Rapport de stage

Bactériologie médicale, Parasitologie et

Mycologie

Filière : Techniques de santé Option : Laboratoire

Présenté par :
Anouar Lachal & Khadija Bouchkima

Soutenu le 08 septembre 2020

Devant le jury composé de :

Remerciement

En premier lieu et avant tout, nous tenons à remercie le bon

Dieu, qui nous à donner la santé et la volonté d'entamer et de
terminer ce stage, et la force pour l’accomplir.

Nous tenons à remercier tout le personnel du Laboratoire de

Bactériologie et de Parasitologie.

C’est avec un grand plaisir que nous réservons ces lignes en

signe de gratitude et de reconnaissance à tous ceux qui ont
contribué de près ou de loin pour la réalisation de ce stage.

2
Sommaire
Remerciement ..................................................................................................................... 2

Sommaire............................................................................................................................. 3

Introduction ........................................................................................................................ 5

I. Centre Hospitalier Régional AL-FARABI ........................................................... 6

1. Parasitologie...................................................................................................... 6

a. Paludisme ....................................................................................................... 6

b. Leishmaniose cutanée ..................................................................................... 9

II. Centre Hospitalier Universitaire Med VI : ........................................................ 12

1. Bactériologie .......................................................................................................... 12

Phase pré analytique ....................................................................................................... 12

Phase analytique ............................................................................................................. 12

Réalisation d’un frottis ........................................................................................... 12

Coloration de Gram ................................................................................................ 12

Test au Catalase ...................................................................................................... 13

Examen cytobactériologique des urines ................................................................. 14

Hémoculture ........................................................................................................... 14

Examen bactériologique d’un LCR ........................................................................ 15

Examen bactériologique des cathéters ou d'un dispositif intravasculaire .............. 16

Antibiogramme ....................................................................................................... 16

Concentration minimale inhibitrice ........................................................................ 18

III. Centre de Diagnostique de la Tuberculose et des Maladies Respiratoires à

Oujda 18

1. Aménagement du laboratoire ....................................................................... 18

2. Mesures de sécurité au laboratoire ............................................................... 18

3. Recueille des prélèvements .......................................................................... 19

4. Diagnostique de la tuberculose ..................................................................... 20

Conclusion ......................................................................................................................... 29

3
ANNEXES ......................................................................................................................... 30

Bibliographie ..................................................................................................................... 32

4
Introduction
Dans le cadre de la préparation de la licence en Techniques du Laboratoire et au
sein de l’Institut Nationale des Professions Infermières et Techniques de Santé, l’institut a
offert un stage académique du 17/02/2020 jusqu’à 30/04/2020 au sein des Laboratoires de
Microbiologie d’Oujda.
Notre thème concerne « Bactériologie médicale, Parasitologie et Mycologie ».
C’est pourquoi l’objectif de notre stage est focalisé sur le savoir-faire des analyses
microbiologiques.

Missions et objectifs
 Vérifier la conformité des échantillons
 Enregistrer les résultats
 Effectuer les examens macroscopiques
 Effectuer les examens microscopiques de différents prélèvements.
- Coloration de Gram
- Coloration de Ziehl-Neelsen
- Cytologie
 Réaliser les diagnostics bactériologiques et sérologiques suivants :
- E.C.B.U
- Examen cytobactériologique des L.C.R
- Examen bactériologique des crachats
- Examen bactériologique des prélèvements de gorge
- Examen cytobactériologique d’un pus
- F.C.B des infections – Urogénitales
- Hémoculture
 Pratiquer un antibiogramme.
 Confectionner et colorer les gouttes épaisses et les frottis sanguins par la méthode
May-Grunwald Giemsa
 Rechercher et identifier les parasites sanguicoles à partir de frottis et Gouttes
Épaisses colorés
 Pratiquer les techniques d’examens de selles suivantes :
- Examen Macroscopique
- Examen direct à l’eau physiologique
- Examen au lugol
5
 I. Centre Hospitalier Régional AL-FARABI
1. Parasitologie
Le laboratoire régional des maladies parasitaires est un laboratoire de diagnostic, situé à la
ville d’Oujda.
Il est composé de deux salles :
 Une salle multifonctionnelle dédiée au prélèvement, à la lecture des lames,
à l’enregistrement (des prélèvements et des résultats), ainsi qu’à la remise
des résultats.
 L’autre salle est réservée pour la coloration des lames.
a. Paludisme
Le paludisme est la parasitose qui occupe la première place des maladies infectieuses sur
le plan mondial. Cette infection est causée par un protozoaire hématophage du genre
Plasmodium. Il existe 4 espèces de Plasmodium parasitant spécifiquement l’homme (P.
falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale) qui sont transmis par piqûre nocturne d’un
moustique femelle du genre Anophèle infesté.
Le falciparum demeure l’espèce la plus répandue et la plus dangereuse. Elle est
responsable des complications mortelles.
En 1897, la découverte du rôle d’un moustique de genre Anophèles comme agent de
transmission du paludisme est faite par Ronald Ross, médecin anglais vivant en Inde.

