Charvolin Elonore Epinette Sbastien Erny Ccile Farcy Solenne Fleury Carinne Guichoux Erwan

DESS Gestion de la Biodiversit Mthodologies dEtude et Valorisation des Ressources Gntiques 2002/2003

Les nouveaux outils dinvestigation du gnome : base dune meilleure connaissance du Paludisme ?

Dans le cadre de ce mmoire, nous tenons remercier M. A. SARR pour la bibliographie et les contacts fournis. Nous adressons galement tous nos remerciements Mme G. MILON qui nous a consacr beaucoup de temps et qui nous a grandement aid par ses explications, lapport de publications complmentaires et par lorganisation dune rencontre avec dautres chercheurs de lInstitut Pasteur. Nous exprimons dailleurs toute notre gratitude Messieurs J-Y. COPPEE, P. DAVID, E. BISCHOFF et E. YERAMIAN qui ont pris le temps de nous prsenter une partie de leur travaux, de nous expliquer toute la partie mthodologique du squenage et de nous faire visiter les locaux de la nouvelle plate-forme de gnomique de lInstitut Pasteur. Nous sommes aussi reconnaissants M. M. TIBAYRENC pour avoir accept de sentretenir avec nous lors de son passage lInstitut Pasteur. Nous sommes grs lquipe pdagogique pour son soutien, et plus particulirement M. T. ROBERT et Mme M. MASSELOT qui nous ont mis des articles supplmentaires disposition. Enfin, merci aux six autres tudiants de la promotion 2002/03 du DESS Gestion de la Biodiversit pour lorganisation et le partage du matriel informatique qui ont permis de raliser ce mmoire dans de bonnes conditions.

SOMMAIRE
INTRODUCTION I. Prsentation de la maladie II. Historique III. Epidmiologie 1. Mesure pidmiologique - lindex splnique 2. Transmissibilit de la malaria et changements climatiques 3. MOZ (Zones Potentielles d'Occurrence de la Malaria) IV. Les symptmes V. Dpistage 1. La prophylaxie 2. Les luttes anti-vectorielles 3. Les mdicaments A. Historique B. Les traitements actuels Chloroquine Doxycycline Proguanil Malarone Mfloquine Artmisines Halofantrine Atbrine - Maloprim Fansidar C. Les vaccins PRESENTATION BREVE DES TROIS PARTENAIRES DE CE COMPLEXE PARASITAIRE I. Prsentation des espces 1. Biologie et rpartition des espces en cause 2. Biologie des espces A. Plasmodium B. Anophle Comportement Cycle de dveloppement II. Relatons au sein de la triade Plasmodium - Anophle - Homme 1. Immunit chez lHomme 2. Gntique des populations A.Plasmodium B.Anophle

EXPLORATION DU POLYMORPHISME GENETIQUE DES PARTENAIRES DE CETTE TRIADE AVANT LE PROJET DE SEQUENCAGE I. Plasmodium 1. Gnralits 2. Antignes de surface du sporozote 3. Invasion sous forme mrozote et les protines associes A. Variants PfEMP1 B. Molcules PfEMP1 C. Structure du gne var D. Liaison avec ICAM-1 4. La rsistance la chloroquine A. La CQR B. Les gnes impliqus 5. Le gne Pf11-1 : son rle dans la rupture des GR et dans lmergence des gamtes 6. Variation alllique des dterminants antigniques II. Anopheles 1. La rponse immunitaire de A. gambiae au contact de P. falciparum 2. La rsistance dAnopheles gambiae aux insecticides SEQUENCAGE DU PLASMODIUM ET DANOPHELE I. Gnralits sur le squenage de lADN 1. Dfinition 2. Principe de base du squenage 3. Squenage grande chelle : 1re approche 4. Histoire du squenage grande chelle A. Loutil technologique : une rvolution pour les programmes gnomes B. Les diffrentes stratgies possibles C. Les nouveaux outils molculaires et le squenage Construction dune banque de clone Les cartes physiques et gntiques Rcapitulation des outils molculaires dans lapproche squenage alatoire global 5. Quelques exemples dorganismes squencs 6. Laprs squenage : identification des gnes 7. Le protome II. Le squenage dAnopheles gambiae et de Plasmodium falciparum 1. Squenage dAnopheles gambiae A. Lancement du programme B. Intrt du programme Gnome Anopheles C. Les acteurs du rseau international D. Dbut du squenage E. 1re rsultats obtenus avec cette premire mthode F. Le squenage par la technique Shotgun - Choix de la souche - Construction des banques dADN - Squenage et rsultats obtenus

 Squenage et assemblage Annotation Rsultats et perspectives Principales difficults rencontres G. Et ensuite 2. Squenage de Plasmodium falciparum A. Historique du programme Gnome Malaria B. Les acteurs et les financements C. Intrt du squenage de Plasmodium falciparum D. Squenage et assemblage E. Les problmes rencontrs, finition et vrification de la squence F. Les rsultats G. Et aprs III. Mise disposition des donnes 1. Dfinition de la banque de donnes 2. Interrogation et intgration des bases de donnes 3. Les banques nucliques 4. Exemple de la banque de donnes de Plasmodium falciparum : PlasmoDB APPLICATIONS DIRECTES DU SEQUENCAGE I. Les puces ADN 1. Mthodologie 2. Les puces laide des tudes du Transcriptome et du Protome 3. Puces ADN et paludisme : un exemple dtude II. Les moustiques transgniques 1. Les mthodes utilises A. Utilisation de virus et de bactries B. Utilisation de moustiques striles C. Utilisation de la transgnse 2. Les diffrentes expriences de moustiques transgniques 3. Actions sur le systme immunitaire dAnophles gambiae 4. Etudes sur les lments transposables 5. Les limites des moustiques transgniques 6. Les consquences possibles dintroduction de moustiques transgniques POLEMIQUES LIEES AU SEQUENCAGE LIMITES DE LA SCIENCE POUR LUTTER CONTRE LE PALUDISME PERSPECTIVES DANS LA LUTTE CONTRE LE PALUDISME

INTRODUCTION

I. Prsentation de la maladie
La malaria est lheure actuelle la maladie la plus rpandue dans le monde. Cest une affection parasitaire due un protozoaire, encore appel Hmatozoaire de Laveran , du nom du chercheur layant identifi. Dautres noms plus frquemment utiliss, rvlent la perception que lhomme a eue de cette affection au cours de son histoire : Malaria venant de mal aria : air vici Paludisme, fivre des marais , tirant son origine de palus : marais. Miasme morbide , notamment au XIXe sicle

Cette maladie parasitaire implique trois vecteurs distincts. Tout dabord un parasite unicellulaire du genre Plasmodium, un vecteur de transmission lAnophle et un hte unique lhomme(Encyclopedia Universalis, http://www.who.int). Actuellement quatre types de parasites diffrents ont t identifis : Plasmodium vivax Plasmodium falciparum Prsent partout dans le monde, incluant certaines zones tempres. Cest le plus pathogne de tous les parasites, responsable de la majorit des cas mortels. Prsent sur lensemble des continents, il est surtout frquent en Afrique. Plasmodium malariae Cette espce nest pas mortelle dans la majorit des cas mais peut provoquer des rechutes jusqu 20 ans aprs la primo-infection. Sa rpartition est mondiale mais de faon ingale et sporadique. Plasmodium ovale Il nest pas fortement mortel et provoque des rechutes 4 ou 5 ans aprs la primoinfection. Cette espce est surtout prsente en Afrique de lOuest. Le cycle du Plasmodium sera dtaill ultrieurement, nanmoins afin de comprendre les niveaux dintervention des mdicaments, insecticides, il est important de savoir que son cycle seffectue en plusieurs tapes, rparties entre le moustique (reproduction sexue) et lhomme (reproduction asexue). Quant au vecteur du Plasmodium, il sagit de moustiques du genre Anopheles. Actuellement, 380 espces distinctes ont t recenses, dont seulement 60 seraient

susceptibles de transmettre le parasite. Lespce la plus connue et la mieux tudie est Anopheles gambiae. Cest la plus rpandue en Afrique (http://www.who.int). Comme chez la plupart des moustiques, cest la femelle Anophle qui pique lorsquelle a besoin dun repas de sang avant de pondre ses ufs. Cest ce moment que linfection du moustique a lieu, par absorption des parasites prsents dans le sang dhommes impaluds. Cest galement lors de ces repas de sang que lhomme est contamin par un Anophle porteur du parasite. Il est important de noter que toutes les espces dAnophles ne prsentent pas des murs et comportements identiques. De ce fait, lhomme nest pas toujours la cible de ses repas de sang, ce qui signifie que les stratgies de prvention, ainsi que les traitements mis en place, ne seront pas les mmes pour tous les vecteurs (http://www.who.int).

II. Historique
Daprs les rcits de nombreuses civilisations et les crits rapports de diffrentes priodes, il semblerait que la malaria ait t prsente dans la plupart des grandes civilisations humaines, mme les plus anciennes. Nanmoins, si de nombreuses hypothses voquent la prsence de cette maladie dj chez lhomme prhistorique, il est difficile de laffirmer. Lorigine de la maladie pourrait alors correspondre celle de lorigine de lhomme en Afrique, suivant ensuite par co-volution ses migrations vers lEurope et lAsie (Bischoff, 1999 ; Poser et al., 1999 ; http://www.asnom.org). Les premires traces crites voquant les symptmes de la malaria, semblent dater de lantiquit chinoise. En effet, d'aprs le Ching Nei, crits lgendaires de lEmpereur Huang Ti (l'Empereur Jaune), les syndromes de la malaria taient dj prsents, associant des cas de splnomgalie dimportes fivres. Dans cette littrature mdicale chinoise datant du IIIme sicle avant Jsus-Christ, plus connue sous le nom de canon de la mdecine chinoise , lauteur symbolise la maladie sous la forme dun dragon trois ttes reprsentant chacune lun des accs lacustres : la premire tient un marteau symbolisant les maux de tte, la seconde porte un seau deau glace symbolisant les frissons et la dernire un diadme de fer port au rouge, symbolisant enfin les fivres de la maladie. Dans lEgypte ancienne, la malaria apparat galement : elle est notamment dcrite dans les papyrus dEbers datant de 1550 avant Jsus-Christ. Il voque alors le rle du moustique et

des eaux stagnantes dans la contamination de la maladie. De mme, les papyrus dEdwin Smith, Trait de mdecine datant de 1600 avant Jsus-Christ, mentionnent lassociation de fivre, de contractures et de cas de splnomgalie. Enfin, le terme de mauvais air aborde dj le rle du vent dans la dissmination de linfection. Paralllement, ces crits sont confirms par des hiroglyphes dcouverts dans le temple de Dendara o dimportantes fivres auraient touches les populations la suite des crues du Nil (Bischoff, 1999 ; Poser et al., 1999 ; http://www.snof.org). Sur le continent indien, cest dans l'Ayurveda ( Ayus vie, Veda connaissance ; la science de la vie) que la malaria est aborde. Dans ces crits trouvant leurs origines dans les Vedas, plusieurs textes font rfrences aux symptmes de la maladie, notamment le Susruta Samhita ( l'un des plus anciens traits de science mdicale connus ), le Bhela Samhita et le Charaka Samhita (ouvrage de mdecine). La malaria est alors dcrite travers des accs de fivres tierces et quartes, attribues par la colre de Shiva (Bischoff, 1999 ). Enfin, dans le bassin mditerranen, de nombreux crits retracent des vagues de malaria ayant ravag les populations locales. Cest le cas des crits de Cicron ou de Lucrce, mais aussi de certaines lgendes comme celle dEmpdocle Agripante, en Grce, qui dlivra Slinas de la maladie en asschant les marais en 550 av Jsus-Christ. Il apparat clairement que si lhomme ne connat pas encore la maladie cette poque, il lassocie dj aux moustiques et aux eaux stagnantes. Du Moyen Age la Renaissance, trs peu dcrits au sujet de la maladie sont apparus. Durant cette poque, les recherches sont ralenties en Europe cause de linfluence du clerg. Aucune trace nest laisse par les recherches de la mdecine arabe, la plus avance dans le monde durant cette priode, en sachant que la malaria progresse alors dans le monde, envahissant le nord de lEurope et la Russie. Cette propagation du parasite semble lie deux vnements majeurs : le rchauffement climatique de la plante entre les Vme et XIIme sicles, mais aussi suite au dfrichement suscit par le dveloppement agricole en Europe. La dcouverte de lcorce de cinchona par Don Franscisco Lopez de Canizare en 1630 constitue un vritable bouleversement face limpuissance des hommes contre la maladie. En effet, utilise par de nombreuses tribus amrindiennes, ce breuvage semble prsenter des vertus curatives face aux fivres intermittentes touchant de nombreuses populations coloniales. Ds 1640, Vitelleschi, mdecin jsuite, fait alors importer lcorce du Prou en Espagne. Cette substance alors appele poudre de princesse ou poudre des Jsuites va tre couramment

utilise ds 1712 comme moyen curatif puis comme premier moyen de dpistage de la malaria (Bischoff, 1999 ; http://www.asnom.org). Les premires connaissances scientifiques concernant les causes de la maladie napparaissent qu partir de 1717 travers les travaux de Lancini. Il dcrit alors des pigmentations noires au niveau de la rate et du cerveau de certains patients morts de ces fivres, provoques par les moustiques provenant des marais. Il parle du poison des marais , inocul sous forme de mauvaise humeur dans le sang par les moustiques. Ces travaux sont confirms par ceux de Etienne Bailly en 1825, qui constate galement des anomalies crbrales sur les patients infects. Nanmoins, il faut attendre 1831 pour que le lien entre ces pigmentations et les fivres palustres soit vraiment tabli. Le parasite sera observ en 1847 pour la premire fois par Heinrich Meckel Von Hemsbach. En observant les granules noirs sur des tissus de patients morts du paludisme, il constate alors que ces pigments constituent des masses protoplasmiques, localises dans les globules rouges (Bischoff, 1999). Malgr tout, ce nest quen 1880 quAlphonse Laveran, mdecin militaire franais bas Constantine en Algrie, dcouvre lagent du paludisme. Poursuivant les travaux dbuts sur les corps protoplasmiques prsents dans les globules rouges de patients infects, il assiste un processus dexflagellation de gamtocytes mles. Il en conclut alors que les corps protoplasmiques observs sont bien des tres vivants. Tout dabord contest par la communaut scientifique, il prsente ces observations Pasteur, Roux et Chamberlain ds son retour en France. Ces travaux sont alors reconnus et accepts, lui permettant de recevoir le prix Nobel en 1907 (Bischoff,1999 ; http://www.asnom.org). Repris par de nombreux chercheurs, les travaux de Laveran ne sont que le dbut de lidentification des diffrents acteurs de la maladie. Golgi, en 1886 rvle que les fivres tierces et quartes sont provoques par des espces distinctes. On montrera plus tard que ces deux espces sont respectivement Plasmodium vivax et Plasmodium malariae. Confirms par les travaux de Marchiafava et Celli, le nom de Plasmodium est alors voqu pour la premire fois. Leurs travaux permettent galement didentifier un troisime

parasite, nomm Plasmodium falciparum en 1894 par Welch. La dernire espce, Plasmodium ovale, sera dcrite en 1922 par Stephen. Les tapes suivantes des recherches ont concern ltude du vecteur de la maladie. Cest le cas des travaux de Ross, mdecin anglais de larme des Indes, mens en 1897, dont le but est de montrer que le moustique joue un rle important dans la transmission du parasite. Pour cela, il fait se nourrir des moustiques sur des patients impaluds puis les dissquent diffrents jours aprs lincubation. Il constate alors la prsence de cellules pigmentes dans lestomac du moustique, rvlant ainsi leur contamination par le parasite partir de sang humain infect. Paralllement, il montrera que la transformation des oocystes en sporozotes (cf. cycle dans la partie II) se fait au niveau des glandes salivaires du moustique. Enfin, il montre que des oiseaux sains sont impaluds par des moustiques infects, concluant alors que les moustiques jouent bien le rle de vecteur entre le parasite et lhomme dans la transmission de la maladie. Il reut le prix Nobel en 1902 pour ses recherches. Paralllement, Grassi fait des expriences similaires afin didentifier le vecteur responsable de la maladie. Ces premires recherches effectues sur des moustiques de type Culex restent infructueuses. En effet, malgr leurs contacts avec des patients infects, aucun dveloppement parasitaire nest observ chez ce moustique. Il faudra attendre 1898 pour dcouvrir, par hasard, que le parasite ne peut tre transmis que par une seule espce : lAnophle. Une fois ce problme rsolu, il ne fallut alors que deux mois pour identifier parfaitement le cycle entier des deux parasites Plasmodium vivax et Plasmodium falciparum. La nomenclature concernant les diffrents stades de dveloppement du parasite sera publie en 1900 par Schaundinn. Enfin, Clarac et Bouet montrent travers leurs recherches sur le paludisme Madagascar que la frquence et la gravit de la maladie sont proportionnelles la dispersion et la pullulation des Anophles dans les zones de contamination. Paralllement, ils montrent que la destruction des lieux de ponte rduit nettement la morbidit palustre, sachant que ce vecteur neffectue ses repas de sang que pour assurer sa procration (Bischoff, 1999 ; http://www.asnom.org). Les diffrents acteurs de la maladie identifis, la bataille pour lradication de la malaria est alors engage. On assiste de vastes campagnes de prvention, associant tudes

pidmiologiques, campagnes dasschement et de traitements prventifs (cf. fig.1), notamment dans les territoires coloniaux, coordonnes par le service de sant coloniale , puis par lOMS (Organisation Mondiale pour la Sant), lors de sa fondation en 1948.

Fig. 1 : Campagne de traitement du paludisme dans une colonie franaise

III. Epidmiologie
La malaria est largement rpandue dans le monde (cf. fig. 2), essentiellement dans les zones tropicales dAsie, dAmrique du Sud et surtout dAfrique o 90% des cas sont recenss (Greenwood et al., 2002 ; http://www.who.int).

