagnostic biologique du paludisme

Le diagnostic biologique du paludisme se fait au moyen d’un examen microscopique ou d’un Test
de Diagnostic Rapide (TDR) avant l’administration de traitement selon l’OMS [7]. En plus de ces
derniers, les techniques de biologie moléculaire qui sont plus sensible et plus spécifique.
Cependant, elles sont utilisées pour poser le diagnostic de certitude de toutes les espèces
plasmodiales et pour rechercher les marqueurs de résistance des antipaludiques lors des
évaluations.

6
Diagnostic biologique du
paludisme par le TDR
2. Diagnostic biologique du paludisme par le TDR
2.1.Principe
Le Test de Diagnostic Rapide (TDR) pour le paludisme est une méthode diagnostique basée sur la
détection d’antigènes plasmodiaux par immunochromatographie à l’aide d’un anticorps
monoclonal spécifique. Le TDR permet de mettre en évidence les antigènes spécifiques du
Plasmodium falciparum de type HRP2 (Histidine Rich Protein) et de type enzymatique produits
par le Plasmodium comme le Plasmodium lactate déshydrogénase (pLDH) et l’Aldolase.

2.2.Indications
- Utile en l’absence de personnel qualifié, d’électricité et de plateau technique ;
- Recommandé pour les structures sanitaires ne disposant pas de laboratoire et en
consultation clinique.

2.3.Matériel
Le kit de TDR est constitué d’un support (cassettes, bandelettes etc..) sous emballage hermétique,
anses de prélèvement, flacon de solution tampon, lancettes stériles, tampons alcoolisés. La
composition ou la forme des composantes du kit de TDR peut variée en fonction de la marque. A
cela s’ajoutent un chronomètre, un crayon/marqueur, des gants d’examen, un stylo, un support
d’enregistrement et des poubelles (boites de sécurité et les poubelles pour DASRI et DAOM).

Tampon alcoolisé Lancette

Anse de prélèvement

Cassette
Dessicant hors emballage
Cassette sous emballage Solution tampon

Figure 2 : Composition du kit de TDR

8
 2.4.Mode opératoire
Le mode opératoire varié en fonction de la marque du TDR.

 Vérifier l’intégrité de l’emballage et la date de péremption ;

 Porter les gants et ouvrir le test au moment de son utilisation ;

 Vérifier la couleur du dessicant (conformément aux indications

du fabricant) ;

 Utiliser une surface propre et plane ;

 Identifier la cassette/bandelette en inscrivant le nom/prénom ou
code du client, ainsi que la date et l’heure de réalisation du test
au crayon/marqueur ;

 Désinfecter la pulpe d’un doigt d’une main à l’aide d’un tampon

imbibé d’alcool (de préférence 3ème ou 4ème doigt d’une
main) ;
NB : pour le nourrisson ou le nouveau-né, utiliser le gros orteil ou le talon.

 Laisser sécher le doigt ;

 Piquer d’un geste franc avec une lancette (vaccinostyle) ;

9
 Jeter immédiatement le vaccinostyle dans la boîte de sécurité ;

 Presser le doigt et prélever la quantité de sang indiquée par le

fabriquant (5µl) à l’aide de l’anse de prélèvement ;

NB : Il n’est pas nécessaire d’essuyer la première goutte.

 Déposer les 5µl de sang (sans appuyer) dans le puits indiqué

 Déposer le nombre de gouttes (en général 4 gouttes) de solution

tampon de lyse (Buffer) dans le puits approprié ;

 Laisser reposer la cassette sur une surface plane ;

 Lire entre 15 et 30 minutes, selon la durée indiquée par le
fabricant ;
NB : Au-delà du délai indiqué par le fabriquant, le résultat n’est plus
valable

 Jeter les déchets issus de la manipulation conformément aux

procédures de gestion des déchets biomédicaux.

10
 2.5.Résultats et interprétation
Les résultats du TDR sont lus dans la fenêtre de lecture (Figure 3).

Fenêtre de lecture Puits pour Puits pour la

l’échantillon de sang solution tampon
du résultat

Figure 3 : Différentes parties de la cassette

 Exemple de résultat d’un test de type HRP2 seul

 Le test est valide si une bande rouge apparait au niveau

de la ligne contrôle (C).
 Le test est positif si en plus de la bande rouge de la ligne
contrôle (C), une deuxième bande rouge apparait au
niveau de la ligne test Pf ou T.

 Le test est négatif si une seule bande rouge apparait sur

la ligne contrôle (C).

 Le test est invalide si aucune bande n’apparait dans la

fenêtre de lecture ou si aucune bande n’apparait sur la
ligne contrôle (C), même en présence de bande qui
apparait sur la ligne Pf ou T.

11
  Exemple de résultat d’un test de type Pf/Pan

Les TDRs de type Pf/Pan utilisent une paire d’anticorps mono et polyclonaux contre la protéine
spécifique du P. falciparum, l’histidine répétée de la protéine 2 (pHRP-2) et une paire d’anticorps
monoclonaux contre pLDH (une protéine produite par les quatre espèces de plasmodium)
permettant donc une détection simultanée et différenciée de P. falciparum ou des trois autres
espèces de Plasmodium. Cependant, ce test dispose de trois bandes de lecture : une première pour
le contrôle, une seconde pour P. falciparum et une troisième pour toutes les espèces de
Plasmodium.

 Le test est valide si une bande rouge apparait au niveau

de la ligne contrôle (C).
 Le test est positif si en plus de la bande rouge de la ligne
contrôle (C), une deuxième et/ou une troisième bande
rouge apparait au niveau de la ligne Pf et/ou Pan.

 Le test est négatif si la bande rouge apparait sur la ligne

contrôle (C) seule.

 Le test est invalide si aucune bande n’apparait dans la

fenêtre de lecture ou si aucune bande n’apparait sur la
ligne contrôle (C), même si une bande apparait sur la
ligne Pf et/ou Pan.

12
 Diagnostic biologique du
paludisme par la microscopie
 3. Diagnostic biologique du paludisme par la microscopie
3.1.Principe
La microscopie est une méthode diagnostique biologique du paludisme, basée sur la goutte épaisse
et le frottis mince. Elle permet de mettre en évidence le parasite sous ses différents stades évolutifs,
d’identifier l’espèce et d’estimer la parasitémie (ou la densité parasitaire).

3.2.Indication
Cette méthode est réalisée par un personnel qualifié dans les structures sanitaires disposant d’un
plateau technique adapté. C’est la méthode de référence recommandée par l’OMS.