Figure 1 falciparum (Trophozoite) Figure 2 Vivax (Schizonte)

6
Figure 3 Ovale (Schizonte) Figure 4 malariae (Schizonte)

Cycle évolutif :

Homme (HD)
Schizogonie intra-hépatique Schizogonie intra-erythrocytaire

Mérozoite Trophozoite

Schizonte hépatique Schizonte

Eclatement

Schizonte
Gamétocytes

Anophèle (HI)

Nature et condition de prélèvement

Le prélèvement se fait par ponction veineuse sur anticoagulant (tube à EDTA) et
également par piqûre au vaccinostyle au bout du doigt lors des frissons.

Frottis mince :
Le frottis mince (1-1,5μL de sang étalé sur 250-600 mm2) est la méthode de référence pour
l’étude morphologique des hématozoaires et pour le diagnostic différentiel entre les
espèces plasmodiales. Il est coloré selon la méthode de May-Grünewald-Giemsa (MGG)
après fixation à l’alcool.
7
 Coloration :
1. Fixation par le méthanol pur pendant 2 à 3min dans une chambre à réunions.
2. Ajout de la solution de Giemsa de 3% pendant 45min dans une autre chambre à
réunions.
3. Séchage puis lecture sur microscope (objectif x100).
Examen microscopique
Critères d’identification au microscope :

Détection d’antigène par test rapide (TDR)

Il s’agit des kits de détections prêtes à l’emploi qui permettent en quelques minutes et sans
matériel particulier de mettre en évidence la présence du plasmodium.
La détection d’antigènes parasitaires se fait par immunocapture à l’aide des bandelettes
réactives sensibilisées par des anticorps monoclonaux spécifiques.
En pratique, une goutte de sang veineux est déposée sur la bandelette. Après un délai de
révélation, des bandes de précipitation apparaissent signant la présence de P. falciparum
ou P. vivax.
Cet outil d’utilisation et d’interprétation simple ne doit jamais être utilisé isolément
.

8
Figure 5 Test de détection rapide du Plasmodium
 b. Leishmaniose cutanée

Figure 6. Répartition géographique de la leishmaniose cutanée au Maroc

C’est la forme le plus fréquente de la leishmaniose, elle provoque des lésions cutanées,
principalement des ulcérations des parties exposées de la peau.
Au Maroc, la leishmaniose est provoquée par 3 espèces : L. major, L. tropica et L.
infantum qui cause la leishmaniose viscérale.
Les symptômes de la leishmaniose cutanée se manifestent de la façon suivante :
1. Incubation de 1 à 4 mois entre la piqûre infectante et l’apparition des premiers
symptômes.
2. Un bouton dur apparaît au niveau du site de l’inoculation des leishmanies localisée
généralement sur les zones découvertes du corps.
3. Ce nodule devient ulcéreux et se recouvre d'une croûte et n'est jamais douloureux.
Les lésions sont uniques ou peu nombreuses. Elles guérissent souvent de façon
spontanée en 6 mois à 1 an en laissant une cicatrice indélébile.

9
 Cycle évolutif :

Figure 7. Image du Centers for Disease Control and Prevention Image Library.

10
1. La leishmaniose est transmise par la piqûre de phlébotomes femelles infectés. Au cours
d'un repas de sang, les phlébotomes injectent des promastigotes métacycliques (le stade
infectieux) par leur trompe.
2. Les promastigotes sont phagocytés par les macrophages et d'autres cellules
phagocytaires mononuclées.
3. Dans ces cellules, les promastigotes se transforment en amastigotes (stade tissulaire).
4. Les amastigotes se multiplient par simple division et infectent d'autres cellules
phagocytaires mononuclées.
5–6. Au cours d'un repas de sang sur un hôte infecté, les phlébotomes s'infectent en
ingérant des macrophages contaminés par des amastigotes.
7. Dans l'intestin moyen des phlébotomes, les amastigotes se transforment en
promastigotes.
8. Là, ils se multiplient, se développent et migrent vers la trompe.

Nature et condition de prélèvement

Prélèvement du suc dermique à partir de la lésion, étalé sur une lame.

Coloration :
1. Fixation par le méthanol pur pendant 5 min dans une chambre à réunions.
2. Ajout de la solution de Giemsa de 7% pendant 45min dans une autre
chambre à réunions.
3. Séchage puis lecture sur microscope (objectif x100).