Fig. 2 : Evolution du paludisme au cours des 600 dernires annes

Le paludisme svit dans la plupart des rgions tropicales du monde, avec une prdominance de : Plasmodium falciparum en Afrique, en Nouvelle-Guine et Hati. Plasmodium vivax dans le sous-continent indien et en Amrique Centrale. Plasmodium malariae tant prsent dans presque toutes les rgions o le Plasmodium ovale est rare hors du continent africain mme si quelques cas

parasite est endmique, en particulier au sud du Sahara. ont t recenss dans dautres rgions. Actuellement on estime quune centaine de pays sont concerns par la malaria. Il est difficile destimer avec prcision la proportion des populations touches par laffection, sachant que celles-ci sont souvent pauvres et isoles, mais aussi parce que le paludisme nest pas toujours identifi. On estime cependant que le nombre de personnes exposes la malaria est proche de 2,5 milliards, dont 270 millions seraient dj infectes. Le paludisme provoque entre 1 et 3 millions de morts chaque anne dont la moiti sont des enfants. On estime galement que 300 500 millions de personnes sont contamines annuellement. Les continents sont ingalement affects par le paludisme. L'Afrique est la plus touche, avec environ 94 millions de cas cliniques, contre 5 10 millions en Asie du Sud-Est, 1 2 millions en Amrique du Sud et moins de 500 000 cas en Europe. La malaria est donc bien la premire cause de mortalit infectieuse dans le monde (http://www.oms.int) On constate enfin une rpartition ingale entre des zones de fort endmisme et des zones dendmisme plus faible. Le passage de personnes impaludes de lune de ces zones de fort endmisme vers une zone pargne par la maladie provoque alors dimportantes pidmies. En effet, les personnes souvent en contact de lAnophle dveloppent des rsistances naturelles au parasite, devenant alors porteurs asymptotiques de linfection. Les autres populations, moins exposes, ne la possdent pas (http://www.oms.org, http://www.who.int,). Il est souligner que les risques sont nettement moins levs de contracter le paludisme dans les grandes villes ou les cits qu'en zone rurale. En Europe ou en Amrique du nord, on parle de paludisme dimportation ou de paludisme daroport. En effet, ces zones sont vierges de toute pidmie, mais on constate nanmoins des cas dinfection. En 1999 en France environ 7000 cas cliniques ont t recenss, dont 95% furent contracts dans la zone sub-saharienne en Afrique. La malaria daroport est particulirement

dangereuse car en gnral elle nest pas suspecte. En effet, le patient ne stant pas rendu dans les rgions o la maladie est endmique, le diagnostic et le traitement sont souvent longs tablir. De ce fait, les risques de mortalit sont plus importants (http://www.who.int). 1. Mesure pidmiologique - lindex splnique (http://www.asnom.org) Pour tudier les limites et lintensit dune pidmie dans une zone donne, deux approches peuvent tre compares. La premire est une tude quantitative estimant prcisment le nombre de personnes atteintes. La seconde est un indicateur, facile utiliser et permettant destimer de la faon la plus fiable possible, le nombre de personnes contamines. Cet indicateur est souvent utilis dans les zones les moins accessibles. Cest le cas de lindex splnique. Cette mthode est rapide et non coteuse. Elle consiste estimer la situation paludique en mesurant par palpations (cf. fig 3), les variations de la taille de la rate, notamment chez les enfants de 5 15 ans. A chaque accs palustre, la rate augmente de taille de faon importante et devient palpable sous le rebord costal du cot gauche, ce qui nest pas le cas en temps normal. Ce diagnostic est instantan, et mme sil est moins fiable que des tudes microscopiques, il permet de mesurer lpidmiologie des zones les plus recules et ainsi dadapter les interventions de prvention. Farinaud montre grce cet indice que 96% des enfants sont parasits avant la fin de leur premire Fig. 3 : Mesure de lindex splnique anne. Leur index splnique augmente rapidement pour atteindre un maximum entre lge de 2 et 5 ans, puis se stabilise. Cest la pubert que lHomme dispose dune immunit suffisante pour rsister linfection mme si les accs palustres sont observables tout au long de sa vie. Enfin, il constate que le paludisme se dclare lorsque les dfenses immunitaires de lorganisme diminuent. 2. Transmissibilit de la malaria et changements climatiques (Martin et al., 1995 ; http://www.medias.obs)

La zone de transmissibilit de la malaria est contrle par des facteurs climatiques tels que la temprature, lhumidit et les prcipitations. En effet, ces facteurs rgulent la biologie du dveloppement des moustiques et des parasites. Dans le cas de la temprature, on constate quelle affecte la survie du parasite au cours de son cycle sexu effectu dans l'Anophle. Se dveloppant le plus rapidement entre 27 et 31C (entre 8 et 20 jours selon les espces), le cycle est d'autant plus long que la temprature est basse, voir impossible si celle-ci descend en dessous de 19C pour Plasmodium falciparum, et 15-16C pour les autres espces. La temprature modifie aussi les capacits de reproduction des Anophles. Optimales entre 22 30C, elles allongent la vie des moustiques et accroissent la frquence des repas sanguins pris par les femelles, jusqu' un repas par 48 heures. Ces tempratures rduisent galement le cycle de vie aquatique des moustiques de 20 7 jours, et diminuent le dlai entre l'mergence et la ponte, ainsi qu'entre les pontes successives (cf. fig. 4) Fig. 4 : Influence du climat sur le rpartition du palusime en Afrique Quant aux prcipitations, elles constituent un facteur important dans la slection des

Cette carte est une reprsentation thorique base sur les donnes climatiques long-terme. Elle montre la distribution potentielle moyenne du paludisme sur une anne. (Elle ne reflte pas, par consquent, pas la distribution actuelle de la maladie. De plus, les moyens de lutte mis en uvre ne sont pas pris en compte). Dans les zones o le climat est propice au paludisme (rouge=1), la maladie est endmique. Au contraire, l o le climat est inadapt (blanc=0), le paludisme est pidmique ou absent. Dans les aires comprises entre 0.1 et 0.9, la transmission est soit continue mais faible (e.g. Afrique de lest), soit cyclique suivant les saisons (e.g. Afrique du sud et de louest).

sites de ponte. En effet, si elles permettent la colonisation de nouveaux lieux de reproduction, elles ne doivent pas dtruire des lieux existants en tant trop fortes ou en transformant des flaques en ruisseaux. Il en est de mme pour les rgions subissant rgulirement des priodes de scheresses, mettant en danger les larves et les ufs. Enfin, les adultes Anopheles ont un taux

de survie plus lev et une activit suprieure si lhumidit de l'air ambiant est environ 50 ou 60 % d'humidit relative. Dans les zones o la malaria est permanente, les conditions climatiques sont favorables au vecteur et au parasite toute l'anne. Il n'y a pas de fluctuations significatives d'une anne l'autre mme si des variations saisonnires sont possibles. Le taux d'infection reste lev mme avec une faible population de moustiques, ce qui y rend virtuellement impossible l'radication de la maladie. Les populations indignes dveloppent une forme d'immunit qui les protge d'une mortalit leve. Dans ces zones, la plupart des dcs dus la malaria touchent les bbs et enfants de moins de cinq ans, qui n'ont pas encore dvelopp d'immunit, et les femmes enceintes. Lorsque la malaria est saisonnire, cest--dire dans les rgions o les conditions climatiques provoquent un dveloppement priodique ou occasionnel des parasites et des vecteurs, alors les populations indignes n'ont pas le temps d'acqurir une immunit. Les groupes risque sont moins bien dfinis et les taux de mortalit en cas d'pidmie peuvent tre trs levs. Les campagnes d'radication, les modifications biogographiques telles que la dforestation, des vnements climatiques exceptionnels peuvent tre suivis d'pidmies. Malgr les campagnes internationales d'radication et de contrle, la situation de la malaria ne s'est pas amliore depuis les annes 60. Ceci peut s'expliquer par l'adaptation des vecteurs aux nouvelles conditions environnementales, aux rsistances croissantes aux pesticides ainsi que la rsistance des parasites aux mdicaments anti-paludens. Des facteurs tels que l'instabilit politique, les migrations, et le dveloppement socio-conomique peuvent galement accentuer les problmes rencontrer dans lendiguement de la maladie. Les changements climatiques passs ont fortement affect la distribution de la malaria. Un changement climatique global est donc susceptible de modifier encore sa gographie. Cependant la prvision de l'extension gographique et de l'intensit de la malaria est difficile dfinir car sa relation avec le climat est assez complexe. 3. MOZ (Zones Potentielles d'Occurrence de la Malaria) (Martin et al., 1995 ; http://www.medias.obs) S'appuyant sur des concepts physiques et biologiques, ce modle a t mis en place afin d'tudier la sensibilit de la transmission de la malaria face aux perturbations climatiques, en connaissant les conditions optimales de survie et de dveloppement la fois du parasite et du vecteur. De nombreux facteurs sont pris en compte comme :

Lindice dhumidit (une valeur critique moyenne de 0,7 a t retenue, elle Le climat de contrle (on utilise les moyennes mensuelles actuelles de Lutilisation des cartes de rpartition du moustique avant son radication,

correspond aux habitats les plus sec des moustiques, comme la savane). temprature et de prcipitation). ainsi que la carte de lOMS en 1990. Les simulations effectues avec cinq scnarios de changements climatiques montrent une diffrence significative de celle obtenue avec le climat actuel: Laire de transmission potentielle de la malaria s'accrot de 7 28 %. Au plan gographique, la malaria pourrait gagner les pays temprs de Les zones saisonnires de malaria s'tendent de 16 55 %. Cette expansion

l'hmisphre Nord.(Europe, Asie, Amrique du Nord, Russie). saisonnire sur des zones auparavant exemptes de malaria favoriserait les pidmies, causant une mortalit accrue et une morbidit leve dans des populations non prpares ou non immunises. Les zones permanentes pourraient se rduire.

Afin damliorer ce modle, les versions futures de MOZ devront prendre en compte : le temps de maturit des parasites. la longvit des moustiques. les effets de la dormance des parasites ou de l'estivation / l'hibernation des la prise en considration de la distribution biogographique des parasites et la r-valuation de l'vaporation potentielle qui semble surestime dans les

moustiques. des vecteurs paludens. calculs actuels. Enfin, il faudrait coupler MOZ des modles pidmiologiques pour inclure la dimension humaine de la malaria.

IV. Les symptmes (Encyclopedia Universalis, http://www.asnom.org)

Les premiers symptmes apparaissent de quelques semaines plusieurs mois aprs la contamination. Cette latence correspond la dure dincubation ncessaire la formation des schizontes intra-globulaires (cf. cycle du Plasmodium).

Les premires manifestations cliniques du paludisme sont souvent trs banales, consistant en un tat infectieux fbrile de type grippal ou typhodique. Il est souvent difficile de diagnostiquer la maladie ce stade partir des symptmes observs, sauf si un cas de malaria est suspect (zone endmique, voyage). Au bout de plusieurs jours, le malade semble guri. Cest alors quapparaissent les grands accs fbriles intermittents caractristiques de la maladie. Ces accs de paludisme durent en gnral quelques heures et se droulent en 3 phases. Tout dabord de grands frissons avec froid intense et tremblements gnraliss, suivis de pics de fivres atteignant 41C et accompagns de sueurs profuses laissant le malade puis. Ces fivres importantes peuvent elles seules provoquer des convulsions et un coma des patients, pouvant les conduire la mort. Ces accs palustres, caractriss par ce cycle typique Frisson, fivre, sueurs est souvent d la multiplication du parasite et lclatement des globules rouges dans le sang. Parfois, ils sont galement accompagns de maux de ttes, de douleurs musculaires, de vomissements et de toux. Non traits, les accs se renouvellent sous forme tierces ou quartes selon les espces parasitaires. La rate augmente alors de volume et une anmie sinstalle, suite lclatement des hmaties. Aprs plusieurs accs, mme en labsence de tout traitement spcifique, on constate que la fivre tombe mais la gurison nest quapparente et des rechutes menacent tout instant. Cest Plasmodium falciparum qui est responsable des formes les plus graves, provoquant : vivax. accs pernicieux palustres . Vritable encphalopathie comateuse, cette forme, la plus grave, est appele galement neuropaludisme . Elle est provoque par les globules rouges infects qui se fixent sur les parois des vaisseaux sanguins, bloquant lirrigation du cerveau dans les cas mortels. fivre bilieuse hmoglobinurique , correspondant en une destruction massive des globules rouges. Cette hmolyse aigu peut aboutir une obstruction rnale. Dans ce cas, les patients ont le teint gris, une fivre importante, des urines colores de noir par la prsence dhmoglobine. Les reins se bloquent alors, pouvant provoquer la mort par urmie. tierce maligne , par opposition la tierce bnigne de Plasmodium

En 1900, Marchoux montre que ces accs rnaux sont accentus par lingestion rcurrente de quinine, accentuant la dgradation des globules rouges. Il montre galement que larrt du traitement base de quinine permet de faire disparatre la maladie. Pour les femmes enceintes, linfection par le Plasmodium a normment de consquences pour le dveloppement du ftus, entranant des complications ainsi quun mauvais dveloppement du bb. Dans les rgions de plus faible endmisme o limmunisation des populations est moins importante, on constate assez frquemment des cas plus svres comme le dcs des mres, ou du ftus ou un taux de mortalit infantile lev.

V. Dpistage
Le meilleur moyen de combattre la maladie est de raliser un dpistage rapide et prcis du parasite afin dadapter un traitement efficace. Le diagnostic de la malaria seffectue en laboratoire et repose sur la recherche des hmatozoaires dans le sang des personnes prsentant un accs fbrile. La morphologie des schizontes, lintrieur des globules rouges, permet alors de faire le diagnostique de paludisme et den dterminer la varit (cf. fig. ci-contre). Ces recherches avant tout doivent imprativement qui ferait seffectuer disparatre traitement

transitoirement les hmatozoaires, retardant le diagnostique et donc le traitement. Il existe un nouveau kit pour diagnostiquer le paludisme, conu pour les voyageurs dans des zones trs recules. Grce ce kit, le diagnostic du paludisme Plasmodium falciparum peut tre effectu sur-le-champ, sans quipement supplmentaire. Nanmoins, ce kit n'est pas adapt au diagnostic des autres espces de Plasmodium.

1. La prophylaxie

La prophylaxie correspond aux diffrents traitements de lutte mens contre le parasite, que ce soit les luttes anti-vectorielles comme les insecticides ou labsorption de mdicaments anti-paludens. 2. Les luttes anti-vectorielles (Greenwood et al., 2002 ; Vogel, 2002 ;

http://www.asnom.org, http://www.oms.org ; http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria) De 1903 la Seconde Guerre Mondiale, cette lutte consistait : 5 et 7) Pulvriser les murs dhabitations dinsecticides (cf. fig. 6) Asscher les mares et les marais Combler les fosss Mettre en place des ouvrages de drainage Epandre du mazout afin dasphyxier les larves sur les eaux superficielles non Introduire des poissons se nourrissant des larves Etablir des brigades du service dhygine infligeant des contraventions Utiliser des moustiquaires ou autres protections face aux moustiques (cf. fig.

draines.

pour chaque site de ponte dcouvert

Fig. 5 : Capture des Anophles

Fig. 6 : Pulvrisation dinsecticide

Fig. 7 : Moustiquaire de protection Ce combat assez svre contre les moustiques a galement permis de limiter en Afrique le dveloppement de la fivre jaune. Ds lapparition de la seconde guerre mondiale, un nouvel insecticide est utilis : le DDT. Ce compos organochlor, utilis comme insecticide au pouvoir rmanent, est pulvris dans les domiciles, les haies, etc. notamment lors des campagnes de prvention menes par le WHO (World Health Organisation) dans les annes 60. Si cet insecticide a constitu une tape dcisive quant lradication des Anophles dans certaines zones, notamment les zones urbaines, il apparat rapidement que son cot est trs lev, surtout pour ces zones o la pauvret est importante et ou les premiers cas de rsistance des moustiques cet insecticide apparaissent (1956). A prsent, le DDT est interdit car estim trop toxique. Les insecticides constituent nanmoins un bon moyen de prvention. Ils sont appliqus de diffrentes manires : Sur des filets ou toiles imprgns, notamment avec des pyrthrodes Sur des moustiquaires imprgnes de deltamthrine ou de permthrine Par pulvrisation dans les habitats et zones habitables Par pandage sur les sites de reproduction Par diffuseurs lectriques dans les habitats

Si ces mthodes dradication semblent porter leurs fruits comme le montrent les tudes menes au Burkina-Faso (rvlant alors une chute du taux de mortalit des enfants de moins de

5 ans de 15% 25%), dautres avis comme celui de David Modiano (Universit de Rome) sont beaucoup plus mitigs. Ils alertent alors la communaut scientifique que ces utilisations rptes de moustiquaires et autres systmes de protections anti-vectorielles limitent court terme les cas dinfection mais provoquent en contrepartie une perte de limmunit naturelle de ces populations. De ce fait, la moindre infection par le parasite inflige des consquences beaucoup plus svres. Se pose alors le problme de lefficacit de ce type de prvention long terme, si celle-ci nest pas associe dautres modes de protection tels que les traitements mdicamenteux prophylactiques (Vogel, 2002). Cette thorie semble effectivement se confirmer daprs de rcentes analyses sanguines effectues au Kenya et en Gambie o le taux danticorps des populations protges par ce type de moustiquaires est nettement plus faible que ceux de personnes non protges. 3. Les mdicaments A. Historique Lcorce de cinchona, rapporte au XVIIe sicle du Prou, tait utilise comme remde contre les fivres par les indignes. En 1820, les chimistes franais, J.Pelletier et J. Caventou, parviennent en isoler le principe actif. Parmi les quatre principaux alcalodes dcouverts, la quinine sera le seul mdicament utilis largement et de manire efficace, notamment pour le traitement des accs graves (Ridley, 2002 ; http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria ; http://www.asnom.org). Lors de la conqute en Algrie, le docteur Maillot lutilise alors comme traitement face au taux de mortalit importants causs par la malaria. Il est galement linitiateur de la chimio-prophylaxie, en donnant de la quinine en prise quotidienne comme traitement prventif (cf. fig. 8)

Fig. 8 : Formules chimique de la quinine

Il faudra nanmoins attendre 1930 pour que les premiers antipaludens de synthse soient mis en place tout dabord pour soutenir la production de quinine, mais surtout afin de saffranchir de la seule production sud-amricaine, mme si quelques productions de quinquina sont dveloppes en Inde. De plus, la quinine prsente des effets secondaires indsirables lorsquelle est utilise de faon prolonge. Chez certains sujets, on peut alors constater un dveloppement d'hmolyse intravasculaire massive aigu et dhmoglobinurie (comme la fivre bilieuse hmoglobinurique). Actuellement, la quinine est donc seulement utilise dans le cadre du traitement du paludisme grave Plasmodium falciparum. B. Les traitements actuels (Ridley, 2002 ; Encyclopedia Universalis ;

http://www.asnom.org ; http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria) Il existe deux types de traitements :

Les schizonticides qui inhibent la prolifration des schizontes lintrieur du Les gamticides qui agissent sur les formes sexues.

globule rouge

La quinine et la majorit les antipaludens de synthse, notamment les animo-4quinolines, font partie de la premire catgorie des schizonticides. Les gamticides sont par exemple les amino-8-quinolines. Chloroquine C'est une 4-amino-quinoline trs efficace pour le traitement et la prophylaxie. Utilise ds les annes 40, elle agit sur lensemble des formes de paludisme et provoque peu d'effets secondaires si son dosage est adapt. De plus, son prix est trs bas, ce qui a favoris une trs large utilisation. Malheureusement, de plus en plus de souches deviennent rsistantes la chloroquine. Cest le cas de Plasmodium falciparum en Asie du Sud-Est, o la chloroquine na plus aucune efficacit, ainsi que Plasmodium vivax en Papouasie-Nouvelle-Guine, en Indonsie, en Thalande ainsi quen Inde (cf. fig. 9) Or, la prise d'associations mdicamenteuses telles que chloroquine + Fansidar n'est pas recommande cause des effets secondaires signals.