3.3.Matériel

Equipements Consommables Réactifs

 Blouse,  Gants,  Solution de Giemsa,

 Flacon compte-goutte,  Lames porte objet,  Solution de Méthanol

 Baguettes,  Vaccinostyles ou de May-Grünwald,

 Eprouvette graduée, stériles,  Alcool 70°,

 Poire,  Coton hydrophile,  Comprimé tampon

 Minuterie,  Pipette pasteur, (pH 7,2),

 Pipette de transfert,  Papier lentille,  Eau distillée ou eau

 Séchoir (sèche-cheveux…),  Papier absorbant ou de robinet,

 Râtelier/portoir, essuie tout.  Huile à immersion,

 Boîte de rangement pour lames,  Boite de conservation  Savon/détergents,

 Microscope optique binoculaire de lames  Eau de javel.

fonctionnel avec housse de protection,

 Compteurs à une ou à deux touches, ou
hémoleucomètre ou encore compteur
électronique à touche
 Calculatrice,
 Papier pH ou pH-mètre,
 Boîte de sécurité et Poubelle à pédales,
 Tissu propre en coton non pelucheux.

14
 3.4.Mode opératoire
3.4.1. Prélèvement et confection des étalements
Le sang peut être recueilli par ponction veineuse sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA)
ce qui permet de multiplier les techniques diagnostiques avec le même prélèvement (TDR,
plusieurs confettis pour la PCR, réalisation de plusieurs étalements).
En pratique, les étalements à partir de prélèvement capillaire sont les plus utilisés.

Matériel de prélèvement :
 Crayon à papier,
 Lame porte-objet propre et bien dégraissée,
 Lancette stérile,
 Coton hydrophile,
 Alcool à 70°.

1. Identifier le doigt et vérifier s’il est sain. Choisir

l’emplacement de la piqûre (sur le côté de préférence) ;
2. Désinfecter le doigt choisi avec un tampon d’alcool 70° ;
3. Essuyer l’excès d’alcool avec un tampon de coton sec ou
laisser sécher.

4. Maintenir le doigt et piquer sur la pulpe d’un geste franc

et rapide avec un vaccinostyle.

5. Presser doucement la pulpe piquée (si nécessaire) pour

faire sortir une première goutte de sang.
6. Essuyer la première goutte de sang avec du coton sec
7. D’une main, prendre une lame en la tenant par les bords.
De l’autre main, presser le doigt dont la pulpe est piquée
pour faire sortir une deuxième goutte de sang.

8. Recueillir une goutte de sang au milieu de la lame. Elle

servira à réaliser le frottis mince.
9. Appuyer de nouveau sur le doigt pour faire sortir le sang
et recueillir une grosse goutte (ou deux ou trois petites
gouttes) à environ 1 cm de la goutte précédente. Elle
servira à réaliser la goutte épaisse.

15
 10. Réaliser le frottis mince en faisant un étalement avec la
première goutte de sang à l’aide d’une deuxième lame
propre ou d’une lame rodée.

11. Avec le coin de la deuxième lame (ou de la lame

rodée), rassembler rapidement les gouttes de sang et les
étaler pour former une couche épaisse uniforme en un
cercle de 1 cm de diamètre.

12. Si nécessaire, faire une deuxième lame pour les besoins

de conservation ou de recherche.

13. Laisser sécher à l’air libre les étalements en position

horizontale à l’abri des mouches et de la poussière.

Nom/Prénom
14. Identifier la lame en écrivant sur la tête du frottis
(nom/prénoms ou code) Ou Code

N° 215

15. Eliminer les déchets issus de la manipulation conformément aux procédures de gestion des
déchets biomédicaux.

Attention, certaines erreurs de manipulations sont à éviter.

Les causes d’erreur lors de la réalisation de frottis mince et de goutte épaisse :

- Queue de frottis inexistante remplacée par une condensation rectiligne de sang :
mouvement arrêté avant la fin de l’étalement ou goutte déposée trop volumineuse ;
- Lacune dans le frottis due à des lames non ou mal dégraissées ;
- Etalement avec lame dont le bord est ébréché ;
- Angle aigu ou obtus pour la deuxième lame utilisée pour tirer le frottis ;

16
 - Goutte épaisse confectionnée avec une trop grande quantité de sang ;
- Taille de la goutte épaisse trop grande.

Frottis irrégulier et taille de la goutte

Lame à bord ébréché ou rugueuse
épiasse trop large

Quantité de sang trop grande Quantité de sang insuffisante

Figure 4 : Frottis minces et gouttes épaisses mal confectionnés

3.4.2. Coloration
 Procédure de préparation des colorants

Matériel de coloration :
-
Agitateur,
-
Eau distillée dans deux béchers de coloration à large col,
-
Minuteur ou chronomètre,
-
Râtelier à lames,
-
Solution tampon a pH 7,2 (préparée en mettant un
comprimé tampon dans un litre d’eau distillée),
-
Solution pure de Giemsa,
-
Méthanol dans un flacon compte-goutte ou du May-
Grünwald,
-
Papier filtre (papier Whatman).

Préparation de la solution de travail : les quantités à

préparer sont fonction du nombre de lames à colorer
Solution de Giemsa 10% : mélanger 1 mL (1volume) de
solution mère de Giemsa pur à 9 mL (9 volumes) d’eau
tamponnée.
Solution de Giemsa 3% : mélanger 3 ml de solution mère
de Giemsa pur à 97 ml d’eau tamponnée.
17
Mélanger délicatement avec un agitateur en verre

 Procédure de coloration des lames de GE/FM : Exemple de coloration sur support

plat
1-Fixation du frottis mince :
- Placer les lames à colorer sur deux baguettes.
- Fixer le frottis mince en plongeant la lame dans un flacon
de solution de méthanol ou dans du May Grünwald
jusqu’au ¾ de l’étalement pendant 2 à 3 secondes, afin
d’éviter que les vapeurs de méthanol ne fixent la goutte
épaisse.
NB : Ne jamais fixer la goutte épaisse.
2- Coloration des lames
- Recouvrir la lame avec la solution de Giemsa pendant 15
à 20 minutes (si c’est la solution de Giemsa à 10%) ou
pendant 45 à 50 minutes (si c’est une solution de Giemsa à
3%).
NB : il n’est pas indiqué de colorer directement une goutte
épaisse séchée pendant plus de 24 heures, une étape de
déshémoglobinisation est obligatoire.

- Laisser agir 15 minutes (Giemsa 10%) ou 45 minutes

(Giemsa 3%).
Giemsa 3% Giemsa 10 %

- Laver à l’eau neutre (ou tamponnée).