Examen microscopique

Figure 8. macrophages parasités par des amastigotes de leishmanie (multiplication)

11
 II. Centre Hospitalier Universitaire Med VI :
1. Bactériologie
Le laboratoire de Bactériologie médicale au niveau de CHU Oujda est constitué de 3
salles ; Une dédiée à la phase pré analytique et à la coloration Gram, une deuxième pour la
phase analytique qui contient 2 paillasses de microbiologie destinée à la culture,
antibiogramme, réalisation des frottis et la cytologie. Une dernière salle pour la
préparation des milieux de culture et le stockage du matériel.
Notant que les procédures du diagnostic bactériologiques sont standardisées, cette partie
concerne également le laboratoire prive Aarab et la polyclinique du CNSS Oujda.

Phase pré analytique

Durant cette phase, le personnel du laboratoire est appelé à respecter, vérifier et évaluer la
conformité de chaque échantillon reçus.
La plupart des échantillons issus au laboratoire de bactériologie sont des échantillons
urinaires qui ne doivent pas dépasser 2h après leur émission, des hémocultures, et des
cathéters.
Tout échantillon qui ne répond pas aux critères de conformité n’est pas analysé et une
observation est communiquée au service responsable.

Phase analytique
 Identification
Réalisation d’un frottis
1. Piquer une colonie
2. Frotter sur la lame qui contient une goutte de l’eau stérile
3. Séchage en quelques minutes
4. Coloration
Coloration de Gram
La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui a
mis au point le protocole en 1884. La coloration de Gram est la méthode de coloration la
plus utilisée en bactériologie médicale; elle permet de colorer les bactéries et de les
distinguer à l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram négative)
ou la fuschine (Gram positive) L'intérêt de cette coloration est de donner une information
rapide et médicalement importante.

12
  Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane (cristal violet) sur le
frottis fixé.
 Laisser agir 1 minute. Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.
 Jeter l'excès de colorant dans un bécher.
 Rincer très brièvement en faisant couler de l'H2O sur la lame au-dessus du frottis
(pas directement sur le frottis).

 Déposer quelques gouttes de Lugol sur le frottis. Le Lugol (composé iodé) est
un mordant qui permet de fixer le violet dans les bactéries.
 Laisser agir 1 minute.
 Jeter la solution de Lugol dans un bécher et rincer brièvement à l'H2O comme
précédemment décrit.
 Décolorer en faisant couler la solution de décoloration sur la lame jusqu'à ce que
le violet ne s'écoule plus du frottis (5 à 10 secondes). La solution de
décoloration contient un mélange d'alcool et d'acétone. Les pores de la paroi des
Gram+ sont fermés par la déshydratation à l'alcool. La paroi est alors
imperméable et le colorant violet reste dans les bactéries. La membrane des
Gram- est dissoute par le mélange alcool-acétone. La paroi plus mince et de
composition différente laisse alors sortir la coloration violette.
 Rincer à l'H2O.
 Contre-colorer en déposant la solution de safranine (rose) pendant 1 minute. Ce
colorant permet de visualiser les bactéries Gram- décolorées à l'étape
précédente. Cette coloration moins forte que le violet n'affecte pas la couleur des
Gram+.
 Rincer à l'H2O.
 Laisser sécher à l'air.
 Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à
immersion, au grossissement 1000x).
Test au Catalase
Certaines bactéries ont la faculté de dégrader le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). En
présence d’une bactérie productrice de catalase, on observe à partir de H₂O₂ une libération
d’oxygène gazeux selon la réaction : H₂O₂ + ½ O₂.