Fig. 9 : Le Paludisme et la chloroquine La chloroquine est toujours utilise, notamment en Afrique occidentale o elle reste efficace. De mme, elle est considre comme tant un mdicament sans danger pour les femmes enceintes, la diffrence de nombreux autres composs. La doxycycline (http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria ; Ridley, 2002 ) Cest probablement le meilleur mdicament pour la prophylaxie antipaludique dans les rgions trs haut risque comme l'Asie du Sud-Est. Cependant, son utilisation chez les enfants de moins de huit ans, les femmes enceintes et qui allaitent est proscrite. La doxycycline a galement quelques effets secondaires, comme la diminution d'efficacit des pilules contraceptives ou lapparition de brlures graves par le soleil chez certaines personnes. Le dosage journalier, pour un adulte, est de 100 mg. Ce traitement devant tre commenc 2 jours avant le voyage et continuer quatre semaines aprs avoir quitt la rgion impalude. Afin dtre plus efficace, cet antibiotique, inhibant la croissante du parasite, est souvent associ dautres molcules antipaludiques.

 Proguanil Cr en 1946, ce mdicament est toujours utilis en prophylaxie dans certains pays. Cest un antagoniste du folate, constitu dune chane biguanide relie un noyau chlorophnyl. Son rle est de dtruire les parasites du paludisme en se fixant l'enzyme dihydrofolate rductase de manire trs comparable la pyrimthamine. Malarone Cre en 1998, le malarone est une combinaison du proguanil et d' atovaquone. Utilis, ds 1992 en Australie dans dautres traitements que celui contre la malaria. Son association avec le proguanil produit un effet synergique, dautant plus efficace contre le parasite. Cette combinaison a fait l'objet de quelques essais cliniques et a t trouve efficace 95%, mme pour les formes rsistantes de Plasmodium falciparum. Il a t signal que la combinaison est sans effets indsirables, mais il faut souligner que le proguanil est un antifolate, et ncessite donc une certaine prudence. En Australie, il est devenu disponible pour la prophylaxie fin 1998. La seule restriction est que ce mdicament cote trs cher. Le traitement complet est conditionn dans une boite de 12 comprims prendre pendant les trois jours que dure le traitement. Mfloquine (Lariam) Utilis ds 1971, ce driv proche de la quinine est une quinoline-mthanol (cf. fig. 10). Trs efficace contre les cas de paludisme rsistant lorsqu'il fut introduit, l'apparition d'une rsistance grande chelle, ainsi que deffets secondaires graves comme des syndromes aigus du cerveau, ont rduit considrablement son utilisation. Malgr tout la mfloquine (Lariam) est encore utilise en prophylaxie antipaludique car sa longue demi-vie permet lutilisation dune dose unique par semaine. Pour les adultes la dose est de 250 mg par semaine et la prise doit

commencer une semaine avant l'arrive dans la rgion impalude. Fig 10 : Formule de la mfloquine Artmisinines Synthtises partir d'extraits de plantes utilises comme remdes en Chine, Artemisia annua, lartmisinine a permis le dveloppement de plusieurs composs dont les plus utiliss actuellement sont l'artsunate, l'artmther et lartether. Ces mdicaments sont des gamticides. Autoriss en Asie du Sud-Est, ils ne le sont pas encore dans le monde occidental y compris en Australie. Nanmoins, ces composs pourraient tre une solution dans le traitement contre les formes rsistantes de Plasmodium falciparum notamment. Actuellement, les rsultats obtenus sont assez mitigs, cause de leur courte demi-vie, imposant des traitements sur 5 7 jours. De ce fait, des associations avec dautres mdicaments sont envisags (exemple la mfloquine) afin de diminuer la dure du traitement, de limiter les cas de rsistance et damliorer, par synergie, lefficacit contre le Plasmodium. Halofantrine (Halfan) Dvelopp dans les annes 80, ce compos phnanthrnes-mthanols est un antipaludique efficace mais sa courte demi-vie (1 2 jours) ne lui permet pas dtre utilis en prophylaxie. De plus, lapparition de souches rsistantes et les inquitudes lies certains effets secondaires, comme des troubles neuropsychiatriques, en ont limit lutilisation. Ce mdicament est dailleurs contre-indiqu chez la femme enceinte et n'est pas conseill chez la femme qui allaite. Atbrine (Mpacrine) Maloprim(dapsone et pyrimthanine), Fansidar (sulphadoxine et pyrimthamine) Ces mdicaments largement utiliss ces dernires annes subissent actuellement de nombreux cas de rsistance, ainsi que certains effets secondaires lourds. De ce fait, leurs utilisations ne sont plus recommandes.

Zone

Caractristiques Risques gnralement faibles et saisonniers Risques limits dans les zones urbaines Plasmodium falciparum est absent ou sensible la chloroquine Faibles risques dans la plupart des rgions. La chloroquine seule protge

Traitements

A Pays du Groupe 1

Prophylaxies : chloroquine

B Pays du Groupe 2

contre le Plasmodium vivax.

Rsistance la chloroquine Prophylaxies : chloroquine + proguanil

La chloroquine avec du proguanil donne une protection contre le Plasmodium falciparum. Risques :

- levs dans la plupart des rgions en Afrique et dans le bassin Amazonien C Pays du Groupe 3

Rsistance la chloroquine leve Prophylaxies 1er choix : mfloquine 2e choix : doxycycline 3e choix : chloroquine+ proguanil

- plus faibles dans les rgions d'Asie et dans le reste de l'Amrique Multi-resistances importantes en Asie, variable en Afrique et en

Amrique Tableau 1 : Utilisation dantipaludiques en fonction des rgions du monde Lutilisation de ces chimio-prophylactiques de synthse a permis de faire diminuer de manire significative lindex splnique dans de nombreux pays. Cest le cas au Togo o cet index a diminu de 50%, ainsi que le taux de mortalit. Nanmoins, de nombreuses populations ont prfr utiliser des prophylactiques tels que des insecticides plutt que des mdicaments. Ce fut le cas notamment avec le DDT car son application dans les habitations devait tre ritre tous les 6 mois, tandis que la prise de chimio-prophylactiques seffectue de faon hebdomadaire.

Pour les voyageurs, il serait extrmement dangereux de partir dans des zones de forte endmie sans prendre de traitement prventif. Ce traitement est alors adapt la zone de transit, la dure du sjour ainsi qu la personne recevant le traitement (ge, origine, femme enceinte). Mme si ces mdicaments ne garantissent pas une protection absolue contre linfection du parasite, ils permettent de limiter les risques (cf. tableau 1) Malgr tout, cette protection chimique nest que complmentaire des moyens de protection contre les piqres du moustique lui-mme (http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria ; Ridley, 2002 ). Se protger activement des piqres de moustiques repose sur : Les vtements : Sachant que les femelles moustiques commencent piquer la tombe de la nuit, il est recommand de porter ds la tombe du jour des vtements couvrant compltement les membres infrieurs et suprieurs, ce qui nest pas utile le reste de la journe. Des produits rpulsifs : Appliqus sur les parties du corps exposes, les plus utiliss sont le "Muskol" ou le "RID" dont le principe actif, le DEET (N,N-dithyl-mta-toluamide ), dos 15% est le mieux adapt. Au-del, ces produits peuvent tre nfastes, infligeant dimportants effets secondaires, notamment chez les enfants o le contact direct avec la peau est dconseill. En effet, ces produits peuvent tre appliqu sur les vtements, vitant ainsi tout risque d'absorption par la peau. De plus, certains moustiques peuvent piquer travers les vtements. Il est donc recommand de les imprgner de rpulsif ou dinsecticide. Moustiquaires : Les moustiquaires sont indispensables dans les zones impaluds ainsi que les fins grillages protgeant les fentres. Ils doivent galement tre imprgns dinsecticides, notamment par la Permthrine, puis glisss sous le matelas en vrifiant labsence de dchirures. La moustiquaire peut tre imprgne domicile avant le voyage(http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria ; Vogel, 2002). C. Les vaccins (Richie et al., 2002)

Sachant que la malaria touche essentiellement des zones peu accessibles et dont les situations conomiques et politiques sont souvent instables, la difficult daccder aux traitements a rapidement suscit lintrt face llaboration dun vaccin. Cependant, si depuis plusieurs annes on annonce la cration imminente dun vaccin antipaludique, son laboration est beaucoup plus complexe que prvu. Plusieurs problmes interviennent lors de la cration du vaccin. Le premier est que le Plasmodium passe au cours de sa vie par de nombreux stades de dveloppement, chacun portant des antignes spcifiques. Dclencher une rponse immunitaire adapte semble donc difficile. De plus, il existe actuellement 4 parasites diffrents responsables de la maladie chez lhomme, combien de vaccins faudra-t-il mettre en place pour les combattre ? Enfin, ces vaccins devront tre adapts aux populations risque (enfants, voyageurs, femmes enceintes). Faudra-t-il l encore diffrents types de vaccins ? A lheure actuelle, on constate chez les populations des rgions endmiques du paludisme que les attaques du systme immunitaire provoque une diminution du nombre de parasite, nanmoins aucun moment celui-ci nest compltement radiqu et ce redveloppe dans lorganisme assez rapidement, provoquant ainsi une infection chronique. De plus, lors de ces accs palustres, on constate paralllement que le parasite a dvelopp de nouveaux antignes. Le but dun vaccin serait donc dobtenir une action plus active, vitant ainsi le dveloppement de ce type dinfection chronique, nanmoins toutes ces barrires semblent rendre sa fabrication assez difficile. Le problme le plus important rencontr lheure actuelle pour ces traitements prophylactiques est lapparition rpte et parfois gnralise de rsistances, chez le parasite et le vecteur (Greenwood et al., 2002 ; Hemingway et al., 2002). Particulirement importants en Asie du Sud-Est, ces problmes de rsistance se dveloppent actuellement en Afrique, provoquant une recrudescence de la maladie et une augmentation du taux de mortalit. Ces rsistances sont prises trs au srieux par la communaut internationale, notamment depuis lapparition de cas de rsistance chez Plasmodium falciparum, forme parasitaire la plus mortelle. Cette prise de conscience face au risque que reprsente la malaria dans le monde, relance actuellement de faon plus dynamique les programmes de recherche pour lradication de la maladie.

Ces recherches sont essentiellement axes sur lanalyse des squences des trois acteurs, parue durant ces dernires annes : lHomo sapiens en fvrier 2002, lAnopheles gambiae et le Plasmodium falciparum en octobre 2002. Lobjectif de ces recherches est de mieux comprendre la chane de transmission du parasite, mais aussi les interactions entre les trois organismes, les mcanismes de rgulations Le but est dtablir de nouveaux traitements ou insecticides capables de contrecarrer lvolution de la maladie. Enfin, ces recherches permettront peut-tre de mieux comprendre les mcanismes de rsistance du moustique et du parasite. Un autre axe de recherche galement en cours est celui du moustique transgnique o la modification de certaines protines empcherait le bon droulement de le dveloppement du Plasmodium.

PRESENTATION BREVE DES TROIS PARTENAIRES DE CE COMPLEXE PARASITAIRE

I. PRESENTATION DES ESPECES

Le paludisme est provoqu par un protozoaire parasite du sang, principalement Plasmodium falciparum, exclusivement transmis par un moustique femelle dAnophle. Il prdomine dans les rgions humides et marcageuses. 1. Biologie et rpartition des espces en cause : Entre 50 et 60 espces dAnophles sont connues pour vhiculer les 4 espces diffrentes de parasites lorigine de la maladie chez lHomme : Plasmodium falciparum (le plus virulent), Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, et Plasmodium malariae (Martin et al., 1995). Un fort polymorphisme intra et interspcifique a permis lAnophle de dvelopper de fortes capacits dadaptation aux contraintes environnementales (insecticides, ), de mme, le Plasmodium acquiert une rsistance croissante aux mdicaments anti-paludisme (Manguin et al., 1999). 2. Biologie des espces : A.Plasmodium Classification taxonomique : Rgne des protistes Embranchement des Apicomplexa (sporozoaires) Classe des Haemosporidea Ordre des Haemosporida Famille des Plasmodidae Genre Plasmodium Oocyste de P. falciparum, x400 Au sein du genre Plasmodium, 4 espces sont anthropophiles : Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium falciparum, et Plasmodium malariae. Les trois premires sont des espces strictement infodes l'homme, tandis que Plasmodium malariae peut avoir comme hte occasionnel le singe (cf. tableau 1 et fig. 1).

Espces

Plasmodium vivax Marron dor

Plasmodium ovale Marron fonc

Plasmodium malariae Marron fonc

Plasmodium falciparum Noir

Pigment du parasite Longueur du cycle asexu

41-47 heures, en moyenne 43-45

49-50 heures

72 heures Tous: Trophozotes Schizontes quelques Gamtocytes (Quelques sporozoites mais ne restent pas longtemps ce stade.)

48 heures (approx.)

Stades dans la circulation sanguine

Tous: Trophozotes Schizontes Gamtocytes

Tous: Trophozoites Schizontes Gamtocytes

Sporozotes Gamtocytes (Les autres stades se dveloppent dans des organes internes)

Plus grande que la normale Taille maximale Plus grande que la entre 1.25 - 1.5 Taille des normale fois la taille rythrocytes Taille maximale normale entre 1.5 - 2 fois la (20% des taille normale rythrocytes infects sont ovales) Erythrocytes de Erythrocytes Erythrocytes prfrence immatures immatures Nombre de mrozoites dans le schizonte 12-24 Moyenne: 16 Plasmodium vivax 6-14 Moyenne: 8 Plasmodium ovale

Normale

Normale (rythrocytes infects en faucille)

Erythrocytes snescents 6-12 Moyenne: 8 (souvent arrang en rosette) Plasmodium malariae

Pas de prfrence 6-32 Moyenne: 20-24 Plasmodium falciparum

Espces

Tableau 1 : Caractristiques des 4 espces de Plasmodium anthropophiles

Fig. 1: Les stades de dveloppement chez les 4 espces de Plasmodium anthropophiles

(*Ring = Sporozote)

Cycle de dveloppement du parasite : (cf. fig. 2) Chez lhomme : Par une piqre, un Anophle femelle infect inocule un tre humain des formes primitives de Plasmodium : des sporozotes, formes infestantes contenues dans les glandes salivaires du moustique. Ces sporozotes passent dans le sang puis migrent vers le foie via les canaux sanguins en moins de 30 minutes. Une fois destination, ils sinstallent dans les cellules

du parenchyme hpatique, les hpatocytes, et sy multiplient. Ce stade permettant notamment la maturation des sporozotes sappelle schizogonie pr-rythrocytaire (Il est noter quil nexiste pas de cycle continu dans le foie dans le cas de Plasmodium falciparum). Le dveloppement et la multiplication des sporozotes repoussent le noyau en priphrie de la cellule pour finalement constituer une masse multinucle appele schizonte ou corps bleu. A ce stade, Plasmodium vivax et Plasmodium ovale restent quiescents dans les hpatocytes pendant un temps gntiquement dtermin. Cela explique les accs de reviviscence tardifs. Aprs 12 jours environ, plusieurs milliers de jeunes parasites appels mrozotes se trouvent dans une cellule hpatique. La cellule clate, librant ainsi les mrozotes qui pntrent alors les hmaties par endocytose pour poursuivre leur dveloppement. Dans les hmaties, les parasites se dveloppent sous forme sexue ou asexue. (http://rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.html http://www.medinfos.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.shtml http://www.med.univ-angers.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie /palu.pdf ) Cycle asexu : Les mrozotes prsents dans les hmaties se dveloppent puis sont librs, cycles schizogoniques, des gamtocytes apparaissent. (http://rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.html http://www.medinfos.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.shtml http://www.med.univ-angers.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie /palu.pdf ) Chez lAnophle : vont parasiter une nouvelle hmatie et poursuivre leur cycle intra-rythrocytaire. Aprs plusieurs

Le cycle sexu (ou sporogonique) : Les gamtes mles et femelles circulent dans le sang et sont absorbs par un Anophle femelle lors dun repas sanguin. Les gamtocytes parviennent dans lestomac du moustique o ils se transforment en gamtes. Le gamte mle subit un processus d'exflagellation la suite duquel les gamtes femelles sont fconds. Il en rsulte un oeuf appel oocinte, celui-ci s'implante sous la paroi stomacale en formant l'oocyste. Cette brve phase diplode sachve par une division meotique et est suivie par plusieurs milliers de mitoses (sporogonie) qui conduisent au dveloppement de sporozotes. L'clatement de l'oocyste libre ces lments mobiles et haplodes dans lhmolymphe. Les sporozotes gagnent les glandes salivaires du moustique d'o ils pourront tre injects avec la salive lors d'une prochaine piqre. Chez le

moustique, l'ensemble de ce cycle se droule en 10 40 jours, suivant la temprature extrieure et les espces en cause. (http://rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.html http://www.medinfos.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.shtml http://www.med.univ-angers.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie/palu.pdf ) La dure du cycle de dveloppement des Plasmodium est considrablement rduite lorsque la temprature est comprise entre 27 et 31C. Le cycle est stopp pour Plasmodium vivax, Plasmodium ovale et Plasmodium malariae en dessous de 15C, et en dessous de 19C pour Plasmodium falciparum. De plus, la temprature maximale que les Plasmodium peuvent supporter est estime 32C (Martin et al., 1995).