3-Séchage des lames :

- Egoutter les lames lavées, les faire sécher soit à l’air libre
soit en utilisant un sèche-cheveux (ne pas mettre trop
proche de la lame) soit sur un râtelier en les inclinant la
face avec le sang coloré tournée vers le bas pour les
protéger de la poussière.
18
NB : La coloration dans un bac peut être réalisée pour une quantité de lame relativement grande.

Figure 5: Coloration dans un bac

3.4.3. Recherche et décompte des parasites

Pour ce faire :

 Rechercher au faible grossissement la zone permettant une lecture correcte (hématies et ou

leucocytes sont bien séparés les uns des autres et non déformés) ;
 Déposer une goutte d’huile à immersion sur la zone identifiée et faire la mise au point à
l’objectif X100;
 Parcourir en créneau la lame suivant les bandes perpendiculaires au frottis mince/goutte
épaisse sans revenir en arrière (Figure 6) ;
 Rechercher la présence des différents stades évolutifs du ou des espèces plasmodiales sur
la lame : c’est la détection.

Figure 6 : Sens de lecture d’une goutte épaisse et d’un frottis mince

19
  Calcul de la densité parasitaire sur la Goutte épaisse (nombre de parasite/µl) :
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐩𝐚𝐫𝐚𝐬𝐢𝐭𝐞𝐬 𝐜𝐨𝐦𝐩𝐭é𝐬
𝐃𝐞𝐧𝐬𝐢𝐭é 𝐏𝐚𝐫𝐚𝐬𝐢𝐭𝐚𝐢𝐫𝐞 (𝐃𝐏) = × 𝟖𝟎𝟎𝟎 𝐨𝐮 (𝐍𝐁)
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐆𝐁 𝐜𝐨𝐦𝐩𝐭é𝐬
NB= numération blanche ; GB = Globules Blancs
Attention :
- On démarre le comptage des parasites et des leucocytes dès qu’on identifie un des stades
évolutifs asexués de l’espèce plasmodiale.
- Lire un champ puis faire des sauts de cinq champs avant de lire le prochain champ de sorte
à parcourir tout l’étalement de la goutte épaisse.
- En cas d’infection mixte (c’est-à-dire en présence de plusieurs espèces plasmodiales),
compter toutes les formes asexuées sans distinction d’espèces.

Compter les parasites formes asexuées sur la base d’abord de 200 globules blancs (GB).

 Conditions d’arrêt de la lecture d’une lame de Goutte épaisse

- Si on atteint au cours du décompte, un nombre de parasites supérieur ou égal à 100 après
avoir compté 200 GB, on arrête et on applique la formule de la DP ;
- Si on atteint un nombre de parasites inférieur à 100, alors on continue le décompte jusqu’à
obtenir 500 GB avant d’arrêter la lecture et calculer la DP en appliquant la même formule ;
- Si le nombre de parasites comptés est supérieur ou égal à 500 avant d’atteindre les 200 GB,
le décompte est alors arrêté et la DP calculée avec la formule ;
- Dans tous les trois cas de figures cités plus haut, inclure le dernier champ dans le décompte
avant d’arrêter la lecture et de calculer la DP.

 Calcul de la densité parasitaire (parasitémie) sur Frottis mince (FM) :

Choisir un endroit où les globules rouges (GR) sont mieux étalés et non superposés puis compter
le nombre de GR parasités (GRp) sur 40 champs.
- il est admis qu’en moyenne on aura 250 globules rouges par champ ;
- il est également admis qu’en moyenne on a 5 millions de globules rouges par µL de sang.
La DP s’exprime en nombre de parasites par µL est égale à :
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐆𝐑𝐩×𝟓 𝟎𝟎𝟎 𝟎𝟎𝟎
𝐃𝐏 (𝐏𝐚𝐫𝐚𝐬𝐢𝐭𝐞𝐬/µ𝐋 𝐝𝐞 𝐬𝐚𝐧𝐠)=
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐜𝐡𝐚𝐦𝐩×𝟐𝟓𝟎

La densité parasitaire sur FM peut également être exprimée en pourcentage d’hématies parasitées.
Pour ce faire :
20
 - Examiner 20 champs, s’il y a au moins une hématie parasitée par champ ;
- Examiner 50 champs, si on observe une hématie parasitée pour 2 à 5 champs ;
- Examiner 200 champs si on observe une hématie parasitée pour plus de 5 champs.

𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐆𝐑𝐩 × 𝟏𝟎𝟎

𝐃𝐏 (%𝐆𝐑𝐩) =
𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐜𝐡𝐚𝐦𝐩𝐬 𝐞𝐱𝐚𝐦𝐢𝐧é𝐬 × 𝐍𝐨𝐦𝐛𝐫𝐞 𝐝𝐞 𝐆𝐑 𝐩𝐚𝐫 𝐜𝐡𝐚𝐦𝐩𝐬
NB : Il est préférable d’estimer la DP sur la goutte épaisse sauf en cas de forte parasitémie ou de
perte de la goutte épaisse.

3.4.4. Identification des espèces plasmodiales

L’identification de l’espèce plasmodiale qui est une étape obligatoire du diagnostic biologique se
fait habituellement sur le frottis mince. Le parasite qui est intra-érythrocytaire possède un noyau
coloré en rouge, un cytoplasme coloré en bleu et une vacuole incolore.

Figure 7 : Hématie parasitée

L’identification se base trois éléments clés : aspect général du frottis mise, l’hématie parasitée et
le stade évolutif du parasite :
- L’aspect général du frottis : aspect, parasitisme, parasitémie ;
- l’hématie-hôte: âge, taille, forme, couleur, contenu ;
- le stade évolutif du parasite : trophozoïte, schizonte, rosace, gamétocyte.

 Aspect général du frottis mince

A cette étape on regarde :
- l’aspect du frottis : variété des stades évolutifs sur le frottis ;
- le parasitisme : présence de un ou plusieurs parasites dans l’hématie ;
- la parasitémie : abondance des parasites sur le frottis.

21
  L’aspect de l’hématie-hôte (ou de l’hématie parasitée)
En fonction de l’espèce plasmodiale en cause, la présence du parasite dans l’hématie (ou globule
rouge) peut entrainer :
- des modifications de taille, de forme, de teinte de l’hématie parasitée et
- l’apparition de taches ou de grains dans l’hématie parasitée.

Hématie restée Hématie à Hématie ovalisée Hématie contenant des

normale granulations de
volume augmenté à bord frangé Schüffner

Figure 8 : Aspect de l'hématie parasitée

 Stade évolutif du parasite

• Le trophozoïte :
- Jeune, il est caractérisé par un cytoplasme mince entourant une grosse vacuole nutritive,
et un noyau rejeté en périphérie.
- Agé, il est caractérisé par une déformation et une augmentation du volume du
cytoplasme sans division nucléaire.