 Diagnostic bactériologique

13
Examen cytobactériologique des urines
L’examen cytobactériologique des urines (ECBU) est l’analyse microbiologique la plus
fréquemment réalisée en laboratoire. Le prélèvement urinaire et son transport requièrent
des précautions strictes. L’analyse permet principalement de rechercher la présence d’une
infection urinaire, de déterminer les germes responsables et d’adapter ainsi le traitement
antibiotique. L’infection urinaire est l’une des infections communautaires les plus
fréquentes.
L’ECBU débute par un examen macroscopique de l’échantillon d’urines qui permet
de noter : • l’aspect limpide, trouble ou avec des hématies ;
• la couleur (jaune pâle ou jaune foncé) qui renseigne sur la concentration en eau
de l’urine, sachant toutefois que certains médicaments peuvent la teinter.
L’examen cytologique correspond à la numération des différentes cellules présentes dans
les urines:
• la présence de leucocytes est un élément décisif de l’infection urinaire et du
processus inflammatoire (leucocyturie) ;
• la présence d’hématies en faible quantité est normale ; leur nombre important traduit
une possible infection mais ne constitue pas un élément décisif du diagnostic (hématurie) ;
• la présence de cylindres hyalins n’a aucune signification pathologique tandis que
celle des cylindres leucocytaires signe une réaction inflammatoire du parenchyme rénal et
que les cylindres cireux peuvent se rencontrer en cas d’insuffisance rénale chronique ;
• la présence de cristaux n’a pas de signification pathologique, sauf celle des cristaux
d’acide urique en cas d’insuffisance rénale aiguë (hyperuricémie) et des cristaux de
cystine (cystinurie) ;
• des cellules épithéliales d’origine vaginale signent une contamination rendant le
prélèvement non interprétable.
L’examen bactériologique comprend l’examen microscopique avec coloration de Gram,
ainsi que l’identification et le dénombrement des germes, exprimé en unités formant
colonies (UFC)/mL. Escherichia coli reste le germe le plus fréquemment rencontré dans
les infections urinaires.
L’antibiogramme permet d’analyser la sensibilité des éventuelles bactéries aux différents
antibiotiques afin de prescrire le traitement adapté.
Hémoculture
Une hémoculture est un examen sanguin essentiel en infectiologie. Il consiste en un
prélèvement de sang veineux, qui est ensuite mis en culture afin d'y rechercher des
microorganismes. Il est effectué si possible avant la mise en route d'une antibiothérapie.
14
Pour l’hémoculture on effectue 2 culture une dans un flacon aérobie et l’autre dans un
flacon anaérobie ; l’hémoculture est normalement incubée durant 7 jours mais en cas
d’une endocardite infectieuse elle est incubée durant 30 jours.
Examen bactériologique d’un LCR
 Le prélèvement : La ponction lombaire est réalisée avec une asepsie rigoureuse.
La quantité moyenne de LCR suffisante pour la majorité des examens à réaliser est
de 3 ml, recueillie dans 3 tubes stériles numérotés 1, 2, 3 servant respectivement à
l’examen biochimique, microbiologique et cytologique.
 L’acheminement du LCR vers le laboratoire doit se faire sans délai (moins de
30 minutes) en raison de la lyse rapide des polynucléaires (jusqu’à 50 % en 2
heures), et à l’abri du froid en raison de la fragilité de certaines bactéries,
notamment les méningocoques. Un minimum de renseignements cliniques, (en
particulier l’âge, la présomption diagnostique, les traitements antibiotiques
antérieurement reçus par le malade), doit être transmis au laboratoire.
 Réalisation des cultures : C’est le premier temps, systématique pour tout LCR.
Dans tous les cas sont ensemencés des milieux permettant la croissance des
bactéries exigeantes responsables de méningites purulentes.
A titre indicatif : • Gélose au sang cuit, supplémentée en facteurs de
croissance, incubée à 37°C sous une atmosphère de 5 à 10 % de CO2. • Gélose au
sang, incubée à 37°C sous une atmosphère de 5 à 10 % de CO2. • Un milieu pour
anaérobies incubé à 37°C en anaérobiose. • Un bouillon à l’extrait globulaire
(facultatif) permet de diluer les antibiotiques éventuellement présents dans le LCR.
Ces milieux sont observés après 18 h et 48 h d’incubation à 37°C et conservés 5
jours.

Figure 9. Ensemencement d’un LCR en trois spots

15
  La cytologie permet de répondre en nombre l’élément figurés par unité de volume
(millimètre cube ou microlitre, millilitre). Lorsque des éléments figurés seront
présents, la richesse en ces éléments sera évaluée (rares, présence, nombreux), et
leur nature sera précisée. Pour un LCR une cytologie positive indique la présence
de +10 leucocytes.
Examen bactériologique des cathéters ou d'un dispositif intravasculaire
1. Prélever la quantité du liquide biologique présente dans le dispositif et la diluer
par l’eau stérile.
2. Ensemencer en étoile sur un milieu de culture convenable (gélose chocolat)
3. Incubation de 48h à 37C
4. Lecture des résultats en notant l’aspect et la morphologie des colonies :
 Colonisation du milieu si UFC > ou = 1 000/mL.
 Culture Demeurée Stérile
 Contamination du milieu si les colonies ne suivent pas les stries.

Figure 10.Ensemencement en étoile

Antibiogramme
L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité d’une
bactérie à différents antibiotiques. En effet, de nombreuses bactéries sont devenues, avec
le temps, résistantes aux antibiotiques. Il n’est donc pas toujours évident de trouver
l’antibiotique qui sera efficace pour traiter une souche bactérienne donnée.
En mettant en contact des bactéries (prélevées chez un malade) avec plusieurs
antibiotiques, l’antibiogramme permet de voir quels sont les produits qui inhibent la
croissance bactérienne et qui seront efficaces pour traiter l’infection.
Pour réaliser l’antibiogramme par la méthode des disques, la culture bactérienne est
ensemencée à la surface d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton,
16
éventuellement additionnée de sang. Des disques pré-imprégnés d’une dose connue
d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse à partir du
disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone
d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères
de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits.
En pratique, on réalise à partir de l’isolement (souche pure) un ensemencement en tapis
sur le milieu. On dispose ensuite les disques d’antibiotiques et on place à l’incubateur. Au
bout de 24h, on lit les différents diamètres d’inhibition et on peut conclure en comparant
ceux-ci aux abaques de lecture.