Fig. 2 : Cycle de vie du Plasmodium B. Anophle Classification taxonomique : Embranchement des Arthropodes Classe des Insecta Ordre des Diptera Sous-ordre des Nematocres Famille des Culicidae Sous-famille des Culicinae

Genre des Anopheles

Anopheles gambiae

Comportement : La slection sexuelle des femelles se fait sur la base dun critre de taille. En effet les mles prfrent les grosses femelles. Celles-ci ont un taux de fcondit plus lev que les autres (Okanda et al., 2002). Les individus ne saccouplent en gnral quune seule fois. Ensuite, la femelle stocke prcieusement le sperme dans des spermathques. La femelle est hmatophage pour pouvoir assurer sa fonction de reproduction. A chaque ponte, elle dpose des centaines dufs. Or, cela ncessite dacqurir, au travers de sa substance nutritive, une forme concentre dnergie. Ainsi, les quelques microgrammes de sang quelle ingre chaque piqre (pouvant reprsenter jusqu trois fois son poids !) constituent une source concentre de nutriments essentiels pour la maturation des ufs. Elle ne pique que le soir et la nuit se reprant grce aux odeurs mises par ses proies. Elle dispose d'organes sensoriels trs puissants, capables de dtecter les odeurs corporelles, le gaz carbonique, la chaleur et la transpiration mis par son hte ; elle suit donc ces stimuli jusqu' la localisation de l'hte (Budiansky, 2002).

Tte dAnophle femelle

La prsence deau stagnante est ncessaire pour la ponte. Ceci est li un des stades de dveloppement du moustique. En effet, cest une condition sine qua non pour que les larves survivent puisquelles se nourrissent de micro-organismes aquatiques. Cependant cette restriction nest pas vritablement contraignante puisque la source deau peut prendre des formes trs diverses : mares, flaques, trous remplis deau dans des arbres, pneus, botes de conserves, etc. (Budiansky, 2002). La dispersion des individus diffre selon leur sexe. Elle est relativement faible pour les mles, et plus importante pour les femelles. Les moustiques utilisent un mode actif ou passif de dispersion. La dispersion active est variable selon les espces et leur ge. La dispersion passive est ralise grce lutilisation des courants ariens et des avions. Les moustiques peuvent tre assimils du plancton arien . La rpartition des Anophles est par consquent trs difficilement contrlable (Tibayrenc, com. pers.). Dans des conditions optimales de temprature, cest--dire entre 23 et 30C et avec une humidit relative de lair de 70 80%, lesprance de vie du moustique sallonge et le nombre de repas augmente jusqu un repas par 48 heures (Martin et al., 1995). Lesprance de vie est un paramtre trs fluctuant dune espce une autre et dune saison une autre (elle rallonge en hiver lorsquil y a diapause) suivant la temprature et lhumidit relative de lair. Une tendance gnrale apparat cependant, en moyenne les mles vivent moins longuement que les femelles. En effet, les premiers vivent quelques jours alors que les femelles peuvent perdurer plusieurs semaines. Cycle de dveloppement du vecteur : Le cycle de vie de lAnophle est divis en deux stades : une phase aquatique (oeuf, larve et nymphe) et une phase arienne (adulte). Stade aquatique : Aprs l'accouplement, l'Anophle femelle prend un repas de sang humain ou animal pour permettre la maturit de ses oeufs et cherche un gte favorable pour la ponte. Les oeufs sont pondus isolment la surface de l'eau ; ils sont en gnral munis de flotteurs latraux. Le choix du gte diffre selon les espces suivant qu'il s'agisse d'eau courante ou
38

stagnante, douce ou saumtre, ensoleille ou ombrage possdant ou non la qualit biologique permettant le dveloppement ultrieur des larves. Sous les conditions favorables de temprature (18 20C), l'incubation des oeufs dure 2 3 jours. L'closion de ses oeufs libre des larves qui passent par plusieurs phases de dveloppement la suite desquelles elles muent. Elles se nourrissent de nombreux micro-organismes animaux et vgtaux, et au besoin se dvorent entre elles. La dure de dveloppement larvaire est de une trois semaines. Sous de bonnes conditions de temprature et de nourriture, elle ne dpasse pas 8 10 jours. Cette volution est d'autant plus rapide que la temprature est plus proche de l'optimum 25-30C et que la nourriture est plus abondante. A la quatrime mue, les larves se transforment en nymphes dont la dure de vie est trs courte (1 2 jours). A la fin de son volution, la nymphe se positionne sous la surface de l'eau et une fente apparat sur la face suprieure du cphalothorax d'o merge l'insecte adulte (qui sest dvelopp lintrieur de la nymphe). Celui-ci se dgage progressivement, le plus difficile consistant sortir ses longues pattes. Beaucoup de moustiques meurent ce moment, la moindre agitation de 1'eau entranant leur noyade. Stade arien : Aprs l'closion, le moustique reste quelques instants la surface de l'eau, le temps ncessaire au durcissement de sa cuticule et en particulier de ses ailes. Les prdateurs et les mouvements de l'eau ou de l'air concourent une forte mortalit ce stade. Il reste proche de son gte pendant environ 2 jours, et quelque soit son sexe, il se nourrit uniquement du suc des vgtaux. L'accouplement a gnralement lieu dans les 24 48 heures suivant 1'closion imaginale. La femelle ne s'accouple qu'une fois dans sa vie. Elle stocke le sperme dans un organe appel spermathque, dont les spermatozodes sont extraits progressivement pour fconder la totalit des oeufs qu'elle produit. Aprs l'accouplement, la femelle est oblige de se nourrir de sang pour assurer la maturation de ses oeufs. Elle s'envole alors, loin de son gte, pour chercher sa nourriture. Elle peut ce stade utiliser le vent comme mode de dispersion. Aprs s'tre gorge de sang, aliment riche en protines et en nutriments ncessaires la production et au dveloppement des oeufs, l'Anophle femelle va se mettre au repos pour digrer. Lorsquelle est gravide, elle quitte l'habitation au crpuscule pour aller chercher un gte aquatique adapt la ponte. Le temps qui s'coule entre le repas de sang et la ponte des oeufs (150 300 oeufs) s'appelle cycle gonotrophique. La dure de ce cycle varie de 2 5 jours selon les espces, la temprature et l'humidit relative.
39

II. Relations au sein de la triade Plasmodium-Anophle-Homme :

Les parasites pathognes sont transmis l'hte par la salive ou le stylet des moustiques infects. Un moustique non-infect peut tre contamin lorsqu'il pique un hte porteur de parasites pathognes ; ces parasites se dveloppent ensuite dans le corps de l'insecte jusqu' infection complte. Le moustique peut alors, son tour, infecter ses futurs htes. Lorigine rcente des populations de Plasmodium falciparum est un facteur expliquant sa virulence (Rich et al., 1998). En rgle gnrale, on note que la co-volution hte-parasite conduit une baisse de la virulence du parasite qui doit conserver son hte en vie le plus longtemps possible pour maximiser sa fitness. Cette rgle nest pas valable pour les relations parasite-vecteur. En effet, il y a un conflit dintrt entre les deux protagonistes : l o le moustique cherche maximiser son taux de fcondit (maximum atteint pour un nombre de piqres N), le parasite cherche lui augmenter son taux de transmission (maximum atteint pour un nombre de piqres infini). Lvolution de la virulence allant dans le sens du parasite, les sporozotes manipulent les moustiques en induisant une augmentation du nombre de repas sanguins provoquant ainsi une mort prmature du moustique. En prsence du Plasmodium sous la forme de sporozotes, le taux de mortalit du moustique saccrot denviron 30%. Au contraire, lorsque les oocystes sont prsent, ils doivent avoir le temps de se dvelopper par consquent ils rduisent le taux de piqres et la fcondit du moustique afin dallonger lesprance de vie de celui-ci (Koella, com. pers.). 1. Immunit chez lhomme : Deux cas sont dissocier : le paludisme peut tre saisonnier (transmission pendant 1 7 mois au cours de lanne) dans les rgions o les conditions climatiques ne permettent quun dveloppement pisodique des parasites et des vecteurs, ou bien il peut tre continu (transmission de 8 12 mois). Dans ce dernier cas, les populations indignes prsentent alors des formes dimmunit qui prvient laugmentation du taux de mortalit. Au contraire, si le paludisme est priodique, les populations locales nont pas le temps de dvelopper ce type de protection (Martin et al., 1995). Les sujets dveloppant les formes graves sont par consquent les enfants en bas ge et les personnes transplantes. Le taux dinfection est lev et peut tre maintenu par une population rduite de

40

moustique, ce qui explique en partie le fait que la maladie soit potentiellement impossible radiquer dans les zones o elle perdure tout au long de lanne (Martin et al., 1995). Il nexiste a priori pas dimmunit naturelle contre le paludisme. Cela indiquerait donc quun vaccin est peut tre conceptuellement impossible fabriquer puisque les vaccins ne font que copier la nature (Tibayrenc, com. pers.). Ltre humain dveloppe une immunit toujours relative une espce de Plasmodium donne. Elle est incomplte et fluctuante, elle permet uniquement de limiter les effets pathognes des Plasmodium. Il est toutefois noter quune relative protection vis--vis du paludisme peut tre engendre par 4 facteurs entranant des circonstances dfavorables pour le Plasmodium : la prsence d'hmoglobine S frquente en Afrique de louest. Cette hmoglobine anormale, traduite par lexistence dhmaties en forme de faucilles, est caractristique de lanmie falciforme ou drpanocytose. Cette maladie de lhmoglobine du sang est gntique, monognique et autosomale rcessive. En dpit de sa gravit, la drpanocytose persiste car elle confre un avantage slectif contre le paludisme. En effet, en condition dhypoxie (diminution de la quantit doxygne contenue dans le sang suite laltration de lhmoglobine), la mutation S de lhmoglobine confre la molcule, la proprit de polymriser en longue fibre et de modifier la forme et la plasticit du globule rouge. Le parasite ne survit que trs difficilement dans ces conditions (Rihet, 2002). - la prsence d'hmoglobine F ( qui protge le nouveau-n pendant les premires semaines de la vie) chez l'adulte: la thalassmie - un rgime exclusivement lact dficient en acide para aminobenzoque - une malnutrition protique. Il existe deux modes de transmission exceptionnels. Une transmission congnitale qui nest possible que si la mre nest pas immunise, et une transmission transfusionnelle dite du toxicomane qui est grave puisque les trophozotes (stades de dveloppement au sein de lhmatie) transmis sont directement infectant. (http://www.medinfos.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.shtml)

2. Gntique des populations :

41

A. Plasmodium Concernant lorigine des populations de Plasmodium aujourdhui rparties dans le monde, il existe une thorie ( malarial Eve ) montrant quelles descendent dune souche ancestrale unique. En estimant le taux de substitution des nuclotides, il peut tre avanc que cette souche serait apparue il y a 24 500 57 500 annes (Hughes et al., 1998 ; Rich et al., 1998). Du fait des conditions de temprature ncessaires au dveloppement du Plasmodium, lexpansion de son aire de rpartition a t stoppe par les glaciations du Pleistocne. Les conditions climatiques favorables seraient apparues il y a 6 000 ans. Cependant, la colonisation au-del de lAfrique tropicale na sans doute eu lieu que plus tard (Rich et al., 1998). Cette origine rcente peut tre la consquence dune explosion dmographique (i.e. Plasmodium falciparum sest rpandu rcemment la surface de globe partir dune petite population confine) ou bien dune dispersion partir dune souche unique favorise par la slection naturelle qui a rcemment remplace toutes les autres (Rich et al., 1998). Dans le cas de lexplosion dmographique : Plasmodium falciparum est rest localis dans une aire gographique trs restreinte pendant longtemps, avant de se disperser rapidement il y a peu de temps dans les populations humaines. Cette dispersion rapide a pu tre favorise par 3 facteurs : des changements de comportements humains et, plus prcisment le dveloppement des socits agricoles (favorisant ainsi la dforestation et lirrigation) des changements gntiques qui ont renforcs les affinits au sein de lassociation hteparasite-vecteur des changements dmographiques (migration, densit, etc.) dans les espces constituant la triade ; en particulier lexpansion de Plasmodium falciparum en rponse aux divers vnements de spciation anthropophile dAnophles. De plus, cette hypothse corrobore les donnes palontologiques de Plasmodium falciparum (Rich et al., 1998). La dispersion partir dune souche unique peut sexpliquer par une forte slection naturelle qui justifie une colonisation rapide des populations de Plasmodium falciparum par un seul gnotype haplode. Il est noter que le fait que Plasmodium falciparum ait un fort degr de polymorphisme nest pas incompatible avec une ventuelle structure clonale de la population. Il
42

a en effet t montr que ces deux caractristiques sont conciliables : Trypanosoma et Leishmania prsentent cette particularit. Nanmoins cela sous-entend que les populations de Plasmodium falciparum seraient clonales en dpit du stade sexu obligatoire du cycle de vie du parasite (Rich et al., 1998). Cependant, bien que lexistence de forts dsquilibres de liaison soit galement en faveur de la thorie malarial Eve selon laquelle Plasmodium falciparum aurait comme origine un gnotype unique (suite un rcent goulot dtranglement), diffrentes observations la contredisent. Tout dabord, il existe des polymorphismes persistants maintenus au cours de lvolution, ce qui prsuppose lexistence dune co-volution entre le parasite et son vecteur et/ou son hte qui a permis de conserver certaines formes (G. Milon, com. pers.). De plus, certains polymorphismes persistants nont t maintenus qu certains loci de Plasmodium falciparum : cela appui le fait que la recombinaison interlocus ait t un facteur important dvolution. Par consquent, certains arguments sopposent lhypothse de la malarial Eve (Hughes et al., 1998 ; Tibayrenc, 1997). La ralit biologique se situe certainement entre ces deux points de vue. Dans ce cas, le parasite se propagerait de faon asexue dans certaines circonstances. Par exemple, une population de Nouvelle-Guine prsente un taux non-ngligeable dautofcondation. Les formes infestantes des hommes tant haplodes, cette situation conduit bien une propagation clonale du Plasmodium. La cause de cette particularit rside probablement dans un taux de transmission faible entranant une probabilit rduite pour le parasite de rencontrer, dans le moustique, un individu portant un gnotype diffrent du sien et donc de se reproduire avec un tel individu. Au contraire, dans les zones fort potentiel de transmission, les populations volueraient dans des conditions proches de la panmixie (Tibayrenc, 1999 ; Abderrazak et al., 1999). Larbre phylogntique ci-dessous (cf. fig. 3) rend compte de lloignement de Plasmodium falciparum par rapport aux 3 autres groupements qui se dtachent nettement. La longueur des branches et les valeurs de bootstrap confirme une importante distance gntique.

Fig. 3 : Arbre phylogntique de neuf espces de Plasmodium (Waters et al., 1993)

43

Arbre ralis selon la mthode de neighbor-joining . Les niveaux de bootstrap (sur 1000) sont indiqus en souligns pour chaque branche interne. La longueur des branches est donne en nombre de substitutions / 100 nuclotides. (Les parasites de lHomme : P. falciparum, P. malariae, et P. vivax) B.Anophle Laugmentation de la population humaine ainsi que la colonisation de nouveaux espaces a rendu la spcialisation du moustique intressante par rapport sa fitness. Cela a permis lmergence de moustiques strictement infods lhomme. Les taxons les plus anthropophiles ont donc subit des changements de comportements, dexophiles zoophiles ils sont devenus endophiles anthropophiles. Il sensuit une co-volution expliquant en partie lefficacit du pathogne qui est, en fait, lie lefficacit du vecteur (do une augmentation massive des taux dinoculation) (Budiansky, 2002 ; Coluzzi, 2002). Le vecteur le plus important dans lAfrique sub-saharienne est le moustique Anopheles gambiae sensus stricto (s.s.) qui comprend en ralit cinq formes gographiques distinctes et isoles gntiquement (identifies par des inversions au niveau des chromosomes paracentriques). Il appartient un complexe despces -autrefois indiffrencies- lui aussi
44

appel Anopheles gambiae, constitu dAnopheles arabiensis, dAnopheles quadriannulatus A et B, dAnopheles melas, dAnopheles merus et dAnopheles bwambae. Les espces appartenant ce complexe sont morphologiquement indiscernables mais prsentent des caractristiques gntiques et co-thologiques qui leur sont propres et qui se refltent dans leurs capacits transmettre ou non le paludisme. De plus, ces espces prsentent un isolement reproductif trs marqu. On distingue galement des diffrences concernant leur spcialisation alimentaire : certains comme Anopheles gambiae se concentrent presque exclusivement sur les humains tandis que dautres comme Anopheles quadriannulatus sont plutt infods aux animaux. Au niveau spcifique, une forte diffrenciation gntique entre certaines populations est galement observable, par exemple entre les populations dAnopheles arabiensis du Sngal et celles des les de lOcan Indien (Manguin et al., 1999 ; Budiansky, 2002). De mme Anopheles funestus s.s., un autre vecteur majeur en Afrique, appartient un groupe nomm Anopheles funestus. Ce groupe est structur comme suit : quatre espces apparentes (Anopheles brucei, Anopheles confusus, Anopheles fuscivenosus et Anopheles. rivulorum) et un sous-groupe comprenant lui-mme quatre espces (Anopheles aruni, Anophele funestus, Anopheles parensis et Anopheles vaneedeni) (Manguin et al., 1999 ; Budiansky, 2002). Au contraire, Anopheles darlingi, un vecteur important en Amrique latine, possde une grande variabilit morphologique et biologique et son aire de rpartition est trs vaste mais ne reprsente nanmoins quune seule espce et non un complexe. Il nexiste pas disolement gntique entre les diffrentes populations malgr un isolement gographique. En effet, sa rpartition stend de la Colombie au nord-est de lArgentine et au sud du Mexique, du Belize, du Guatemala au Honduras et au Salvador mais il na cependant jamais t chantillonn du Nicaragua au Panama (Manguin et al., 1999).