Figure 9 : Les trophozoïtes (jeune et âgé)

• Le schizonte :
- Ce stade est caractérisé par la division nucléaire du parasite sans division
cytoplasmique ;
- Le cytoplasme est irrégulier et tourmenté ;
- La vacuole nutritive est difficile à individualiser.

• La rosace :
- Elle représente le stade ultime du schizonte mature. C’est une cellule parasitaire
multinucléée ;
- La vacuole nutritive a disparu ;
22
 - Les noyaux répartis en périphérie, sont en nombre variable selon l’espèce plasmodiale ;
- L’hémozoïne ou pigment malarique est concentré au centre.

Figure 10 : Les schizontes

• Le gamétocyte :

- Il est de forme arrondie, ovalaire, en croissant ou en banane suivant l’espèce

plasmodiale ;
- Le noyau est souvent mal individualisé ;
- L’hémozoïne est souvent abondante ;
- L’absence de vacuole nutritive permet de différencier le gamétocyte du trophozoïte âgé ;
- La coloration aide à distinguer les gamétocytes mâle et femelle ;

Figure 11 : Les gamétocytes

 Caractéristiques diagnostiques spécifiques à chaque espèce plasmodiale

 Plasmodium falciparum

1-Aspect général du frottis

- monotone (parasites au même stade évolutif :
trophozoïte) ;
- polyparasitisme fréquent de l’hématie ;
- parasitémie souvent intense avec image de « pluie
d’anneaux ».

2-Aspect de l’hématie parasitée :

Pas de modification de taille ni de forme

3- Stade évolutif du parasite

Le trophozoïte jeune est petit (1/4 de la taille de
l’hématie).

23
Jeune ou vieux, il est souvent accolé à la paroi de
l’hématie. Il n’y a pas de pigment malarique. Il prend
souvent l’aspect de bracelet arabe (noyau bilobé et
cytoplasme fin) ou de bague à chaton.
Le trophozoïte âgé est plus volumineux et plus
irrégulier (forme de raquette, de filet à papillon)

Le schizonte et la rosace ne sont habituellement pas

rencontrés dans le sang périphérique en dehors des
accès de neuro-paludisme à forte parasitémie.

Le gamétocyte : mature, il est caractéristique. Sa forme

en cigare ou en banane, déforme l’hématie dont on ne
distingue que difficilement la présence.

 Plasmodium malariae

1 - Aspect général du frottis :

-Parasitisme peu dense
-Avec mélange des différents stades évolutifs (bigarrure)
-Et abondance de pigment malarique

2 - Aspect de l’hématie parasitée :

-Elle est diminuée de volume sans modification de forme.
-Elle est souvent de coloration plus sombre.

3 - Stade évolutif du parasite :

- Le trophozoïte jeune : il occupe le 1/3 de l’hématie.
Le cytoplasme est plus épais que celui de P.
falciparum mais peut posséder du pigment.

24
- Le trophozoïte âgé est plus volumineux, le pigment
est très abondant.
Il peut prendre l’aspect en « bandelette équatoriale »
caractéristique de cette espèce plasmodiale.

Le schizonte et la rosace ne sont habituellement pas

rencontrés dans le sang périphérique en dehors des
accès de neuro-paludisme à forte parasitémie.

Le gamétocyte : Les macrogamétocytes de P. vivax sont

ronds à ovales et remplissent généralement la cellule
hôte. Le GR infecté est généralement sensiblement plus
grand que les GR non infectés. Le cytoplasme est
généralement d'un bleu plus foncé et contient un
pigment brun fin. Les points de Schüffner peuvent être
vus avec une coloration appropriée. Les
microgamétocytes ont généralement la taille d'un GR
non infecté et ont un cytoplasme bleu, rose ou gris plus
pâle.

 Plasmodium ovale

1 - Aspect général du frottis :

- Parasitisme peu dense
- Mélange des différents stades donnant l’aspect dit de
bigarrure
- Possibilité de polyparasitisme

2 - Aspect de l’hématie parasitée :

- Elle est modérément augmentée de taille
- Elle est ovalisée et déshémoglobinisée avec une
extrémité frangée, dès le stade mature ;
- Il existe des granulations dites de James dès le stade
de trophozoïte.

25
3 - Stade évolutif du parasite :
- Le trophozoïte jeune occupe le 1/3 de l’hématie. Le
cytoplasme est plus épais que celui de P. falciparum
mais possède parfois un fin grain de pigment. Le
noyau semble basculé dans le cytoplasme.

Le trophozoïte âgé possède du pigment.

- Le parasite grossit et se déforme. A ce stade le
cytoplasme peut posséder une partie filamenteuse
mais il ne forme jamais de corps amoeboïde.

Le schizonte ne se différencie du trophozoïte âgé que

par la division du noyau

La rosace comporte 8 mérozoïtes (ou plus) répartis +/-

régulièrement. Le pigment est dense mais plus fin que
chez P. malariae

Le gamétocyte est arrondi ou ovalaire et n’occupe pas

la totalité de l’hématie parasitée.
Le noyau est excentré et le pigment abondant.

 Plasmodium vivax

1 - Aspect général du frottis :

- Parasitisme peu dense
- Mélange des stades évolutifs donnant l’aspect dit de
bigarrure
-Polyparasitisme de l’hématie parasitée est exceptionnel

2 - Aspect de l’hématie parasitée :

- Hématie parasitée est augmentée de volume, apparaît
pâle (déshémoglobinisée), parfois déformée ;
- Au stade de trophozoïte âgé et de schizonte, présence
de granulations dites de Schüffner (semis de
granulations rondes, de petite taille, colorées en brun-
rouge).

26
 3 - Stade évolutif du parasite :
- Le trophozoïte jeune occupe le 1/3 de l’hématie. Le
cytoplasme est plus épais que celui de P. falciparum
Pas de pigment malarique.

- Le trophozoïte âgé est caractéristique (corps

amiboïde). Le cytoplasme est déformé, très
polymorphe, épais ou étiré en tous sens. La vacuole
nutritive est mal délimitée.

- Le schizonte comporte des noyaux irréguliers en taille

et en répartition dans une masse cytoplasmique.

- La rosace est volumineuse, occupe toute l’hématie et

comporte 12 à 18 noyaux (mérozoïtes) irrégulièrement
répartis. Le pigment est rassemblé au centre.

- Le gamétocyte est arrondi ou ovalaire et occupe la

presque totalité de l’hématie parasitée.
- Le noyau est excentré et le pigment abondant.