Figure 11. Technique d'ensemencement en tapis

Figure 12. A: antibiogramme après incubation ; B: Lecture des diamètres d’inhibition

17
Concentration minimale inhibitrice
La CMI se définit comme la plus faible concentration d'antibiotique (mg/l) pour laquelle il
n'y a pas de croissance visible de la souche bactérienne étudiée, les conditions de culture
étant standardisées.

III. Centre de Diagnostique de la Tuberculose et des Maladies

Respiratoires à Oujda
La tuberculose est une maladie infectieuse causée par la bactérie Mycobacterium
tuberculosis, contagieuse, associée à des signes cliniques variables suivants, regroupés du
plus important au moins important : Fièvre légère ; Toux persistante ; Expectorations
(crachats) de couleur inhabituelle ou sanguinolentes ; Perte d’appétit et de poids ; Sueurs
nocturnes ; Douleurs dans la poitrine à la respiration ou pendant la toux ; Douleurs à la
colonne vertébrale ou aux articulations.
Au Maroc, la tuberculose est un problème majeur de santé publique. Le pays a organisé un
programme national de lutte antituberculeuse PNLAT dont la mise en œuvre a permis
d’atteindre les objectifs fixés par l’Organisation Mondial de la Santé depuis les années
1995 à savoir détecter plus de 80% des cas de tuberculose et obtenir un succès
thérapeutique pour plus de 85% des patients (Institut National d'Hygiène L. N., 2017).
Le laboratoire régional de référence de la tuberculose est responsable du dépistage des
patients tuberculeux. Doté d’un matériel de bonne qualité et respectant les normes
internationales situés par l’OMS, il a pu atteindre un niveau de positivité de 4.78% dans
l’année 2019, qui est son niveau le plus élevé dès 2014. Cependant ce pourcentage reste
inférieur à la norme nationale qui est de 5%.

1. Aménagement du laboratoire
Le laboratoire est organisé en 3 parties :
Espace1 : un endroit bien illuminé avec une paillasse recouverte de faïence, facile à
nettoyer avec des détergents ou des désinfectants et un lavabo à eau courante ; pour la
préparation et la coloration des frottis.
Espace2 : une paillasse recouverte de faïence fonctionnant comme une table pour le
microscope et proche des sources d’électricité.
Espace3 : Une table pour l’enregistrement des prélèvements, rangement des documents et
registre de laboratoire ainsi que la conservation des lames lues.
2. Mesures de sécurité au laboratoire
Chaque technicien est responsable de sa propre sécurité et de celle de ses collègues.
18
Les mesures générales de sécurité concernent :
 L’accès au laboratoire, réservé au seul personnel autorisé, avec interdiction d’y
manger, boire ou fumer et d’y conserver des aliments.
 Le port de vêtements de protection :
- Les blouses doivent être portées pendant toute la durée du travail, rangées
séparément des vêtements personnels et ne pas être portées à l’extérieur du
laboratoire.
- Les gants doivent être portés pour toutes les procédures qui impliquent un
contact avec les prélèvements et tout autre matériel infectieux. Après usage, les
gants sont jetés et le lavage des mains est obligatoire.
 Le lavage des mains à l’eau et au savon (friction d’au moins 15 secondes) effectué
systématiquement après des manipulations de matériel contaminé réalisées avec ou
sans gants et avant de quitter le laboratoire.
 Le respect des bonnes pratiques microbiologiques de manière à minimiser la
création d’aérosols.

3. Recueille des prélèvements

Pour chaque patient suspect de tuberculose, 2 expectorations sont collectées en 2 jours :
- Une première expectoration recueillie le jour de la consultation, en plein air, loin des
autres patients ;
- Une deuxième expectoration recueillie le lendemain par le malade lui-même au réveil, à
jeun.
1. Le personnel de laboratoire doit expliquer au patient la démarche à suivre pour
produire une expectoration de qualité. Mettre le sujet en confiance en lui
expliquant les raisons de cet examen.
2. Quand le patient arrive avec le formulaire de demande d’examen, lui donner un
crachoir fermé hermétiquement, clairement identifié avec le nom et le prénom du
patient, en indiquant l’échantillon numéro 1. Il faut toujours identifier le crachoir
sur sa paroi et non sur le couvercle.