Des tudes ont montr que les populations, comme les espces (cf. tableau 2), dAnophles prsentent une forte variabilit gntique. Aujourdhui, les flux de gnes entre deux formes molculaires d Anopheles gambiae s.s. se restreignent montrant ainsi un processus de spciation en direct. Il existe deux formes nommes M et S. Des diffrences dordre molculaire entre les deux formes ont t montres. Par exemple, deux loci microsatellites proche du centromre du chromosome X prsentent des diffrences significatives entre les formes M et S au Mali. De plus, lanalyse de
45

la squence de lintron I (en amont de la mutation kdr) a rvl que les formes en Afrique de louest diffrent constamment ce niveau dun nuclotide (Torre et al., 2002). Par suite, des barrires reproductives se mettent en place entre les deux formes. Elles semblent tre pour le moment dordre comportemental et gographique. La forme S est localise en Afrique tropicale et se reproduit dans des mares dpendantes des pluies tandis que la forme M se trouve uniquement en Afrique de louest et se reproduit prfrentiellement dans les sources deau anthropiques comme, par exemple, les canaux dirrigation. Par consquent, la forme M tire avantage des installations humaines et allonge ainsi son cycle de reproduction. La forme M a donc colonis une niche cologique relativement rcente, cre par des phnomnes danthropisation du milieu, lui permettant ainsi dviter la comptition intraspcifique. Dans ce cas, lHomme est directement responsable de la spciation et, indirectement, de lextension de la priode de transmission du paludisme au-del de la saison des pluies (Budiansky, 2002 ; Torre et al., 2002). Localit
Ethiopie Afrique Iles de lOcan Indien Asie du sud-est Asie Amrique latine Amrique centrale Etat du Chiapas, Mexique Belize Amrique

Espce
An. quadriannulatus A et B (endmique) An. gambiae s.s., An. arabiensis (vecteurs principaux), An. funestus An. arabiensis An. minimus, An. dirus (vecteurs principaux) An. stephensi, An. farauti, An. sinensis, An. tellessarus, et An. minimus An. pseudopunctipennis, An. darlingi An. darlingi An. albimanus An. darlingi, An. albimanus, An. pseudopunctipennis An. albimanus, An. quadrimaculatus, An. darlingi et An. free-borni

Tableau 2: Rpartition des Anophles dans le monde (Manguin et al., 1999 ; Fleury, 2003)

46

EXPLORATION DU POLYMORPHISME GENETIQUE DES PARTENAIRES DE CETTE TRIADE AVANT LE PROJET DE SEQUENCAGE

47

I. Plasmodium
1. Gnralits Les parasites qui prolifrent dans des niches cologiques restreintes comme l'espce Plasmodium, varient au niveau de leur surface de contact avec l'hte par ncessit, dans le but de coloniser, se diviser et se transmettre. Les parasites Plasmodium vont dans la circulation sanguine o ils infectent les rythrocytes pour grandir et se diviser. Tout le long de leur cycle asexu, except une petite priode extracellulaire, ils se dveloppent dans les rythrocytes o ils sont protgs de la plupart des mcanismes du systme immunitaire. Alors le parasite exporte des polypeptides la surface de l'rythrocyte, leur Tallon d'Achille, stimulant la production d'anticorps spcifiques qui se lient l'rythrocyte infect. 2. Les antignes de surface du sporozote Le sporozote correspond au stade dinfection de Plasmodium falciparum, prsent dans les glandes salivaires du moustique qui transmet le paludisme : Anopheles gambiae. Moins de 100 sporozotes sont suffisants pour infecter un hte potentiel, et il semble vident que le Plasmodium sest rendu matre dans lart de pntrer les hpatocytes, qui sont les seules cellules o lon trouve des sporozotes chez lhomme. Contrairement aux autres parasites qui sentourent dune membrane vacuolaire pour pntrer les cellules, le sporozote cr une brche dans la membrane plasmidique de lhpatocyte avant de la rparer rapidement. En fait, les sporozotes traversent le cytosol de nombreuses cellules avant denvahir lhpatocyte et de former une vacuole spcifique, appele vacuole parasitaire, o ils vont pouvoir se dvelopper et se rpliquer vers le stade suivant. Il est possible que les sporozotes aient besoin de traverser toutes ces cellules pour activer un mcanisme de pntration, ou bien pour trouver la meilleure cellule cible possible, afin de mieux sy dvelopper (Mota et al., 2001). La capacit quont les sporozotes de Plasmodium envahir des cellules (quelles soient chez le moustique ou chez lhomme) repose sur leur proprit de "glisse" sur les substrats solides, confre par la protine transmembranaire TRAP (cf. fig. 1). Les scientifiques ont russi prouver que des mutations sur des zones adhsives de cette protine diminuaient considrablement le taux dinfection des cellules htes par le sporozote,

48

mais naffectait pas la proprit de glisse nonce plus haut (Matuschewski et al., 2002). Ces modules adhsifs de la protine TRAP ne sont donc pas impliqus dans la motilit du sporozote mais dans le mcanisme dinfection, o ils interagissent directement avec les protines de surface de la cellule cible.

Fig. 1 : invasion dune cellule par un sporozote Les sporozotes matures possdent sur leur membrane des protines bien spcifiques, appeles circumsporozotes, ou protines CS (Nussenzweig et al., 1985). Ces polypeptides sont impliqus notamment dans les interactions initiales entre le sporozote et la membrane hpatocytaire. Ces protines ne sont prsentes qu ce stade du dveloppement et on ne les trouve pas lors des stades de dveloppement dans le sang. Cette protine est constitue de 412 acides amins, prsente des proprits immunologique considrable, et possde un pitope immunodominant dans 3 rgions de la molcule. Les protines CS de toutes les espces de Plasmodium possdent une squence signal spcifique lextrmit N et une squence hydrophobe en position C-terminal. Les scientifiques ont squenc le gne codant pour cette protine : il ne possde aucun intron et nest prsent quen un exemplaire dans le gnome. Dun point de vue structural, le gne est constitu de squences rptes en son centre, du type NANP (Asparagine-AlanineAsparagine-Proline), prsentes en 37 exemplaires, et du type NVDP (Asparagine-Valine-Acide Aspartique-Proline), en 4 exemplaires. On retrouve les pitopes immunodominants lintrieur de 3 de ces squences (cf. fig. 2). On peut noter la prsence importante de ce motif (106 exemplaires) sur toute la surface du sporozote. Cest dailleurs sur cette zone (NANP)3 que la rponse immunitaire naturelle agit, dans les zones endmiques, de mme que de nombreux mdicaments et vaccins potentiels.

49

Fig. 2 : Structure de la protine CS chez Plasmodium Les squences rptes sont soumises des pressions volutives plus importantes que le reste du gne, cause de la rponse immunitaire des htes parasits. Pour contrer cela, Plasmodium falciparum change rapidement ces squences rptes, pour se rendre moins facilement dtectable par les systmes immunitaires (Nussenzweig et al., 1985). Un vaccin visant les sporozotes aiderait le systme immunitaire de lhomme se dbarrasser du parasite inject par le moustique et ainsi empcherait le cycle du Plasmodium de se terminer, limitant par la mme occasion le dveloppement des syndromes du paludisme. 3. Invasion sous forme mrozote et les protines associes L'invasion des rythrocytes par la forme mrozote de Plasmodium falciparum est l'un des processus majeurs aboutissant la pathognicit. Les rythrocytes humains dmontrent une remarquable diversit par rapport aux molcules de surface qu'ils expriment. Pour Plasmodium falciparum, le point critique du succs de l'invasion est la flexibilit du parasite pour s'attacher et envahir les rythrocytes. En effet, il a t observ (Cowman et al., 2002) que Plasmodium falciparum est capable d'envahir des rythrocytes qui sont antigniquement diffrents, en utilisant des voies alternatives qui impliquent des rcepteurs distincts. Aprs l'attachement sa cible, le mrozote se positionne pour entrer dans l'rythrocyte. Les protines de la surface du mrozote, ainsi que les organelles associes a l'extrmit apicale, sont considr comme vitales pour l'invasion dans l'rythrocyte.

50

Le processus d'immunit de l'hte enclenche la formation d'anticorps directement dirigs contre les protines de surface et qui doivent bloquer l'invasion (cf. fig. 3)(Cowman et al., 2002). Ces protines de surface du mrozote, appeles Merozoite Surface Proteins (MSPs) possdent une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) attache une queue COOH-terminale (Cowman et al., 2002). Sur les cinq MSPs pralablement identifies et possdant cette ancre GPI, quatre ont un ou deux domaines ressemblant au COOH terminal des Epidermal Growth Factors (EGF). Ces domaines EGF-like sont particulirement importants car ils pourraient avoir un rle dans les interactions protines/protines (par analogie avec d'autres domaines EGF-like) et parce qu'ils sont clairement la cible des rponses immunitaires de l'hte. Celles-ci mettent probablement en jeu des anticorps inhibiteurs d'invasion (Black et al., 2001). De multiples protines sont probablement impliques dans ces liaisons hte-envahisseur. En effet, il a t dcouvert que la molcule MSP-1 est une partie dun complexe non covalent contenant deux autres molcules : MSP-6 et MSP-7 dont les gnes rsident dans des clusters. A ct des gnes codant pour MSP-3 et MSP-6, sur le chromosome 10, il a t dcouvert un gne codant pour un protine riche en acide glutamique (GLURP)(Borre et al.,1991) et l'antigne S (Cowman et al., 1985). Autour de ces gnes, il existe d'autres clusters dont on peut penser qu'ils sont impliqus dans des fonctions similaires.

Fig. 3 : Modle dinvasion des rythrocytes par les merozoites

51

A. Variants PfEMP1 Les nouveaux variants apparaissant dans les infections chroniques de malaria sont toujours distincts, au niveau de leurs antignes, de ceux des parents. Une petite proportion de Plasmodium falciparum change les polypeptides de surface chaque nouvelle vague denvahissement de lhte, dans le but de permettre l'expansion de nouveaux variants quand les premiers parasites sont reconnus et slectionns par le systme immunitaire. Cette rponse srologique variante de l'hte reflte un lment fondamental du parasitisme : la variation antignique (Roberts et al., 1992). B.Molcules PfEMP1 Les rythrocytes humains infects par Plasmodium falciparum acquirent des proprits adhsives qui sont un important facteur de la pathognicit de la malaria. Ces modifications entranent l'adhsion de ces derniers aux capillaires. La squestration des rythrocytes infects au niveau d'organes importants serait corrle avec le dveloppement de syndromes importants de la malaria. Ladhrence de ces cellules se fait par une famille de protines : Plasmodium falciparum rythrocyte membrane protein 1, PfEMP1 ayant un poids molculaire de 200000 350000 Mr (cf. fig. 4). Ces protines PfEMP1 sont hautement polymorphes, variant au niveau de leur antignicit et exprimes la surface de l'rythrocyte (Baruch et al., 1995).

Fig. 4 : Structure de PfEMP1 C. Structure du gne var Ces variants sont cods par une famille de gnes : var. Cette famille de gnes est estime contenir 50 150 membres, disperss sur tous les chromosomes. Les rarrangements gntiques frquents chez les gnes var sont supposs tre responsables des variations de l'ADN

52

dans les diffrentes lignes de parasites. Il a t montr chez les singes Saimiri, que les rythrocytes infects in vivo par Plasmodium falciparum, et les rythrocytes humains infects in vitro modifient spontanment leurs formes antigniques et leurs modalits dadhrence. Ces changements sont accompagns de modifications des gnes var (Roberts et al., 1992). Malgr leur diversit, les gnes var prsentent des structures communes. La rgion codante est compose de deux exons dans lesquels sont conservs spatiallement des motifs de squences. Le premier exon code pour deux quatre domaines DBL ( Duffy Binding Like), et le second exon code pour un segment terminal cytoplasmique charg ngativement et conserv chez les gnes var. Un gne var fait 10 12 kb ce qui veut donc dire quenviron 6% du gnome contiendrait des informations pour ces gnes. Le screening de banques de YAC via des sondes reconnaissant lexon II, conserv, a permis la dtection des gnes var dans les rgions subtlomriques de la plupart des chromosomes de Plasmodium falciparum. Ces gnes subtlomriques sont exprims ; en effet, la transcription se fait au stade prcoce du cycle intra rythrocytaire mais lapparition du produit du gne se fait avec un dlai, au stade trophozote et schizonte. Lexpression des gnes var est contrle diffrentiellement. De plus, un seul rythrocyte infect nexprime quun ou quelques variants du gne var. Cependant, dans une population de parasites, diffrents variants du gne sont exprims. La plupart des gnes sont localiss en rgion subtlomriques, rgion hautement recombinante. Ils sont tous en simple copie et situs juste ct de la squence rpte tlomrique rep20, dans les deux orientations possibles. Lorganisation gnomique commune des gnes var exprims suggre quelle joue un rle important dans la variation des phnotypes adhsifs et antigniques (Hernandez-Rivas et al., 1997 ; Fisher et al., 1997 ; Su et al., 1995). D. Liaison avec ICAM-1 Les rythrocytes se lient donc aux capillaires. Certains rcepteurs de lhte se lient aux protines du parasite, dont CD36 (Barnwell et al., 1989) et la molcule ICAM1 (Berendt et al., 1989). Des analyses histologiques post mortem dindividus morts de malaria crbrale ont montr une implication importante de la molcule ICAM-1 (Newbold et al., 1997). Deux domaines distincts ont t identifis chez PfEMP1 : le domaine DBL (Duffy Binding Like) et la rgion riche en cystine CIDR (cysteine-rich interdomain region) qui se lie au CD36. Le domaine DBL se lie diffremment selon la squence primaire. Les molcules PfEMP1 contiennent entre deux et sept domaines DBL et un ou deux domaines CIDR. Il existe cinq groupes de domaines DBL : , , , et . Le domaine amino-terminal est toujours un
53

DBL de type :DBL1. Le domaine DBL1 est toujours suivi par un domaine CIDR1 et cet arrangement de domaines en tandem a t propos pour former la structure conserve des molcules PfEMP1. En revanche, partir du second domaine DBL, lordre et le nombre de domaines DBL nest pas conserv entre les PfEMP1(cf. fig.5)(Smith et al, 2000).

Fig. 5 : Organisation des diffrents domaines DBL et CIDR de PfEMP1 La liaison PfEMP1/ICAM-1 a t confirme : un complexe de domaines DBL et C2 est requis pour la liaison avec ICAM-1. Les protines recombinantes ne contenant que DBL ou C2 ne se lient pas ICAM-1 (Smith et al., 2000). 4 La rsistance la chloroquine chez Plasmodium falciparum A. La CQR La chloroquine (cf. fig. ci-contre) a t pendant des dizaines dannes le moyen de lutte le plus efficace pour enrayer le nombre de morts dus au paludisme. Ses avantages taient multiples : ctait un mdicament efficace, facile administrer, les effets secondaires taient limits et le cot de fabrication demeurait raisonnable.

54

La rsistance la chloroquine (CQR pour ChloroQuine Resistance) est apparue pour la premire fois en Asie du Sud-Est, dans les annes 1950, prs de la frontire thalandaise (Harinasuta et al., 1962). Depuis, elle sest repartie dans presque toutes les zones o le paludisme est prsent (elle a atteint le continent africain en 1970), et pose aujourdhui un rel problme dans la lutte contre cette maladie, notamment dans le traitement des enfants. B. Les gnes impliqus Sur les quatre espces de parasites vecteurs de la malaria, seul Plasmodium ovale ne prsente pas, pour le moment, de CQR (Wellems, 2002). Pour mieux comprendre le mcanisme de cette rsistance, les scientifiques ont crois des souches de Plasmodium dIndochine prsentant une CQR avec des souches du Honduras sensibles la chloroquine (Rosario, 1976 ; Padua , 1981) : ils ont pu dmontrer que la CQR tait due des mutations impliquant diffrents gnes, car certains croisements donnaient des souches prsentant une CQR intermdiaire (cf. fig. 6) Rcemment, le gne PfCRT a t identifi comme tant un gne fortement impliqu dans cette CQR. Ce gne code pour une protine contenant 10 domaines transmenbranaires (Fidock et al., 2000), et qui est localise sur la membrane de la vacuole digestive, que lon sait essentielle au mcanisme dinfection. Grce au clonage positionnel, PfCRT a pu tre localis sur le chromosome 7 ; il mesure 36 kb pour un total de 13 exons. De manire gnrale, on trouve 7 ou 8 points de mutations sur ce gne quand on compare les allles dits sensibles et les allles rsistants. Mais il semblerait que certaines aient plus dinfluence que dautres. Ainsi, la mutation K76T, qui correspond une simple substitution Lys76 Thr semble trs implique dans la CQR, tout comme la mutation A220S (Ala220 Ser). Quand on croise des souches rsistantes avec un panel des souches sensibles du monde entier, on a pu observer que les allles PfCRT-mutants confraient un phnotype CQR aux souches testes (Bir Singh Sidhu et al., 2002). Quand PfCRT est sous sa forme mute, il cre des changements physiologiques importants comme la modification du gradient des ion H+, donc du pH. Dans la vacuole digestive, qui est le site daction de la plupart des mdicaments anti-paludiques. De mme, il semble altrer la sensibilit aux autres mdicaments anti-paludiques (comme la quinine, la mfloquine, lartemisine) par des effets directs (impliquant des interactions mdicaments-protines) et des effets indirects sur les processus physiologiques de Plasmodium, influenant ainsi laccumulation du mdicament et la

55

formation du complexe avec lhme (Bir Singh Sidhu et al., 2002). Cependant, il faut noter que la mutation du gne PfCRT associe la CQR nest pas prsente chez Plasmodium vivax, alors que ce dernier peut prsenter une certaine rsistance la chloroquine (Wellems, 2002).