 Plasmodium knowlesi (espèce présente en Asie du Sud Est)

1-Aspect général du frottis :

Mélange de trophozoïtes jeunes et âgés.

27
2-Aspect de l’hématie parasitée :
- Taille normale ou diminuée.

3-stade évolutif du parasite:

- Le trophozoïte jeune : ressemble à celui de P.
falciparum.

- Le trophozoïte âgé souvent en bande équatoriale

pouvant être confondu avec celui de P. Malariae avec
abondance du pigment malarique.

- Le schizonte : ressemble à celui de P. malariae.

- La rosace : peut comporter jusqu’à 16 noyaux

- Le gamétocyte : rond compact rempli entièrement

l’érythrocyte. Le pigment malarique est dispersé ou en
grappe. Les formes jeunes sont très similaires aux
trophozoïtes matures.

28
Diagnostic biologique du
paludisme par d’autres
techniques
4. Diagnostic biologique du paludisme par d’autres
techniques

4.1. Diagnostic biologique du paludisme par des méthodes basées sur la

biologie moléculaire
4.1.1. Principe
C’est une méthode diagnostique basée sur l’amplification de l’ADN plasmodiale par réaction
enzymatique. Elle consiste à détecter des séquences nucléotidiques spécifiques des parasites du
genre Plasmodium grâce à différentes techniques d’amplification du matériel génétique
parasitaire.

4.1.2. Indications
La biologie moléculaire permet de poser le diagnostic de certitude de toutes espèces plasmodiales
car plus sensible et plus spécifique. Cependant, elle nécessite une expertise et des équipements
spécifiques.
Elle permet également le diagnostic des parasitémies submicroscopiques (<0,01 parasites/µL de
sang). Elle est très adaptée aux zones de pré élimination où les parasitémies deviennent très faibles
ou rares.
Elle est utilisée pour différencier les réinfestations des recrudescences et pour la recherche des
gènes de résistances aux médicaments antipaludiques.

4.1.3. Les techniques disponibles

Les différentes techniques moléculaires utilisées pour le diagnostic du paludisme sont :

• La PCR conventionnelle qui permet de dupliquer en grand nombre une séquence d’ADN ou
d’ARN connue à partir d’une faible quantité d’acide nucléique (AN) à l’aide d’amorces spécifiques
constitués d’oligonucléotides de synthèse.

• La PCR nichée (Nested PCR) est une PCR en deux étapes successives, avec deux couples
d’amorces différents, le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. Cette
technique était initialement utilisée pour réduire le risque de contamination (le produit final devait
pouvoir interagir avec deux couples d’amorces, donc deux niveaux de spécificité). Le premier
couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les quelques parties stables du génome
parasitaire, le deuxième pour identifier le sous-type. Elle permet aussi une meilleure sensibilité du
résultat.

30
• La PCR-RFLP conduit à comparer la longueur des fragments de restriction d’une région choisie
du génome et préalablement amplifiée par PCR, afin de déterminer le polymorphisme. Cette région
est utilisée comme substrat pour les enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des
endonucléases qui reconnaissent spécifiquement une séquence courte (4 à 8 bases) et coupent la
chaîne d’ADN chaque fois qu’elles reconnaissent cette séquence élémentaire. L’ADN se retrouve
ainsi fragmenté en morceaux de différentes longueurs séparés en fonction de leur taille par
électrophorèse sur un support physique ;

• La PCR quantitative (qPCR) et/ou Real Time PCR (RT-PCR) est une PCR quantitative qui
a révolutionné l’utilisation de la PCR. Elle consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à
chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire
des mesures quantitatives (expliquant l’appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite
des thermocycleurs particuliers. Elle n’est pas à confondre avec la Reverse Transcription PCR. On
préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR.

• La technique LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) est utilisée pour la détection
de l’ADN parasitaire. C’est une des méthodes qualifiées de PCR isotherme car partageant avec la
PCR l’amplification spécifique d’un ou plusieurs marqueurs moléculaires (ADN/ARN) par une
ADN/ARN polymérase. Elle présente des niveaux d’amplification qui approchent ceux de la PCR
classique avec un très haut niveau de spécificité dû à l’utilisation de 6 amorces. Cette méthode
d’amplification est en générale très rapide et se fait à une température constante comprise entre
60-65°C. Elle présente plusieurs déclinaisons dont la LAMP classique, la LAMP en temps réel, la
RT-LAMP, ou la RT-LAMP en temps réel ou encore la NINA-LAMP qui existe en « point of care
» et est facile d’utilisation sur le terrain [8].

4.2. Techniques autres que la biologie moléculaire

Le CELLSCHEK est un automate capable de détecter et d’identifier les espèces plasmodiales
dans le sang humain par la goutte épaisse. Basée sur une technologie de traitement numérique
combinée à une technique de préparation d’échantillon, il permet l’identification du paludisme de
manière fiable, rapide, peu coûteuse et complètement automatisée.

Le sérodiagnostic du paludisme est basé sur la détections dans le sérum des anticorps spécifiques
anti-plasmodium (sous-classes IgG: IgG1, IgG2, IgG4…). Il n’a pas d’intérêt diagnostique chez
les sujets autochtones en zone endémique.

31
 Quelques aspects du
contrôle qualité appliqués
au diagnostic biologique du
paludisme
5. Quelques aspects du contrôle qualité appliqués au
diagnostic biologique du paludisme
5.1.Contrôle de qualité du diagnostic par microscopie
Dans le cadre du présent guide de diagnostic biologique du paludisme, seuls seront explorés les
Contrôle Qualité Interne (CQI) et à l’Evaluation Externe de la Qualité (EEQ).

5.1.1. Définition
Le contrôle qualité est une procédure ou une série de procédures visant à s'assurer qu'un produit
ou un service satisfait un ensemble défini de critères de qualité ou répond aux exigences du client.
Il a pour intérêt :
- d’assurer la fiabilité des résultats et la crédibilité du laboratoire ;
- de fournir aux prestataires des résultats de qualité ;
- d’avoir une bonne prise en charge des patients ;
- de prévenir, détecter les erreurs et non conformités et de mettre en place immédiatement
des mesures correctives.
Il s’effectue en deux étapes : le contrôle qualité interne et le contrôle qualité externe. Il implique
le responsable du laboratoire, les techniciens, le PNLP et ses partenaires techniques.

5.1.2. Contrôle interne qualité

5.1.2.1.Procédures de Contrôle Qualité Interne (CQI) des lames de GE et FM
 Périodicité

L’idéal est le contrôle journalier ou au moins hebdomadaire.