Un formulaire de demande d’examen doit accompagner chaque échantillon. Les

renseignements inscrits sur le formulaire doivent être les mêmes que ceux du crachoir.
3. Récupérer le crachoir et contrôler la quantité et la qualité du prélèvement. Noter
l’aspect des expectorations sur le formulaire de demande d’examen.

19
En notant que La salive et les décharges nasopharyngées ne sont pas considérées comme
des échantillons idéaux. Néanmoins, ils doivent être examinés.
4. Donner le deuxième crachoir bien identifié avec le nom et le prénom du patient, en
indiquant l’échantillon numéro 2.

Figure 13. De gauche à droite, échantillon : mucoїde, purulent, hémorragique et salivaire.

4. Diagnostique de la tuberculose

Le diagnostic est évoqué devant des symptômes et des radios-thorax, mais la confirmation
reste purement bactériologique parfois histologique ou moléculaire. Les techniques mises
à la disposition du clinicien ces dix dernières années sont en train d’évoluer radicalement
l’approche diagnostique de la tuberculose.(Jabri et al., 2016)

A. Prélèvements :
Dans le but de diagnostiquer une tuberculose il faut en premier intention réaliser des
prélèvements dont le site diffère en fonction du siège de la maladie.
Pour la tuberculose pulmonaire on fait recours aux expectorations spontanées ou induites,
au tubage gastrique, aux aspirations bronchiques et au lavage broncho-alvéolaire.
Pour la tuberculose extra-pulmonaire, il y a les liquides de ponction pleurale, péritonéale,
lombaire, péricardique, articulaire, ganglionnaire, l’hémoculture, les urines et le pus…

B. La Bacilloscopie :
Confection des frottis
1. Il faut placer le matériel nécessaire sur la paillasse, près d’un bec bunsen.
2. Marquer le numéro du prélèvement correspondant au registre du laboratoire avec le
numéro de l’échantillon 1 ou 2, comme indiqué sur le crachoir.

20
3. Ouvrir doucement le crachoir pour éviter les aérosols et prélever à l’anse
métallique une parcelle purulente ou hémorragique de l’expectoration.
4. Déposer le contenu de l’anse au centre de la lame et l’étaler en effectuant une
rotation continue sur le tiers central de la lame sans atteindre les bords.

5. Tremper l’anse immédiatement dans le flacon contenant l’eau de javel, par des
mouvements verticaux, pour la débarrasser des particules qui restent collées à
l’anse. Flamber l’anse de la base fixée dans le manche vers l’extrémité qui a
plongé dans l’échantillon. L’anse doit être chauffée jusqu’à l’obtention de la
couleur rouge incandescente.
6. Sécher le frottis en plaçant la lame sur un porte-lame ou sur une plaque chauffante
si disponible. Laisser sécher à l’air (15 à 30 minutes sur le porte-lame sans
chauffage). Ne jamais sécher les lames à la flamme au risque de générer des
aérosols. Éviter de déplacer les lames non séchées pour la même raison.
7. Quand la lame est bien sèche, la prendre à l’aide de la pince métallique pour la
fixer en passant rapidement trois fois sur la flamme bleue du bec bunsen, le frottis
tourné vers le haut. L’exposition à la chaleur empêche les bacilles de se détacher
de la lame au cours des étapes de coloration, mais une chaleur excessive
endommage les bacilles. Cette étape de fixation doit donc être bien observée.

Coloration de Ziehl-Neelsen:
21
 a) Préparation des réactifs :
 Fuchsine phéniquée à 1%, 1L
Fuchsine basique 10g, Ethanol 100ml, Phénol cristallisé 50g.
 Acide-Alcool à 3%, 1L
Acide chlorhydrique 30ml, Ethanol à 95% 970ml.
 Bleu de méthylène à 0.1%, 1L
Bleu de méthylène hydrosoluble 1g, Eau distillée 1L
b) Coloration des lames :
1. Coloration
Recouvrir complétement la lame de fuchsine pendant 10min.
2. Décoloration
Rincer à l’eau chaque lame individuellement.
Recouvrir chaque lame par l’acide-alcool pendant 3min strictement.
3. Contre coloration
Rincer à l’eau chaque lame individuellement.
Couvrir chaque lame par la solution de bleu de méthylène dans une
durée d’une minute.
Examen au microscope :
Lecture à l’objectif 100 après mis au point par objectif 40.
Les BAAR apparaissent sous forme de bâtonnets rouges, fins, droits ou incurvés, à
coloration régulière ou granuleuse, isolés ou groupés en amas de quelques bacilles.