Fig 6 : Dynamique de la rsistance la chloroquine Il est probable que les mutations du gne PfCRT affecte lefficacit du mdicament en altrant son passage au travers de la membrane de la vacuole digestive. De mme, ces mutations semblent responsables de la perte defficacit du verapamil, utilis pour contrer la rsistance la chloroquine, en agissant au niveau de lhme. Une connaissance plus prcise de la squence des gnes (et de leur structure) permettraient sans aucun doute de mieux comprendre le rle prcis des mutations ponctuelles sur PfCRT dans la rponse aux mdicaments. Cette forte interaction entre la CQR et le gne PfCRT a permis de mettre au point de nouveaux mdicaments exprimentaux comme lamodiaquine, un analogue de la chloroquine, qui savre relativement efficace sur les souches prsentant un niveau lev de CQR (Olliaro et al., 1996). Le problme est cependant que les souches de Plasmodium sont assez difficiles manipuler in vitro : elles ncessitent une tude pralable de leur gnome et du dsquilibre de liaison pour comprendre les loci slectionns sous la pression des mdicaments.

56

Les scientifiques ont dcouvert dautres gnes importants, comme pfmdr1, qui code pour une glycoprotine-P, localise elle aussi dans la vacuole digestive (Foote et al., 1989). Si ce gne subit 3 mutations prcises (dsignes 1034C, 1042D et 1246Y), la sensibilit la chloroquine diminue de prs de 50% (Reed et al., 2000). Chose importante, la mutation 1042D est assez courante dans les souches sud-amricaines de Plasmodium mais nul part ailleurs (Su et al., 1997). On voit bien l toute la complexit didentifier des gnes universellement impliqus dans la rsistance aux mdicaments. Il apparat donc essentiel de mieux connatre galement lhistoire phylogntique de Plasmodium. Ds lors que la rsistance la chloroquine est apparue, les scientifiques ont utilis un mdicament de remplacement : la sulfadoxine-pyrimethamine (SP). L encore, une rsistance est apparue mais en 4 fois moins de temps que pour la chloroquine. Plusieurs explications cela : seules 4 mutations du gne cible dhfr sont ncessaires pour obtenir une rsistance, contre 8 ou 9 pour la chloroquine. Ensuite, la SP reste plus longtemps dans les sujets traits, ce qui augmente les pressions de slection lies la rsistance. Enfin, la CQR pourrait tre lie dautres gnes que Pfcrt (Hastings et al., 2002). Grce toutes ces donnes, lOMS a pu mieux informer et a rapidement conseill les populations des traitements conciliant plusieurs antipaludiques, afin de limiter les rsistances dveloppes par Plasmodium. 5. Le gne Pf11-1 : son rle dans la rupture des GR et dans lmergence des gamtes Lune des priorits du parasite est de se dvelopper afin de se multiplier le plus rapidement possible dans son hte. Pour cela, il lui faut sextraire des rythrocytes quil a infects pour librer le plus de gamtes possible. Cette phase du cycle de vie de Plasmodium est trs tudie par les scientifiques qui y voient un ventuel point faible quils pourraient utiliser des fins thrapeutiques. Ils ont ainsi russi identifier un gne responsable de lclatement du globule rouge et de lmergence des gamtes dans lhte. Ce gne, nomm Pf11-1 code pour une protine spcifique du gamtocyte. Il mesure 30 kb et permet la synthse dun polypeptide riche en acide glutamique. Il a pu tre isol sur des souches mutantes, de la mme manire que pour identifier PfCRT. La protine correspondante a pu tre localise au microscope lectronique balayage dans les granules du cytoplasme des gamtocytes, prs de la vacuole digestive. In vitro, on a pu la suivre sur la
57

membrane lse des globules rouges, dmontrant ainsi son rle essentiel dans la rupture de ces derniers . 6. Variation alllique des dterminants antigniques Le gnome de Plasmodium falciparum est caractris par un haut niveau de polymorphisme des dterminants antigniques, comme par exemple pour les gnes qui encodent les protines de surface du mrozote (Msa1 et 2) et du sporozote (Csp). La protine Msa1, par exemple, est code par un gne de 1018 codons, et comprend 2 familles (MAD20 et Wellcome). Elles ont diverg il y a environ 35 millions dannes (daprs les alignement de squence) : cependant, on trouve un taux de substitutions homologues quasi nul, qui irait plutt dans le sens dune origine commune beaucoup plus rcente. Grce ltude du polymorphisme alllique de ces gnes, les scientifiques ont pu mieux comprendre la variabilit importante de ces dterminants, directement lie la forte slection de la rponse immunitaire de lhomme. Ainsi, il semblerait que le fort taux de bases A et T (82%) du gnome du Plasmodium falciparum (Volkman, 2002) diminuerait le nombre de substitutions homologues, qui sont neutres. Cependant cette hypothse doit tre confirme car chez dautres espces de Plasmodium avec des gnomes aussi riches en A-T, ce nest pas forcment le cas (Rich et al., 1998).

II. Anopheles
1. La rponse immunitaire de A. gambiae au contact de P. falciparum Plasmodium falciparum, le parasite responsable du paludisme, est essentiellement transmis lhomme grce au transport du moustique Anopheles gambiae. De nombreuses mesures ont t prises pour tenter de contenir cette maladie et il apparat aujourdhui indispensable de bien connatre la mcanisme dinteraction entre le Plasmodium et lAnophle. Linfection par Plasmodium a des effets physiologiques et comportementaux sur le moustique, comme une hausse de la mortalit, une fcondit plus faible et une modification du comportement alimentaire de la femelle. En revanche, Plasmodium falciparum subit de fortes pertes deux niveaux diffrents : quand les gamtocytes se transforment en oocintes et quand les sporozotes envahissent les glandes salivaires. La progression du dveloppement du parasite

58

dans le moustique peut tre suivie par le taux de transcription des protines de surface de Plasmodium, les protines du circumsporozote (CS) et les thrombospondin-related adhesion proteins (TRAP) qui sont synthtises aprs que les parasite ait atteint les glandes salivaires de son hte. Les scientifiques se sont donc concentrs sur la rponse immunitaire du moustique qui semble tre mise en cause dans ces pertes. Il semble probable que de nombreux gnes soient impliqus dans cette raction, et quils sactivent transcriptionellement aprs une infection (Dimopoulos et al., 1997 ; Richman et al., 1997 ; Oduol et al., 2000). Les gnes impliqus et connus lheure actuelle sont au nombre de 9 : - 3 (GNBP : 1,3-glucan-binding protein, IGALE20, ICHIT) appartiennent au motif de reconnaissance du rcepteur (Janeway, 1989) - 2 gnes (ISPL5 et Sp22D) codent pour des srines protases probablement impliques dans des ractions en cascade - 2 autres gnes (SpilA et AglMcr14) codent pour un inhibiteur des srines protases - les 2 derniers sont la defensin qui code pour un peptide anti-microbien et NOS (nitric oxyde synthase) qui un rle de barrire dans linfection. Parmi ces 9 gnes, 3 (NOS, defensin et GNBP) semblent avoir une importance considrable dans la rponse immunitaire du moustique durant le dveloppement du stade sporozote de Plasmodium falciparum (Tahar et al., 2002). Il est bon de noter quon ne retrouve pas les mmes gnes impliqus quand Anopheles est infect par dautres espces de Plasmodium. Grce la technique de la PCR en temps rel, les scientifiques ont pu suivre lvolution au cours de linfection de lactivit de ces 3 gnes. Le gne defensin, dont lactivit se trouve augmente aprs infection dans les corps gras (source importante de rponse immunitaire chez les insectes), pourrait tre impliqu dans la reconnaissance des gamtocytes dans le sang. De mme, lactivit du gne GNBP augmente dans cette mme zone, o il pourrait jouer un rle dans la synthse de motifs dadhsion aux substances du parasite, et dans le remodelage des tissus au cours de son dveloppement (Dimopoulos et al., 1996). NOS serait plus en relation avec les stades sporogoniques qui seraient capables de limiter son activit dans lintestin moyen du moustique. Connatre et comprendre les rponses de ces gnes la suite dune infection par Plasmodium falciparum sont essentielles afin de mieux apprcier la comptence vectorielle du moustique et ainsi mieux lutter contre le flau de la malaria (Dimopoulos et al., 1998).

59

Les scientifiques ont galement recherch des QTLs (Quantitative Trait Loci) qui pourraient tre impliqus dans lencapsulation des parasites par le moustique, en tant que raction de dfense. LAnopheles, en effet, a la capacit de tuer le parasite dans son intestin moyen en lentourant dune capsule riche en mlanine. Ainsi, les biologistes ont pu dtecter 2 QTL majeurs (Pen1 et Pen3, localiss sur le chromosome 2) et un QTL mineur (Pen2, localis sur le chromosome 3) (cf. fig. 7).

Fig. 7 : Les 3 QTLs (marqus ) impliqus dans lencapsulation du parasite par le moustique Ces gnes seraient corrls avec la rponse du moustique due la prsence du parasite dans son intestin moyen, qui provoquerait la scrtion de ces capsules de mlanines (Zheng et al., 1997). La comprhension de tels mcanismes au niveau gntique pourrait permettre de trouver de nouveaux moyens de lutte. 2. La rsistance dAnopheles gambiae aux insecticides Lintroduction du DDT pour contrler le moustique vecteur du paludisme, et lradication de la maladie dans certaines zones ont provoqu larrt de la campagne de la lutte
60

par lOMS dans les annes 1960. Quelques temps plus tard, la notion dradication fut dlaisse au profit de lide dun contrle de la malaria, principalement cause de la nouvelle rsistance des moustiques aux insecticides du type DDT. Il est relativement ais pour les scientifiques de dtecter les phnotypes rsistants chez ces insectes, quand ils survivent une dose dinsecticide qui, dans les conditions normales, auraient du les tuer. Cependant, on ne connat pas bien lheure actuelle les mcanismes molculaires directement responsables de cette rsistance aux insecticides, qui savre tre un norme problme dans la lutte contre la maladie. En effet, toute la rgulation molculaire de cette rsistance est mal comprise, car Anopheles gambiae prsente de multiples types de rsistance au DDT et aux pyrthrodes, selon les rgions du globe o le paludisme svit (Hemingway et al., 2002). Les biologistes ont fait ainsi des analyses du gnome du moustique, notamment sur 3 familles de supergnes - carboxylesterases, glutathiones transfrases et cytochromes P450 - , qui semblent responsables de la rsistance mtabolique aux insecticides. Par exemple, les chercheurs ont pu dcouvrir grce une analyse de QTLs quune rgion du chromosome polytne dAnopheles gambiae portait le rgulateur de lexpression du gne codant pour P450. De mme, grce cette cartographie de QTLs, on peut dfinir les gnes de rgulations qui contrlent lexpression des glutathiones transfrases. Cependant, ils ne savent pas encore si tous les membres de ces familles de gnes sont impliqus dans la rsistance (Ranson et al., 2002). La rsistance aux insecticides peut galement rsulter de changements dans les molcules en interaction directe avec le DDT par exemple. Ainsi, des mutations dans les canaux Na+, o agissent les insecticides les plus utiliss, et dans les actylcholinesterases, peuvent considrablement influencer la rsistance du moustique aux traitements. Mieux comprendre ces mcanismes au niveau gntique permettra srement une lutte plus efficace contre la maladie. Enfin, lheure actuelle, les scientifiques utilisent de plus en plus la technique des puces ADN et la biologie molculaire pour dfinir les mcanismes qui permettent Anopheles gambiae de rsister linfection par le Plasmodium falciparum (Hemingway et al., 2002).

61

SEQUENCAGE DU PLASMODIUM ET DANOPHELE

62

I. Gnralits sur le squenage de lADN

1. Dfinition Le squenage consiste dterminer la succession de nuclotides dADN, de prciser lordre des bases azotes et de donner des informations sur les gnes (Le maxidico, ditions de la connaissance, 1996). 2. Principe de base du squenage Le principe utilis repose sur la mthode de Sanger qui consiste synthtiser toutes les copies partielles intermdiaires possibles de la molcule dADN. Cette synthse est ralise laide dun compos chimique fluorescent qui provoque linterruption au hasard, mais systmatique de cette synthse la suite de lun des 4 nuclotides A, T, G ou C. On fait donc en parallle 4 sries de copies. Dans chaque srie, toutes les copies sont interrompues derrire un seul type de nuclotide. La dernire tape consiste sparer les copies selon leur taille par une migration lctrophortique sur gel poreux. Ces gels permettent de sparer deux intermdiaires conscutifs qui ont une diffrence de taille dun seul nuclotide. Il devient alors facile de reconstituer la succession de nuclotides tout au long de la squence(cf. fig. 1).

63

Fig. 1 : METHODE DE SANGER (Bernot, 2001)

64

3. Le squenage grande chelle : 1re approche La reconnaissance de lADN comme support de linformation gntique a donn naissance de nombreux projets de squenage total de gnomes. Le but est de connatre lenchanement complet des bases nuclotidiques de la molcule dADN dun organisme ce qui thoriquement donne accs toute linformation ncessaire la vie. Un tel rve est longtemps rest inaccessible pour des raisons technologiques et financires. Ce nest que rcemment, avec la mise en place des programmes Gnome, que des gnomes entiers ont pu tre totalement dcrypts. Le but de ces programmes est de pouvoir identifier les gnes, de les localiser dans le gnome et surtout de connatre leur fonction (gnomique fonctionnelle). 4. Historique du squenage Le programme Genome humain est n en 1990 sous la tutelle du DOE (Department of Energy) et du NIH (National Institutes of Health). Il dfinissait, dans un plan de 5 ans, les objectifs atteindre dont les principaux taient dtablir des cartes gntiques et physiques prcises du gnome humain, damliorer les performances du squenage automatique, de squencer le gnome despces modles afin dvaluer les difficults de cette opration et de mettre au point les outils informatiques permettant de traiter, archiver et communiquer lensemble des donnes ainsi produites. En 1993, un nouveau plan de 5 ans est redfini, afin daffiner les buts atteindre en fonction des ralisations dj accomplies et un nouvel objectif voit le jour : identifier le plus grand nombre de gnes possible. Lincorporation de cet objectif supplmentaire tait due aux succs remports par les programmes de squenage intensif dADN complmentaire (ADNc), et la ncessit de les localiser sur le gnome dans une perspective de clonage positionnel (localisation de gnes responsables de maladies gntiques). Ce genre de programme Gnome sest par la suite multipli dans de nombreux pays et principalement en Angleterre, au Japon, en France, en Allemagne et en Chine. Les ambitions des diffrents programmes sont variables car laspect financier reste le moteur de ce genre dentreprise. Ces programmes Gnome ont galement amplifi la concurrence entre le secteur public, qui a ainsi multipli les grands centres de recherche (Genoscope, Centre dtude du polymorphisme humain ou CEPH, Gnthon par exemple en France, Sanger Center aux USA),
65

et le secteur priv (en particulier les firmes pharmaceutiques) attir par les allchantes retombes financires promises par ces recherches. Ils ont donc dbloqu des moyens considrables pour crer des centres de recherches trs comptitifs (TIGR, Celera ou Incyte). Ces centres de recherche ont reu la dnomination de Genome Center. A. Loutil technologique : une rvolution pour les programmes Gnome Le squenage grande chelle naurait jamais vu le jour sans le dveloppement incroyable des techniques dinformatique et de robotique de ces dernires annes. Linformatique joue un rle essentiel dans les recherches sur les gnomes car ces dernires fournissent une grande quantit dinformations trs complexes. Loutil informatique entre en jeu lors de lacquisition automatique des donnes, de leur exploitation, de leur archivage et de leur distribution. La bioinformatique permet aux grands centres de recherches de mettre les rsultats obtenus la disposition de toute la communaut scientifique par lintermdiaire dun serveur qui peut ainsi accder facilement et rapidement une base de donnes. Les taches rptitives de la technique du squenage intensif ont engendr la mise au point de robots et de machines toujours plus puissantes et plus rapides. Au dbut des programmes Gnome, lessentiel de la squence tait obtenue manuellement. Mais au fil du temps et des avances de la robotique, les squenceurs automatiques et les robots ont remplac de plus en plus ltre humain reprsentant un gain de temps considrable. Les squenceurs automatiques ralisent deux oprations : la lecture de la squence et son assemblage. En effet, ceux-ci sont quips dun systme optique qui balaye le bas du gel dlectrophorse. Le signal obtenu est interprt par un programme informatique qui reconstitue la squence originale du fragment dADN analys. Ainsi, ils peuvent dterminer lenchanement de 500 1 000 nuclotides. Les molcules dADN squencer tant beaucoup trop longues, il est ncessaire de raliser des lectures redondantes quil faut ensuite raccorder les unes aux autres. Lassemblage est la dernire tape et cest ici quintervient la bioinformatique. Pour reconstituer la squence initiale, les lectures doivent en effet tre ordonnes les unes par rapport aux autres par la mise en vidence de recouvrements (extrmits chevauchantes), cest--dire des rgions terminales prsentant un enchanement nuclotidique identique (aux erreurs de squenage prs). Une contig dsigne deux ou plusieurs fragments chevauchants. Par recouvrements successifs de lensemble des contigs, on obtient une squence unique appele squence consensus. Outre des erreurs ponctuelles (dltion ou substitution de
66

base), des erreurs dans lordre des sous-squences restent possibles. Le taux derreurs peut approcher les 1%. De plus, certaines portions de lADN, comme les squences rptes, sont plus dlicates squencer et lobtention dune squence couvrant entirement le gnome est trs coteuse. Cest pour ces raisons que lon qualifie de brouillon (ou Working Draft) certains gnomes en voie dachvement de squenage. Pour citer quelques exemples de cette avance technologique, le Genomatron du Whitehead Institute/Massachussets Institute of Technology (WI/MIT) effectue et analyse simultanment 150 000 PCR et les machines du Gnthon sont capables deffectuer 16 Southern Blot automatiquement. B. Les stratgies Deux stratgies sont apparues comme tant bien adaptes un squenage de grande ampleur. Tout dabord, le gnome peut tre dcoup en rgions, chaque rgion tant alloue un laboratoire qui aura pour tche de la squencer. De multiples laboratoires pourront donc obtenir le mrite davoir pris part au squenage dun organisme. La seconde option consiste squencer le gnome presque entirement dans les Genome Centers o toutes les tapes sont ralises sur une grande chelle de production. La rentabilit est donc optimale et les erreurs susceptibles dtre introduites par une intervention humaine minimises (prcision augmente). Cette stratgie a permis dobtenir la squence complte de gnomes bactriens (TIGR) mais aussi la squence de Drosophila melanogaster (Celera avec laide de lUniversit de Berkeley, de lEurope et du Canada). C. Les nouveaux outils molculaires la base du squenage Construction dune banque de clones Les gnomes des organismes vivants ont des tailles considrables allant dune centaine de millions plusieurs milliards de nuclotides. En raison de cette taille et de la complexit des gnomes, leur tude dbute toujours par la digestion de la molcule dADN par des enzymes de restriction. Les fragments obtenus aprs digestion sont ensuite clons dans des constructions molculaires ou vecteurs de clonage. Un vecteur contient lensemble des squences permettant son maintien et sa sgrgation dans un micro-organisme. Chaque fragment est insr dans un vecteur qui est propag dans une cellule hte afin dtre maintenu et rpliqu. La culture de ces cellules, et la purification ultrieure du vecteur, permettent de produire des quantits quasi67

illimites de fragments dADN clons. Lensemble des cellules reprsente la banque dADN gnomique (cf. fig. 2).