 Méthodologie

Elle reposera sur :

- l’évaluation de la qualité des réactifs (Giemsa, méthanol…) ;
- l’évaluation de la qualité des étalements ;
- l’enregistrement de tous les items dans le registre du laboratoire ;
- l’évaluation du respect des procédures standards du prélèvement jusqu’au rendu des
résultats (disposer de procédures écrites pour toutes les activités : prélèvement, Contrôle
Qualité Interne, Evaluation Externe de la Qualité, Gestion des déchets …) ;
- la tenue du cahier de maintenance pour notifier les dates de réception du matériel et les
périodes d’entretien ou de réparation des appareils ;
 - la mention de la date d’ouverture et de péremption des réactifs ;
- l’élimination des déchets du laboratoire.

 Mise en œuvre

Le CQI des lames se fait par la technique de la double lecture.

Prélever au hasard 10 % des lames qui ont été lues par un premier technicien et faire relire par un
second technicien de laboratoire :
• Pour les lames positives :
- Si les DP entre les deux lectures se trouvent dans l’intervalle de +25 % et -25 %, les
résultats peuvent être validés.
- Si un écart de plus de 25 % sur la DP est obtenu entre les deux lecteurs, faire appel à un
troisième technicien (microscopiste régional de référence) pour un contrôle.
- En cas de non satisfaction, faire appel au Laboratoire National de Référence (LNR) pour
un contrôle qualité externe.
• Pour les lames négatives :
- Si le deuxième technicien trouve un résultat négatif, la lame est déclarée négative ;
- Si le deuxième technicien trouve un résultat positif, faire voir le ou les parasites par le
premier technicien. En cas d’accord, le résultat est validé positif. En cas de désaccord,
solliciter l’expertise du microscopiste régional de référence.
• Cas où le technicien est seul dans son laboratoire :
Le contrôle de qualité se fera sous forme d’autocontrôle en l’absence de toute pression de rendu
résultat. Les résultats de la deuxième lecture sont consignés dans le cahier du CQI.
Devant des discordances récurrentes, une formation de mise à niveau de toute l’équipe sur la
méthode de lecture de la GE/FM est fortement recommandée.

5.1.2.2.Procédure du Contrôle Qualité interne de la coloration

- Confectionner plusieurs lames de contrôle positif à partir d’un sang positif (recueilli
sur EDTA si possible) et conserver,

- Colorer ensemble une de ces lames avec les lames des patients et apprécier la qualité de
la coloration des éléments figurés.

o si la qualité de la coloration de la lame de contrôle est bonne, valider la qualité du

colorant et donc celle des lames des patients ;

o sinon revoir la dilution du colorant ou le temps de coloration ou filtrer le colorant

selon l’anomalie constatée.

34
 - S’assurer de la qualité de la fixation :

o refermer le flacon du méthanol après fixation des frottis ;

o renouveler périodiquement (au besoin) la quantité du méthanol utilisé

quotidiennement.

5.1.3. Contrôle de qualité externe

5.1.3.1.Contrôle qualité interne externalisé
Le CQI externalisé se réfère à un système de contrôle des résultats d’un laboratoire par le
Laboratoire national de référence (LNR) du PNLP.

Une collecte de 15 lames (10 lames positives et 5 lames négatives) de GE/FM par laboratoire sera
organisée trimestriellement par des superviseurs régionaux pour un contrôle par le LNR du PNLP.

Ce contrôle sera renforcé par les supervisions formatives prenant en compte les aspects suivants :
entretien de microscope, préparation de colorant et remplissage des supports des collectes.

5.1.3.2.Evaluation externe de la qualité

L’EEQ va consister à recevoir des lames d’un organisme accrédité et les mettre à la disposition
des laboratoires pour l’évaluation des techniciens. Cette évaluation concernera la détection des
parasites, l’estimation de la densité parasitaire et l’identification des espèces plasmodiales.

5.2. Contrôle de qualité du diagnostic par les TDRs

On a 3 niveaux de contrôle de qualité : à la réception des lots, après distribution et in situ

5.2.1. A la réception des lots

Un échantillon de TDR est prélevé dans chaque lot et acheminé au laboratoire de Parasitologie
certifié par OMS / FIND. Le contrôle de qualité de chaque boîte porte sur :

• La qualité et l’état de l’emballage ;

• La qualité et l’état de chaque élément ;
• présence d’une notice explicative ;
• présence du nombre de tests déclaré par le fabricant ;
• présence de lancettes stériles ;
• présence de tampon de désinfectant ;
• présence de flacon de tampon ;
• La sensibilité du TDR à une parasitémie faible de 200 parasites /µl de sang ;
• La sensibilité du TDR à une parasitémie élevée de 2000 parasites /µl de sang ;
• La sensibilité du TDR à un échantillon de sang négatif ne contenant aucun parasite.

35
Des échantillons de sang positif validés (par microscopie et qPCR) et certifiés par OMS sont
utilisés pour le contrôle qualité. Ces échantillons sont collectés au Togo suivant le protocole
OMS/TDR/FIND pour le contrôle de la qualité des TDR. Des dilutions à 200 parasites/µl et 2000
parasites/µl de sang sont réalisées.

Les résultats du contrôle de qualité sont classés en deux catégories :

• PASS : lorsque le lot réussi le contrôle de qualité et que les TDR ont détecté toutes les
parasitémies permettant ainsi leur utilisation sur le terrain

• ECHEC : lorsque le lot n’a pas réussi le contrôle de qualité. Il devra être envoyé à un autre
laboratoire de contrôle pour confirmation. Ce lot ne pourra être utilisé sur le terrain avant le
deuxième contrôle de qualité.

5.2.2. Après la distribution

Un échantillon de TDR non utilisé est prélevé au niveau des points de prestation après 6 mois et
12 mois de stockage. Ces échantillons sont acheminés au laboratoire de Parasitologie certifié par
OMS / FIND pour un contrôle sur chaque boîte.

5.2.3. In situ
Il s’agira de mettre dans chaque boîte un contrôle positif et un contrôle négatif permettant à
l’utilisateur de réaliser le contrôle de qualité avant l’utilisation.

36
Conclusion
Conclusion
Ce guide national de diagnostic biologique du paludisme est un outil pratique mis à la disposition
des professionnels de la biologie médicale. Il contient des procédures opératoires standardisées
dont l’application rigoureuse doit contribuer à l’atteinte des objectifs de lutte contre le paludisme
au Togo. Il permettra de faire un diagnostic de qualité et par conséquent une prise en charge
adéquate avec une utilisation rationnelle des ressources. Au test de diagnostic rapide et à la
microscopie devrait s’ajouter dans un proche avenir des techniques d’amplification génique de
sensibilité supérieure dont la description a été sommairement abordée dans le présent guide. Les
professionnels de la biologie médicale doivent s’approprier cet outil afin de rendre en tout temps
et en tout lieu des résultats conformes de qualité.