Figure 14. Exemples de morphologies caractéristiques des bacilles de la tuberculose

Interprétation des résultats :

22
 C. Culture des mycobactéries :
Le diagnostic bactériologique de la tuberculose est posé lorsque la positivité de
l’échantillon biologique a été établie par examen microscopique de frottis, mise en culture
ou d’autres tests approuvés par l’OMS. La culture des mycobactéries, plus sensible que
l’examen microscopique (bacilloscopie), permet l’identification biochimique et
l’antibiogramme des bacilles isolés. Elle seule permet le diagnostic de certitude de la
tuberculose (Institut National d'Hygiène L. N., 2017)
Traitement des expectorations
Le processus consiste à traiter les expectorations afin d’éliminer la flore indésirable
associée. Le traitement appliqué repose sur la grande résistance du bacille tuberculeux aux
différents agents chimiques (NaOH, H2SO4 et détergents) qui détruisent les autres germes
contenus dans l’expectoration.
Les bacilles de la tuberculose et autres mycobactéries sont plus résistants que les germes
banals aux agents chimiques mais des traitements prolongés peuvent également les
éliminer complètement.
Méthode de Petroff
1. Fluidification – Décontamination
Dans un tube à centrifuger, conique, stérile, de 50 ml, à fermeture hermétique:
- Verser 2 à 3 ml d’expectoration.
- Ajouter deux fois le volume d’expectoration en soude (NaOH) à 4%.
- Ajouter quelques gouttes d’indicateur de pH (bleu de bromothymol).
- Agiter vigoureusement à l’aide d’un vortex.
- Incuber dans une étuve à 37°C, pendant 20 minutes.

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 2. Neutralisation
Neutraliser à l’aide d’une solution d’acide sulfurique à 4%.
La neutralité est atteinte lorsque la solution vire au jaune.

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 3. Centrifugation
Centrifuger à 3.000 T/min pendant 20 mn (température fixée à 20 -25°C). Éliminer le
surnageant, le verser doucement et en une seule fois dans un pot contenant de l’eau de
javel à 5° chlorométrique.

4. Ensemencement du culot
Suspendre le culot et ensemencer des tubes de milieu solide (2 à 3 gouttes ou 0,2 ml par
tube). Incuber les tubes à 37°C.
Déposer une goutte sur une lame pour un examen microscopique de la morphologie des
bacilles.

Expression des résultats :

Les résultats des cultures sont notés, à chaque lecture, sur le cahier (ou la fiche) de
paillasse :
Cultures positives
Les cultures sont déclarées positives dès l’apparition de colonies :
- Typiques, à croissance lente, se développant en 3 à 4 semaines, rugueuses de
couleur beige prenant en vieillissant un aspect en chou–fleur. En présence de telles
colonies, l’identification de Mycobacterium tuberculosis peut être posée sans ambigüité.

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Figure 15. Résultat d’une culture de mycobactéries : Tube 5culture négative ; Tube 6 et 7 cultures positives
présentant des colonies typiques.

Cultures négatives
Les cultures sont déclarées provisoirement négatives à partir du 30ème jour. Jusqu’à la fin
du 2ème mois, cette réponse est toujours provisoire.
Les cultures sont déclarées négatives si elles le restent jusqu’au 70ème jour d’incubation.
La réponse culture négative doit toujours être accompagnée de la date à laquelle la lecture
du résultat a été faite.

D. Xpert RTB/RIF :(Organisation mondiale de la Santé, 2014)

Le test Xpert MTB/RIF reste le seul test de détection de l’ADN en temps réel entièrement
automatisé basé sur une cartouche permettant de détecter à la fois la tuberculose et la
résistance à la rifampicine en moins de deux heures. C’est également la seule technique
actuellement au point parmi les systèmes automatisés de diagnostic moléculaire de
nouvelle génération. Depuis 2010, pas moins de 85 articles de recherche revus par un
comité de lecture ont été publiés sur l’utilisation du test Xpert MTB/RIF pour le diagnostic
de la tuberculose pulmonaire, de la tuberculose extra pulmonaire ou de la tuberculose
pédiatrique. De nouvelles études sont par ailleurs toujours en cours.
En un seul test et en deux heures, il permet de détecter à la fois le complexe
Mycobacterium tuberculosis et la résistance à la rifampicine, avec un temps de
manipulation technique très limité. L’amplification par PCR et la détection sont intégrés
dans la cartouche Xpert MTB/RIF, qui constitue une unité de test tout-en-un. Une fois
l’échantillon transféré dans la cartouche, toutes les étapes du test sont automatisées et

26
réalisées à l’intérieur même de cette cartouche. En outre, le réactif pour échantillon
nécessaire à la réalisation du test (qui sert à liquéfier les expectorations) est tuberculocide,
c’est-à-dire qu’il a la capacité de tuer les bactéries de la tuberculose.
La procédure de test peut être réalisée directement sur des échantillons cliniques, que ce
soit sur des échantillons d’expectorations frais ou sur des culots d’expectorations (aussi
appelés sédiments d’expectorations) obtenus après décontamination et concentration de
l’échantillon. Dans les deux cas, le matériau à tester est combiné à du réactif, mélangé à la
main ou à l’aide d’un vortex, puis laissé en incubation à température ambiante pendant 15
minutes. Après cette incubation, 2 ml de l’échantillon traité sont transférés dans la
cartouche et le test en machine peut commencer.