Fig.2 : Construction dune banque dADN (Bernot, 2001) Toutes les banques dADN gnomique constituent un vritable conservatoire de la collection des fragments gnomiques de toutes les espces dont le gnome est squenc ou doit tre squenc. Ces banques facilitent lidentification des fragments clons qui sont plus aisment manipulables quune longue molcule dADN. Ces banques dites de rfrence peuvent ensuite tre dupliques et distribues de nombreux laboratoires, ce qui peut tre trs utile pour le partage du travail de squenage entre plusieurs quipes de chercheurs. Il existe de nombreux vecteurs de clonage comme les plasmides bactriens, les cosmides, les chromosomes artificiels de bactries ou BAC, les chromosomes artificiels drivs du phage P1 ou PAC ou encore les chromosomes artificiels de levure ou YAC. Le choix du vecteur de clonage se fait en fonction du fragment dADN qui sera insr. En effet, chaque vecteur peut recevoir une quantit limite de nuclotides : jusqu 45Kb pour les cosmides, de

68

100 200Kb pour les BAC et environ 1Mb pour les YAC. Pour les programmes Genome impliquant de grands fragments, les YAC (cf. fig. 3) seront les vecteurs de clonage utiliss prfrentiellement (en ce qui concerne les gnomes eucaryotes trs longs). Les YAC prsentent quelques inconvnients : les fragments insrs subissent parfois des rarrangements (insertions, chimrismes, dltions), et ils ne peuvent pas tre considrs comme absolument reprsentatifs de la rgion dont ils drivent.

Fig. 3 : Clonage dans des vecteurs YAC (Bernot, 2001). Les cartes physiques et gntiques Le passage par une carte physique prcise est obligatoire pour le squenage intgral dun gros gnome. En effet, lensemble minimal de fragments assurant la couverture complte du gnome squencer est dtermin partir de cette carte. Dans une carte physique, les distances correspondent des mesures absolues (en paire de bases) matrialisant les distances physiques mesurables le long des chromosomes. La carte physique est lordonnancement de fragments clons chevauchants reconstituant la molcule dADN de dpart. Ltablissement de cette carte physique passe par la construction dune banque dADN reprsentative du gnome comme dcrite auparavant. Une fois la banque

69

forme, il faut ordonner chaque clone. Lordonnancement est complexe car il suppose que chaque clone soit individuellement identifi, que la position par rapport au chromosome dont il drive soit dtermine ( principalement par la technique FISH ou Fluorescent In Situ Hybridization qui consiste marquer le fragment et lhybrider lensemble des chromosomes), ainsi que sa position par rapport aux autres clones de la banque. Lordonnancement des clones en fonction de la taille du gnome tudi Pour les petits gnomes, il est tabli partir de donnes de recouvrement entre clones pris deux deux par ltude de leurs empreintes de restriction, par hybridation ou encore par lutilisation de STS (Sequence-Tagged Site). Ainsi, 2 clones se chevauchant prsenteront des empreintes de restriction proches et une sonde drive de lun des clones shybridera sur lautre (cf. fig. 4). Sur cette figure, on peut voir la carte de restriction de plusieurs individus (A) et leur comparaison sur la base de leur chevauchement (B).

Fig. 4 : Cartographie par empreinte de restriction Le STS est une courte squence reprsente de faon unique dans le gnome et facilement amplifiable par PCR. Il sagit donc dun marqueur de choix pour la cartographie physique. La cartographie par STS consiste faire un criblage de la banque de clones par PCR et didentifier les clones prsentant un mme STS permettant la construction de groupes de

70

chevauchements. Ce systme prsente le gros avantage dtre facilement transposable dun laboratoire lautre puisquil peut tre archiv ou communiqu par moyens informatiques, sous forme damorces oligonuclotidiques qui le dfinissent. Ils permettent duniformiser et dintgrer les rsultats dautres laboratoires. Le STS na pas de fonction biologique en tant que tel mais certains dentre eux correspondent des EST (squences codantes) ou des marqueurs microsatellites ce qui, dans ce dernier cas, permet dintgrer la carte physique la carte gntique. Concernant les grands gnomes, on distingue deux stratgies. - Lapproche chromosome spcifique consiste sparer les chromosomes par lectrophorse et ordonner les clones recouvrant chaque chromosome laide des techniques prsentes ci-dessus. - Lapproche gnome entier na t rendue possible quavec lavnement du systme de clonage en YAC et sa capacit intgrer de longs fragments dADN. Lordonnancement des clones par cette approche est obtenu par 2 voies complmentaires qualifies de top-down et bottom-up. La voie top-down se sert des donnes des cartes de liaison. Ces cartes gntiques sont construites partir de marqueurs correspondant le plus souvent des courts fragments dADN (marqueurs) dfinissant chacun un locus unique. Ces cartes indiquent les positions relatives des marqueurs les uns par rapport aux autres par lanalyse de leur sgrgation au cours des gnrations. Une fois tablies, elles servent de rfrence pour localiser tout autre marqueur ou gne dans le gnome. Les marqueurs ordonns sur ces cartes sont utiliss pour identifier les clones qui les contiennent et qui sont cartographis physiquement. Ces clones sont identifis par criblage de banque. La voie bottom-up utilise des donnes de recouvrement local pouvant tre dtectes par comparaison des profils de restriction, par hybridation rciproque, ou par un contenu commun en marqueur. Ceci permet didentifier des groupes de chevauchements qui dans certains cas peuvent se rejoindre assurant ainsi une couverture croissante du gnome (cf. fig. 5). Ces deux stratgies aboutissent 2 cartes physiques diffrentes : une carte globale et des cartes chromosome-spcifique.

71

Fig. 5 : Construction de cartes physiques : la voie top-down est reprsente par les flches descendantes et la voie bottom-up par les flches ascendantes. Les cercles pleins sont des marqueurs localises sur une carte de liaison (Bernot, 2001) Le squenage La carte physique permet de choisir un ensemble minimal de clones dADN gnomique de grande taille recouvrant la rgion squencer. Chaque clone est ensuite sous-clon en fragments de petite taille dans un nouveau vecteur et un premier ensemble de squences est obtenu sur un chantillon pris au hasard de ces sous-clones (shotgun). Plus le nombre de clones squencs augmente, plus le recouvrement de la rgion stend, mais plus saccrot la redondance. En effet, partir dun certain seuil, il devient plus conomique de combler les lacunes par squenage dirig qui peut tre men par sous-clonage, par marche avec des oligonuclotides spcifiques, PCR ou production de dltions (cf. fig. 6).

Fig. 6 : Squenage dirig ralis pour combler les ventuelles lacunes (Bernot, 2001)

72

Pour squencer une rgion prcise du gnome, on peut envisager la technique de marche sur le chromosome dbutant par la dfinition dun marqueur gntique. Ce marqueur permet la ralisation dun criblage de la banque de clone pour identifier les clones le possdant. Aprs isolement dun clone prsentant un fragment avec la squence du marqueur au dbut de sa squence, on cre une sonde de son extrmit qui servira son tour de marqueur pour cribler la banque (cf. fig. 7).

Fig. 7 : Technique de marche sur le chromosome (Bernot, 2001) Rcapitulation des outils ncessaires dans la technique du Squenage alatoire global La technique Shotgun sequencing comporte plusieurs tapes. La premire phase implique la cration de banques dADN complet de lorganisme comme vu prcdemment. La seconde phase consiste utiliser des machines de squenage vitesse rapide pour squencer des petits fragments chantillonns au hasard dans lensemble du gnome. Enfin, les fragments squencs sont assembls (ordonns) en contigs sur la base de leurs chevauchements par lapplication dalgorithmes mathmatiques sophistiqus. Le squenage spcifique des dernires lacunes est obtenu par PCR, partir de nouvelles banques, ou par squenage direct

73

du gnome. Cette technique ncessite un trs important et trs complexe effort informatique pour lassemblage final des squences. 5. Quelques exemples dorganismes squencs Le squenage de gnome sest dabord orient vers les procaryotes pathognes car la taille du gnome des procaryotes est beaucoup plus faible que celle des eucaryotes. La priorit a essentiellement concern les pathognes de lHomme, puisque la moiti de nos maladies est dorigine bactrienne. Le premier gnome entirement squenc dun tre vivant a t publi en 1995 par le TIGR. Il sagit de Haemophilus influenzae, bactrie responsable des bronchites et des otites chez lHomme. La squence de nombreux autres pathognes ont rapidement t publies par la suite comme des espces du genre Chlamydia, Mycoplasma ou encore Mycobacterium. Les espces eucaryotes modles, cest--dire les organismes prsentant plusieurs caractristiques intressantes du point de vue exprimental, ne sont pas restes des inconnues au plan gntique trs longtemps, puisque le gnome de levure Saccharomyces cerevisiae est le premier avoir t squenc en octobre 1996 . Puis, ce fut au tour dArabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster de nous faire part de leurs secrets. 6. Laprs squenage : lidentification des gnes Le problme crucial de lanalyse de squences gnomiques est lidentification des squences codantes. Chez les procaryotes, cette identification est grandement facilite par la quasi-absence de squences non codantes, et par la possibilit de reconnatre relativement aisment les phases ouvertes de lecture, les promoteurs et les terminaisons des gnes. Deux caractristiques compliquent cette identification chez les eucaryotes que sont le dcoupage en introns et exons, et la prsence de rgions intergniques parfois trs vastes. Lidentification des units transcriptionnelles reste possible grce des outils informatiques capables didentifier un gne sur plusieurs critres : la prsence dune phase ouverte de lecture, de signaux dpissage et la composition en bases. Certains logiciels architecturs en rseau neuronal intgrent ces paramtres afin doptimiser la probabilit de reconnatre un gne. Mais ce type de logiciel est encore loin dtre infaillible et un autre moyen de savoir si une squence est codante est de la comparer aux bases de donnes dADNc. Une similarit entre une squence gnomique et une squence dADNc
74

permet de conclure que cette squence est transcrite. 7. Le Protome Ce terme dsigne lensemble des protines exprimes par une cellule ou un tissu un instant donn. Les intrts de lanalyse du protome par rapport ceux de lanalyse du gnome et du transcriptome sont les suivantes : un mme gnome peut donner naissance beaucoup de protomes diffrents, le niveau dexpression des protines nest pas prdictible partir du niveau dexpression des ARNm et les ARNm peuvent prsenter une grande diversit, en raison de lutilisation de promoteurs distincts ou dpissages alternatifs. De plus, les protines peuvent tre traduites partir de diffrents codons dinitiation et son frquemment modifies aprs traduction. Il est galement difficile de prdire partir dADN ou dADNc, dans quelles conditions un gne est transcrit et traduit cest--dire quel stade de dveloppement et dans quel tissu. La protomique est donc dune premire importance et elle permet de vrifier quune squence prdite comme tant codante est effectivement traduite et prsente parmi les protines de lorganisme. Toutefois, les techniques actuelles ne permettent pas dtudier prcisment les protines. Effectivement on ne possde pas denzymes capables damplifier les protines, les protines faiblement exprimes sont difficilement dtectables. Lanalyse protomique ne permet pas de dtecter des mutations ponctuelles, des dltions mineures et des insertions. La fonction de la protine produite par un gne donn peut tre propose partir de son ventuelle homologie de squence avec un autre gne dont la fonction est connue. Cette approche nest cependant pas totalement fiable et une confirmation exprimentale est raliser. Les interactions protiques peuvent dans une certaine mesure tre prdites en comparant lorganisation du gnome entre diverses espces.

II. Le squenage dAnopheles gambiae et de Plasmodium falciparum

Lapport de nouveaux outils techniques et la multiplication des checs des diffrents traitements mdicaux, a permis le lancement dun programme Genome denvergure, consistant squencer lensemble des gnomes des partenaires de la triade intervenant dans le paludisme soit : Plasmodium falciparum (parasite), le moustique Anopheles gambiae (vecteur) et Homo sapiens.

75

1. Squenage dAnopheles gambiae A. Historique LInitiative Multilatrale de Lutte contre le Paludisme (Multilateral Initiative on Malaria) a t lance dbut 1997 dans le but dintensifier leffort de recherche et dy promouvoir cooprations et coordinations. Ds son lancement, le NIH et lOMS ont augment le financement de la recherche sur le paludisme. A cette poque, la plupart des tudes taient centres sur le parasite lui-mme et/ou sur ses interactions avec lhte humain. Avec le dveloppement des outils molculaires et technologiques appliqus la recherche biomdicale, un rseau international pour le squenage du moustique Anopheles gambiae fut mis en place en avril 2001. Le lancement de ce programme a t dcid dans le but de fournir une masse de nouvelles informations, qui couples celles obtenues par le squenage de Plasmodium falciparum, rendront possible la progression dans la comprhension des interactions hte/parasite et devraient terme permettre de nouvelles approches de prvention et de traitement du paludisme. En effet, les succs les plus nets dans la lutte contre le paludisme ont correspondu au contrle du vecteur et non du parasite. La prise de conscience de cette ralit a conduit de nouvelles recherches sur la biologie du vecteur, avec un accent particulier sur sa biologie molculaire. Ainsi, les tudes gnomiques qui dbutaient cette poque sinscrivaient dans lobjectif gnral du contrle de la transmission de la maladie par ce moustique (Roth, BBMI, Institut Pasteur, http://www.pasteur.fr). B. Intrt du projet gnome Anophle Lidentification des gnes impliqus dans limmunit du moustique vis--vis des parasites du paludisme, dans son attirance pour lHomme, ou encore dans sa rsistance aux insecticides, reste un travail fastidieux par les mthodes gntiques classiques. Une meilleure connaissance de lanophle permettrait de mieux le combattre, mais aussi de prendre pour cible une nouvelle tape du cycle de vie de Plasmodium. Des relations entre les 3 acteurs de la maladie, la plus tudie est linteraction entre Plasmodium et ltre humain infect. Or, cette recherche ne sest pas encore traduite par des avances dcisives dans la mise au point dun vaccin. En revanche, les interactions entre le parasite et linsecte restent peu explores. Leur tude pourrait rvler des voies nouvelles pour inhiber le dveloppement du parasite chez le
76

moustique et sa transmission lHomme. Enfin, les interactions entre le moustique et lHomme comme lattirance du moustique femelle pour ltre humain sont fondes sur des rcepteurs olfactifs et gustatifs pour lesquels il serait intressant de dcouvrir les gnes : cela pourrait permettre la mise au point de nouveaux rpulsifs ou au contraire dattractifs utilisables dans des piges odeurs (http://www.genscope.cns.fr). Le squenage reprsente le moyen le plus rapide pour obtenir les informations ncessaires sur les gnes de lanophle et qui, associes la recherche sur le terrain, devraient aboutir au contrle de la transmission du paludisme. Le but est au final de pouvoir ainsi contrler lexposition humaine aux moustiques anophles, qui simpose comme un des moyens les plus srs pour lutter contre la maladie (http://www.forumlabo.com). C. Les acteurs du rseau international Ce rseau associe lInstitut Pasteur (France), lEuropean Molecular Biology Laboratory (EMBL, Allemagne), lUniversit de Notre-Dame (USA), le Centre National de Squenage (Genoscope, France), Celera Genomics (USA), The Institute for Genomic Research (TIGR, USA), lInstitute of Molecular Biology and Biotechnology (IMBB, Grce), le rseau ONSA (Brsil) et des scientifiques spcialistes du moustique Anophle. Ce rseau est plac sous le patronage du Programme spcial de recherche et de dveloppement concernant les maladies tropicales (TDR, Suisse) gr par le PNUD, la Banque mondiale et lOMS (http://www.pasteur.fr). D. Dbut du squenage : Sequence Tag Connectors et premiers rsultats Le premier travail denvergure sur lanophle a dbut au Gnoscope en 1998 en collaboration avec lunit de biochimie et de biologie molculaire des insectes de lInstitut Pasteur. Le but de ce travail tait de squencer les extrmits de grands fragments dune taille moyenne de 110 Kb de lensemble du gnome de lanophle qui prsente une longueur de 280 Mb. Ces fragments avaient dj t clons dans des BAC par une quipe amricaine dirige par Frank Collins luniversit Notre Dame. La banque dADN obtenue contenait 12 000 clones BAC reprsentant cinq fois le gnome dAnopheles gambiae. Celle-ci fut duplique aux EtatsUnis et en Europe afin que le squenage se fasse plus rapidement. Ainsi, plus de 22 000 lectures dextrmits de BAC ont t effectues en un peu plus dun an soit environ 15 Mb. Avant ce projet, on connaissait peu de chose sur le gnome de ce moustique et seuls 250 Kb de
77

sa squence gnomique taient connus. Ce premier travail donnait un aperu grande chelle du gnome du moustique (http://www.genoscope.cns.fr ; http://www.pasteur.fr). Une raison importante qui a dtermin la mise en route de ce projet de squenage des extrmits dinserts danophle est le petit nombre de marqueurs alors disponibles sur lensemble des trois chromosomes du moustique. Cette pauvret en marqueurs rendait priori difficile ltablissement de larges zones de plasmides contigus ncessaires pour des projets de cartographie grande chelle. Ces squences dextrmits de BAC constituaient galement une ressource pour le squenage du gnome entier. Dsignes dans ce contexte sous le nom de Sequence Tag Connectors ou STC, elles permettent dtablir des connections grande chelle : lorientation respective des deux squences dextrmits dune paire est en effet connue, tout comme la distance qui les spare (taille de linsert dans le BAC). Ces STC constituent une base de donnes qui peut permettre le squenage grande chelle sans passer par le long travail de cration de contigs de clones et de cartographie de ces clones pour pouvoir les squencer. Aprs squenage dun premier clone, il est possible de reprer les clones voisins les moins chevauchants en comparant la squence du premier clone avec celles des extrmits des autres clones de la banque (voir technique de marche sur le chromosome dcrite auparavant). Toutefois, une autre stratgie t adopte par le consortium international pour le squenage total du gnome (http://www.genoscope.cns.fr). E. Premiers rsultats obtenus avec cette premire tude Diverses donns gnomiques furent obtenues grce au travail ralis au Gnoscope. Lannotation des squences lues au hasard dans le gnome a rvl les squences partielles de plus de 1 000 nouveaux gnes. De nombreux lments transposables ont galement t reprs et de nouvelles familles de ces lments ont pu tre dfinies. Plus de 1 000 rgions polymorphes microsatellites constituant de remarquables marqueurs gntiques ont t repertoris. Ces derniers sont utiles pour la recherche de gnes et pour ltude de la diversit des populations naturelles (http://www.genoscope.cns.fr). F. Squenage dAnopheles gambiae