38
Remerciements

L’équipe de rédaction exprime ses remerciements :

• aux autorités du Ministère de la Santé, de l’Hygiène Publique et de l’Accès Universel aux

Soins du Togo,

• à la coordination du Programme National de lutte contre le Paludisme du Togo,

• aux partenaires techniques et financiers pour leurs appuis à la mise en œuvre des
stratégies de lutte contre le paludisme dans le pays,

• à tous ceux qui ont œuvré pour l’élaboration de ce guide et à ceux qui travaillent à leur
échelle respective pour que le paludisme ne constitue plus un problème de santé au Togo.

39
Références
1. OMS: Rapport sur le paludisme dans le monde 2019. Organisation mondiale de la santé
2019:232. https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2019/report/fr/.
2. PNLP: Rapport annuel. Programme national de lutte contre le paludisme 2019.
3. SCAPE: Stratégie de croissance accélérée et de promotion de l'emploi 2013-2017. 2013.
http://www.oit.org/dyn/natlex/natlex4.detail?p_lang=fr&p_isn=95034.
4. PSN: Plan stratégique national de lutte contre le paludisme au Togo. 2017 -2023.
5. Global Health DoPDaM: Malaria. 2020. https://www.who.int/teams/global-malaria-
programme/reports/world-malaria-report-2020.
6. World Health O: Severe falciparum malaria. Transactions of the Royal Society of Tropical
Medicine and Hygiene 2000, 94:1-90.
7. OMS: Diagnostic du paludisme. Organisation mondiale de la santé.
https://www.who.int/malaria/areas/diagnosis/fr/.
8. Mohon AN, Lee LD-Y, Bayih AG, Folefoc A, Guelig D, Burton RA, LaBarre P, Chan W, Meatherall B,
Pillai DR: NINA-LAMP compared to microscopy, RDT, and nested PCR for the detection of
imported malaria. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2016, 85(2):149-153.

40
ANNEXES
ANNEXES
Annexe 1 : Nettoyage et préparation des lames

Lames neuves et propres sans moisissures et entre-collées

• Les tremper 30 minutes à 1 heure dans l’alcool dénaturé (éthanol 95° plus l’éther à volume
égal) ;
• les essuyer avec une compresse ;
• une fois propre, les lames doivent être tenues par les bords seulement.
Lames neuves avec moisissures
• Les faire bouillir durant 30 minutes à 1 heure dans l’eau contenant un détergent (par exemple :
savon liquide) et les laisser tremper dans cette eau pendant 24 heures ;
• les nettoyer une à une avec une compresse ;
• les placer dans un mélange à volume égal d’alcool 90° et d’éther ;
• les essuyer avec une compresse ;
• une fois propres, les lames doivent être tenues par les bords seulement.
Emballage et conservation des lames
• Les emballer après séchage par lots de 10 dans du papier, exemple: papier d’emballage;
• garder chaque lot fermé à l’aide d’un élastique ou de scotch ou sparadrap ;
• garder les lots fermés au sec dans leurs boîtes d’origine; les utiliser dans les 2 mois qui suivent.
Au-delà des 2 mois de conservation elles sont toujours réutilisables avec le même processus de
nettoyage.

NB : Les mentions lavées ou pré-nettoyées inscrites sur les boîtes ne signifient pas que l’on peut
directement utiliser les lames concernées en les sortants de la boîte. Il faut toujours nettoyer,
sécher et emballer ces lames avant de les utiliser pour les étalements de sang.

ii
Annexe 2 : Entretien du microscope
Le microscope est un instrument de haute précision. La propreté de l’environnement du
microscope et le soin apporté à son installation et à son utilisation sont primordiaux pour assurer
sa longévité. L’humidité, la poussière, une alimentation électrique instable, un usage inadapté ou
une installation électrique défectueuse sont des facteurs qui nuisent au contraire à cette longévité.
L’entretien d’un microscope exige du soin, de la patience et de l’attention. Il ne doit être réalisé
que par un personnel qualifié disposant d’outils spécialisés. On trouvera ci-après des
recommandations générales qui devront être appliquées pour installer correctement le microscope
et le maintenir en bon état de fonctionnement.

Figure 12 : Microscope optique

 Entretien courant du microscope

1. Stockage du microscope
Les optiques et les mécanismes du microscope doivent être protégés de la poussière, la saleté et
des moisissures.
Il est recommandé de stocker le microscope sous une housse protectrice à l’abri de l’humidité.
2. Solutions de nettoyage et solvants
 Solution savonneuse pour nettoyer le corps et le socle ;
 Un mélange de 30% d’alcool 90° et de 70% d’éther pour le nettoyage des optiques ;
 Se référer au guide du fabricant pour un solvant organique approprié.

iii
 3. Solutions de nettoyage

Solutions de nettoyage Usage fréquent Usage non fréquent

Alcool 90° / Ether (30/70) Oui Oui
Alcool Non Oui
Benzène / pétrole Non Oui
Xylol Non Non

4. Matériel de nettoyage
 Compresse de gaze
 Écouvillon en coton
 Papier spécial pour lentilles
- Alternatives :
• Papier fin de qualité
• Mousseline (tissu lâche en coton utilisé par les couturières)
• Soie

5. Processus de nettoyage du microscope

1. Oculaire
2. Objectifs
3. Plateau du microscope
4. Corps du microscope
5. Condenseur

iv
Étape 1: Nettoyage des oculaires
 Chasser la poussière avant d’essuyer les lentilles
 Nettoyer les oculaires avec un écouvillon en coton imbibé de solution de nettoyage pour
lentilles
 Nettoyer avec un mouvement circulaire de l’intérieur vers l’extérieur

Étape 2: Nettoyer les oculaires

 Essuyer les oculaires, sécher avec un papier spécifique pour lentilles ou papier toilette
doux ;
 Répéter le nettoyage et le séchage si besoin.

Étape 3: Nettoyage des objectifs

Les objectifs sont nettoyés restant toujours attachés au microscope. Les objectifs ne devraient
jamais être démontés.
- Imprégner le papier avec la solution de nettoyage ;
- Essuyer doucement en faisant des mouvements circulaires de l’intérieur vers
l’extérieur ;
- Essuyer avec un tissu sec ou un papier spécifique pour lentilles.

v
Étape 4: Nettoyage du plateau
 Essuyer le plateau en utilisant une solution nettoyante sur un tissu doux ;
 Sécher entièrement le plateau ;
 Répéter les étapes ci-dessus, si besoin.