Pour la détection de la résistance à la rifampicine, le test Xpert MTB/RIF utilise la

technique de balises moléculaires. Les balises moléculaires sont des sondes d’acide
nucléique qui reconnaissent et signalent la présence ou l’absence de la séquence normale
de type sauvage et sensible à la rifampicine du gène rpoB du bacille de la tuberculose.
Cinq balises de couleurs différentes sont utilisées, chacune correspondant à une séquence
d’acide nucléique particulière du gène rpoB amplifié. Lorsqu’une balise se lie à la
séquence correspondante, elle émet une fluorescence (on dit aussi qu’elle s’allume), ce qui
indique la présence de l’une des séquences du gène caractéristique de la sensibilité du
27
bacille tuberculeux à la rifampicine. Si une balise ne parvient pas à se lier à la séquence
correspondante ou si la liaison est établie après un temps trop long, l’échantillon présente
une résistance potentielle à la rifampicine. Les résultats sont donnés en fonction du
nombre de balises positives et du moment de leur détection (lorsque l’intensité du signal
fluorescent dépasse un seuil prédéterminé une fois que le cycle de base est achevé), ainsi
qu’en fonction du résultat du contrôle du traitement de l’échantillon. Les résultats peuvent
être les suivants :
 absence de tuberculose
 tuberculose détectée, résistance à la rifampicine détectée
 tuberculose détectée, résistance à la rifampicine non détectée
 tuberculose détectée, résistance à la rifampicine indéterminée
 résultat invalide.

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Conclusion
Pour conclure, nous avons effectué ce stage en tant que stagiaire en bactériologie,
parasitologie et mycologie au sein des laboratoires de microbiologie d’Oujda. Lors de ce
stage nous avons pu mettre en pratique nos connaissances théoriques acquises durant notre
formation sur la microbiologie et nous sommes confrontés aux difficultés du monde de la
microbiologie dans le secteur sanitaire.

Ce stage a été très enrichissant pour nous, car il nous a permis de découvrir le domaine de
la microbiologie médicale, ses acteurs et contraintes. Il nous a permis de participer
concrètement à ses enjeux au travers nos manipulations.

Nous pensons que cette expérience nous a offert une bonne préparation à notre insertion
professionnelle car elle fut pour nous une expérience enrichissante et complète qui
conforte notre désir d’exercer notre futur métier de « laborantins » dans le domaine du
médicale.

Enfin, nous tenons à exprimer notre satisfaction d’avoir pu travaillé dans de bonnes
conditions matérielles et un environnement agréable.

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 ANNEXES

Annexe 2. Anophèle vecteur du paludisme Annexe 1. Solution de Giemsa pour la coloration

des frottis

Annexe 3. Bon d'examen individuel

Annexe 4. Culture positive sur gelose au sang cuit de
staphylococcus

Annexe 5.Frottis coloré à la coloration Gram montrant des

Annexe 6. Coloration de Gram
diplobacilles à gram négative

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Annexe 7. Milieux de culture préparés
Annexe 8. Taux de positivité CDTMR Oujda

Annexe 10. Colorants nécessaires à la coloration de

Ziehl-Neelsen; de gauche à droite Bleu de méthylène,
Annexe 9. Biopsie ganglionnaire d'un patient Alcool-Acétone et la fuchsine
tuberculeux

Annexe 11. Numération des colonies après ensemencement de 10µL

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Bibliographie

Institut National d'Hygiène, L. N. (2017). Manuel de bacilloscopie.

Institut National d'Hygiène, L. N. (2017). Manuel de culture des mycobactéries. Rabat:

INH.

Jabri, H., Lakhdar, N., El Khattabi, W., & Afif, H. (2016). Les moyens diagnostiques de la
tuberculose. Revue de Pneumologie Clinique, 72(5), 320–325.
https://doi.org/10.1016/j.pneumo.2016.06.003

Organisation mondiale de la Santé. (2014). Technique automatisée d’amplification de

l’acide nucléique en temps réel pour la détection rapide et simultanée de la
tuberculose et de la résistance à la rifampicine : Utilisation du test Xpert MTB/RIF
pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire et d.

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