Étape 6: Nettoyage du condenseur et lentilles auxiliaires

 Débrancher le microscope ;
 Nettoyer la lentille du condenseur et les lentilles auxiliaires avec un écouvillon en coton
imprégné de solution nettoyante ;
 Essuyer avec un écouvillon sec.

6. Remplacement de l’ampoule du microscope

 Débrancher le microscope ;
 Trouver l’emplacement de l’ampoule ;
 Suivre les instructions du fabricant pour enlever l’ampoule ;
 Utiliser un mouchoir ou tout autre objet pour enlever l’ampoule ;
 Vérifier le numéro du modèle sur l’ampoule pour s’assurer de la remplacer correctement ;
vi
  Remplacer l’ampoule en la tenant avec du papier optique ou tout autre matériel
approprié.

NB : Ne jamais toucher l’ampoule avec vos doigts.

7. Réparation du Microscope
 Ne jamais désassembler le microscope
- Optiques: oculaires et objectifs
- Mécaniques: plateau et bouton d’ajustement
 La réparation de ces éléments requiert l’appel à un technicien en maintenance
biomédicale.
8. Résolutions de problèmes
 Beaucoup des problèmes courants peuvent être prévenus par un nettoyage routinier,
l’ajustement et la maintenance ;
 Chercher les services d’un professionnel quand le problème ne peut pas être résolu.
8.1. Problème: oculaires et maux de tête
 Ajuster la distance inter-pupillaire ;
 Ajuster le réglage de dioptries de l’oculaire ;
 Utiliser les mêmes oculaires.
8.2.Problème: Image de mauvaise qualité
 Nettoyer l’objectif et les lentilles ;
 Nettoyer le microscope à fond ;
 Vérifier l’huile, la remplacer si contaminée ou douteuse ;
 S’assurer que la lame est entièrement sèche avant d’appliquer l’huile.
8.3.Problème: éclairage inégal
 S’assurer que le porte-objectif est sur la position où il « clique » quand il est en place ;

vii
  Centrer le condenseur ;
 Pratiquer un réglage de Köhler ;
 Vérifier le modèle de l’ampoule.
8.4.Problème: Réajustement Constant
 Être certain que la lame est plate sur le plateau ;
 Nettoyer le plateau et le dessous de la lame ;
 Être certain que le microscope est sur une surface plane.
8.5.Problème: Lumière houleuse ou tremblotante
 Mauvaise connexion ;
 Nettoyer les contacts de la lampe (débrancher !) ;
 S’assurer que les contacts halogènes font bien contact ;
 L’ampoule a besoin d’être remplacée ;
 Regarder si le cordon d’alimentation est abîmé, le remplacer si une lésion est visible ;
 Si le courant est instable, utiliser un stabilisateur.
9. Maintenance du Microscope
 Maintenance quotidienne
- Éclairage optimum,
- Propreté,
- Ampoule,
- Huile à immersion,
- Vérifier le cordon,
- Le couvrir.
 Service Professionnel
- Minimum une fois par an ou plus si possible ;
- Problèmes qui ne peuvent être résolus par le personnel du laboratoire.
 Maintenir un registre pour
- Les problèmes,
- La maintenance de routine,
- Les réparations,
- Les pièces détachées.
 Dépannage du microscope
Pour les pannes mineures, le technicien peut recourir au guide de dépannage indiqué dans le
tableau I. Cependant en cas de panne majeure faire appel à un personnel qualifié.

viii
Tableau I : Guide de dépannage

ix
x
 Annexe 3 : Fiche de synthèse mensuelle des activités de diagnostic biologique (GE/FM) du paludisme au niveau des Formations Sanitaires
avec laboratoire

Fiche de rapport mensuel des activités de GE/FM du laboratoire

Année ………………………….. Mois …………………………………………

Région…………………….. District……………………………...Nom du Laboratoire / Formation Sanitaire……………………………………..
Nombre de personnel: Médecin biologiste /___/;ITB/TSL /___/; TL /___/; AL/___/

Enfants moins de 5 ans 5 ans & + sans FE Femmes enceintes

Total GE/FM Total GE/FM
Activités Total Total Total (Interne et en interne
(Interne et Total interne (Interne et Total interne (Interne et Total interne externe)
externe) externe) externe)
GE/FM effectuées
GE/FM positifs à Plasmodium falciparum
GE/FM positifs à Plasmodium malariae
GE/FM positifs à Plasmodium ovale
GE/FM positifs à Plasmodium vivax
GE/FM positifs à Plasmodium knowlesi
GE/FM positifs à autre Plasmodium
Nombre total de lames contrôlées sur place
District Région National
Nombre total de lames envoyées aux laboratoires de référence pour le contrôle de qualité

Interne et externe = nombre de GE demandée par les prescripteurs de la FS abritant le laboratoire (Interne) + nombre de GE demandées à l’extérieur de
la FS (Externe).
Total interne = nombre de GE demandées par les prescripteurs de la FS abritant le laboratoire.
Nom et Signature du Responsable

xi
Annexe 4 : Fiche de synthèse mensuelle des activités de diagnostic biologiques (TDR et GE/FM) du paludisme au niveau du District sanitaire

Fiche de rapport mensuel des activités de diagnostic biologique du paludisme (TDR + GE/FM) au niveau du District sanitaire

Année ………… Mois …………………….

Région Sanitaire ……………………….. District Sanitaire ………………………..…………
Nombre de FS sans laboratoire :/____/ Nombre de FS sans laboratoire ayant notifié /____/
Nombre de FS avec laboratoire :/____/ Nombre des FS avec laboratoire ayant notifié /____/
Nom et prénoms du Responsable du District ………………………………………………

Enfants moins de 5 ans 5 ans & + sans FE Femmes enceintes Total

Activités Total Total Total (Interne et Total GE/FM

(Interne et Total interne (Interne et Total interne (Interne et Total interne externe) en interne
externe) externe) externe)
Nombre de TDR réalisés par les Formations
Sanitaires du District
Nombre de TDR positifs au niveau des FS du
District

Nombre de TDR réalisés par les ASC du

District
Nombre de TDR positifs réalisés par les ASC
du District

xii
Nombre de GE effectuée dans le District

Nombre de GE positive

Nombre de GE positive à Plasmodium

falciparum
Nombre de GE positive à Plasmodium
malariae
Nombre de GE positive à Plasmodium ovale

Nombre de GE positive à Plasmodium vivax

Nombre total de tests réalisés dans le District

(GE/FM + TDR)
Nombre total de tests Positifs réalisés dans le
District (GE/FM + TDR)

Date : …………………………….. Nom et Signature du Responsable

xiii