Choix de la souche

78

La souche PEST dAnopheles gambiae a t choisie pour ce projet de squenage car les STC de clones appartenant deux banques dADN de souche PEST taient dj squencs et cartographis physiquement sur les chromosomes. De plus, tous les individus de la colonie ont un arrangement chromosomique standard sans aucun polymorphisme dinversion paracentrique typique des souches sauvages et dautres colonies. Enfin, cette souche danophle a t produite par croisement de moustiques collects en Afrique de lEst et dune souche de laboratoire porteuse dune mutation il rose utile pour dtecter les moustiques contaminants. Le fait de partir dune souche non pure mais dune espce de terrain fortement polymorphe constituait une nouveaut et une difficult (Holt et al., 2002 ; http://www.genoscope.cns.fr). Construction des banques dADN Des banques ont t raliss dans des plasmides bactriens et dans des BAC. La taille de linsert tait strictement slectionn. Deux banques dADN ont t construites, la premire (ND-TAM) contenait des inserts provenant la fois de gnome de mles et de femelles adultes et la seconde (ND-1) comprenait des fragments dADN dovaires collects sur des femelles PEST 24 heures aprs le repas sanguin. Les banques contenant des inserts de 2.5, 10, et 50Kb ont t construites partir de 330 mles et 430 femelles. Pour chaque sexe, de nombreuses banques possdant chaque classe de taille dinsert ont t effectues. Ces dernires ont t squences de telle sorte que les mles et les femelles participent de faon quitable aux donnes finales (Holt et al., 2002). Le squenage et les rsultats obtenus Le squenage et lassemblage La firme amricaine Celera Genomics, principal acteur du consortium constitu en 2001 a appliqu sa stratgie du squenage alatoire global pour squencer les 260 millions paires de bases de lanophle (Whole Genome Shotgun ou WGS). Le principe est de squencer des petits fragments chantillonns au hasard dans lensemble du gnome, puis dassembler ces lectures en contigs sur la base de leurs chevauchements (http://www.genoscope.cns/externe/Franais/Projets/Projet_AK/AK.html). Le squenage a t ralis en collaboration par Celera Genomics, le Genoscope et TIGR. Les donnes obtenues ont t runies et assembles par des algorithmes mathmatiques sophistiqus sur Compaq dans le systme de Celera.

79

Les STC du Genoscope et du TIGR ont servi jeter des ponts grande chelle entre les contigs (cf. fig. 8). On a ainsi pu regrouper les 19 000 contigs en 303 grandes ossatures (Scaffold). La plus grande ossature a une longueur de 23,1Mb et le plus grand contig fait 0,8Mb de long. Ces 303 grandes ossatures reprsentent 91% du gnome et les 9% restant sont constitus de 8 000 petites ossatures soit environ 9 000 ossatures au total. Lordonnancement des ossatures sur les chromosomes danophle a t effectu laide dune carte physique construite par hybridation in situ des BAC avec les chromosomes polytnes de glandes salivaires. Par cette mthode, 84% du gnome a ainsi t assign une rgion chromosomique (http://www.genoscope.cns.fr).

Fig. 8 : Assemblage de squences en contigs et des contigs en ossatures lors du squenage par la mthode shotgun Lannotation La dlimitation et la caractrisation des gnes a t entreprise par Celera et le groupe de Bioinformatique europen Ensembl en combinant la recherche par homologie et la prdiction par des algorithmes. Lannotation contenant le plus grand nombre dexons pour reprsenter chaque gne a t choisie. Un passage au crible de toutes les annotations a permis de dterminer le nombre de gnes putatifs codant pour des lments transposables et pour des contaminants bactriens (contamination des banques gnomique par des bactries de lintestin de lanophle). Ces lments transposables putatifs et les contaminants bactriens ont t reprs avant de transmettre lannotation GenBank. Ces gnes ont t exclus lors de lanalyse du gnome quand ctait ncessaire. La qualit de lannotation gnrale a t vrifie par chantillonnage au hasard de 100 annotations de gnes dont on a valu la pertinence de leur prdiction manuellement. Sur ces 100 gnes putatifs, seuls 35 taient prdits correctement, tous les autres prsentaient des erreurs (manque de codons, fusion de plusieurs gnes, problmes dans la

80

structure, etc.). Lestimation du nombre de gnes oublis par les automates a t faite et on a dcouvert environ 1 000 nouveaux gnes. Dans ce cas, on parle de prdiction ngative-fausse (Holt et al., 2002). Rsultats et perspectives Le fait de disposer de la squence gnomique dun autre insecte diptre, la drosophile, qui est en outre lobjet dtudes gntiques depuis prs dune centaine dannes a t un atout considrable pour caractriser les gnes. Environ 25 000 transcrits ont t trouvs et plus de 15 000 gnes danophle ont ainsi t dfinis, dont un millier sont suspects divers titres. Ce sont donc environ 14 000 gnes putatifs qui sont livrs la curiosit des spcialistes du moustique depuis mars 2002 alors quen 1999, on en connaissait seulement une dizaine (http://www.genoscope.cns.fr). De nombreux types de transposons ont t identifis dans le gnome dont les plus reprsents sont les LTR, les SINEs et les MITEs. Ceux-ci se retrouvent surtout dans la rgion htrochromatique. Au niveau de leuchromatine, les rptitions sont denses prs des centromres et faibles au milieu des bras chromosomiques. La densit en transposons est la plus forte sur le chromosome X (Holt et al., 2002). Parmi les premiers enseignements de lexploration du gnome de lanophle, citons la dcouverte dune vingtaine de nouveaux membres dune famille de rcepteurs olfactifs, non retrouvs chez la drosophile. Ce pourrait tre un point de dpart pour comprendre les signaux qui guident le moustique femelle vers lHomme, et pour concevoir des molcules attractives ou rpulsives. Lidentification de rcepteurs gustatifs pourrait par ailleurs clairer la faon dont le moustique identifie son hte. Une autre diffrence avec la drosophile est le nombre plus lev de protases impliques dans la rponse immunitaire inne chez les insectes, ce qui pourrait reflter le style de vie plus expos de lanophle. Ces gnes, et dautres encore, pourraient intervenir dans la rponse du moustique linfection par Plasmodium, et constituer ainsi des cibles pour bloquer le dveloppement du parasite dans linsecte. Citons encore les transporteurs ABC, des protines qui semblent impliques dans la rsistance aux insecticides et sur lesquels travaillent les chercheurs de lunit de biochimie et de biologie molculaire des insectes lInstitut Pasteur. De 4 gnes connus, on est pass, grce la squence du gnome une cinquantaine. On sest galement intress aux gnes activs ou rprims lors des repas de sang du moustique. La mise au point de puces ADN des squences des gnes de lanophle permettra dtudier plus prcisment leur expression (http://www.genoscope.cns.fr).

81

Il reste toutefois vrifier manuellement ces annotations automatiques et sengager dans des programmes de gnomique fonctionnelle et de transgnse pour tablir exprimentalement le rle de ces gnes. Les principales difficults rencontres Le consortium international du squenage a du faire face de nombreuses difficults. Lassemblage a t compliqu par le degr de polymorphisme de la souche PEST issue probablement du croisement effectu pour lobtenir. Les recombinaisons entre les diffrents cytotypes dAnopheles gambiae ont conduit une structure en mosaque du gnome car deux haplotypes diffrents ont t observs dans les rgions les plus variables du gnome. La souche PEST ne serait donc pas totalement consanguine et prsente un large nombre de SNP qui rend lassemblage beaucoup plus ardu. La lecture des squences par paire, aux deux extrmits dinserts de diffrentes tailles, a permis de relier, dordonner et dorienter les contigs entre eux au sein des ossatures. Mais la lecture de ces squences par paire a aussi servi valider la fiabilit de lassemblage par lanalyse des violations dans lorientation et la distance des paires de squences. On a ainsi pu dmontrer que 8% de lassemblage prsentait des erreurs soit par une orientation incorrecte des paires de squences soit par des erreurs dans la distance. Le squenage na pu tre fait entirement car entre les ossatures il reste encore des lacunes composes de petites rgions dont la couverture par des clones nest pas assure cause de lchantillonnage au hasard de ces derniers. Il peut galement sagir de squences rptes trs difficile trouver laide de la stratgie utilise (STC). Sil est relativement facile destimer la taille des nombreuses lacunes entre les contigs dans les ossatures, il est moins facile dvaluer les lacunes entre les ossatures ( Interscaffold gaps ). En moyenne, les ossatures sont spares par des lacunes de 317Kb (Holt et al., 2002). G. Et ensuite.. Le Genoscope et lInstitut Pasteur poursuivent actuellement leur collaboration en vue damliorer la qualit et linterprtation des donnes de squence. Ils ont entrepris de squencer les ADNc danophle sur toute leur longueur. Ces ADNc offriront un moyen de valider lannotation et, sans doute, de la corriger par endroit. En outre, ils permettront de corriger certaines erreurs locales dassemblage.

82

En dpit de ses imperfections, la squence disponible depuis mars 2002 constitue dores et dj un formidable espoir pour la communaut des chercheurs travaillant sur le moustique et plus largement sur le paludisme. Cette bauche sajoutant aux squences du gnome de Plasmodium falciparum et du gnome humain, on dispose dsormais dinformations gnomiques sur les 3 partenaires de la triade. De nombreuses perspectives de recherche soffrent nous pour lutter contre le paludisme et cest ce qui a conduit le CNRS avec le soutien du programme Pal+ du Ministre de la Recherche lancer en avril 2002 un projet postsquenage Anophle . Parmi les axes de recherche privilgis figurent notamment la phylognie des Anophles et lanalyse du polymorphisme de leurs populations naturelles, tudes qui pourraient conditionner la russite sur le terrain des diverses stratgies de lutte conues au laboratoire. LInstitut Pasteur a lanc en parallle un grand programme horizontal de recherche autour de lAnophle auquel participe 11 quipes du campus parisien associes aux quipes issues des Instituts Pasteur de Dakar et de Madagascar (http://www.genoscope.cns.fr). 2. Squenage de Plasmodium falciparum A. Historique du programme Genome Malaria Ce projet est n il y a une dizaine dannes de la rencontre lors dun meeting entre David Kemp et Alister Craig qui suggrrent que les efforts faits dans de nombreux laboratoires pour cartographier des rgions particulires du gnome du Plasmodium pouvaient tre coordonns et transforms en une stratgie globale de cartographie. Le consortium international est form en 1996, quand Steve Hoffman reoit un million de dollars pour le squenage du gnome de Plasmodium. Il est clair pour les protagonistes (cits ci-dessus) que des projets comptitifs ne seront pas efficaces et une stratgie de coopration est donc mise au point (http://www.wellcome.ac.uk). A cette date, les probabilits de parvenir la squence complte sont faibles car les fragments du gnome clons dans Escherichia coli sont instables. En effet, ces clones sont frquemment sujets des dltions et des rarrangements excluant toute construction de bonne qualit (Gardner, 2001). Il faudra un second meeting en 1996 et la preuve par le Sanger Center de la possibilit dassembler des squences du gnome partir de petits clones du chromosome 1 pour que le projet soit vraiment lanc. La stratgie gnrale est alors fixe et chaque centre de squenage
83

reoit la responsabilit de un ou plusieurs chromosomes. Il est conclu que les partenaires se runissent deux fois par an pour partager les informations techniques et coordonner le squenage et les activits annexes. Ces meetings sont loccasion de dvelopper une ligne de conduite suivre concernant lutilisation des squences prliminaires obtenues par les diffrents centres squenceurs. La progression durant les 18 mois suivants le second meeting seront lents cause de certaines rgions du gnome trs riches en bases A-T engendrant des difficults. Avec persvrance et grce aux avances techniques, le TIGR parvient squencer le chromosome 2 en 1998 et le Sanger suivra avec la squence du chromosome 3 obtenue et publie en 1999 (Gardner et al., 1998 ; Bowman et al., 1999 ; http://www.wellcome.ac.uk/en/malaria/Theparasite/pbgeno1.html). Malgr toutes ces difficults, lensemble du gnome sera squenc en 2002 et reprsentera un exemple de coopration internationale. B. Les acteurs et les financements Le consortium international form en 1996 comprend trois centres de squenage : The Wellcome Trust Sanger Institute (Royaume-Uni) qui a squenc les chromosomes 1, 3 9 et 13, The Institute for Genomic Research/Naval Medical Research Institute (TIGR, NMRC ; USA) qui sest charg de squencer les chromosomes 2, 10, 11 et 14 et enfin lUniversit de Stanford (USA) qui a squenc le chromosome 12 (Holt et al., 2002 ; Gardner et al., 1998 ; Bowman et al., 1999). Son financement provenait de la Wellcome Trust, the Burroughs Wellcome Fund, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (qui fait partie de linstitut national amricain de la sant) et le dpartement amricain de la dfense. Les fonds investis au dpart du projet de squenage du Plasmodium falciparum environnaient les 15 millions de dollars (Gardner, 2001 ; http://www.wellcome.ac.uk). Il est toutefois difficile dvaluer le cot final du projet car les fonds provenaient de multiples sources. De plus, les dons sont envoys pour le financement des projets de squenage en gnral et non un en particulier. Le financement des projets de squenage de lAnophle et du parasite a t sujet polmique et nous y reviendrons un peu plus loin dans ce rapport (Doolittle, 2002).

84

C. Les intrts du squenage de Plasmodium Le dveloppement rapide de la rsistance du parasite aux nouveaux mdicaments dans de nombreuses rgions du monde et en particulier dans le sud-est de lAsie a pouss les scientifiques explorer de nouvelles pistes pouvant apporter rapidement de nouvelles cibles aux vaccins et aux mdicaments (Bowman et al., 1999). Le squenage grande chelle du gnome du parasite a alors t lanc. Lidentification de nouvelles cibles est dpendante de lextension du savoir sur la biologie du parasite. Le squenage est la seule mthode connue actuellement nous permettant de prendre de vitesse lextension de la rsistance du parasite par lidentification de ses gnes et le dveloppement rapide de nouveaux traitements de lutte (Gardner et al., 1998). D. Squenage et assemblage Le gnome du clone 3D7 de Plasmodium falciparum a t squenc par squenage alatoire chromosome-spcifique. Cette approche a t privilgie en raison de la technologie disponible au dbut du projet. En effet, une approche gnome entier avait un cot trop lev pour tre choisie. De plus, aucune banque dADN de haute qualit na pu tre construite dans Escherichia coli cause de linstabilit de ces vecteurs aprs linsertion de larges squences dADN. De ce fait, la stratgie de squenage clone par clone tait galement exclue (Gardner et al., 2002). Cette mthode dbute par la purification des 14 chromosomes du gnome sur gel champ puls. Il sagit dune lectrophorse applique aux fragments dADN de grande taille. Son principe est de soumettre les molcules dADN non pas un champ lectrique uniforme, mais des champs dont lorientation change priodiquement. 11 des 14 chromosomes ont pu tre spars par cette technique. Les trois chromosomes restants (6, 7 et 8) non spars ont t squencs en groupe (Bowman et al.,1999). Aprs sparation et purification par lagarase, chaque chromosome est squenc individuellement en utilisant une approche shotgun (Gardner, 2001). Les chromosomes sont dcoups en fragments de 1 2Kb dans le but de construire une banque gnomique et sont clons dans des plasmides ou des vecteurs M13. LADN des plasmides est prpar par slection de colonies au hasard et la fin de chaque insert est squenc en utilisant des amorces sens (dbut de linsert) et anti-sens (fin de linsert). Un nombre consquent de squence est produit pour couvrir 10 fois le chromosome (http://www.tigr.org).
85

Les squences obtenues sont ensuite assembles en contigs en utilisant Phrap (www.phrap.org) ou lassembleur du TIGR (http://www.tigr.org). Des clones YAC, antrieurement localiss par The Wellcome Trust Malaria Gnome Collaboration, sont apparus dune aide prcieuse pour ordonnancer les contigs (Gardner, 2001). La stratgie de squenage total partir des clones YAC a t exclue cause de leur instabilit et de la contamination possible des sous-clones par de lADN de levure (Bowman et al., 1999). La mthode principale pour ordonnancer les contigs est la suivante : les liens entre contigs sont identifis en utilisant un programme de regroupement. Celui-ci analyse tous les contigs et leurs squences communes. Une fois les contigs regroups en ossatures, il faut combler les lacunes encore prsentes entre ces contigs mais aussi entre les ossatures ce qui nest pas sans poser de problmes (http://www.tigr.org). E. Les problmes rencontrs, finition et vrification de la squence Lassemblage de chaque chromosome a pos problme car il tait impossible dobtenir une seule contig recouvrant entirement le chromosome du fait de la sous-reprsentation de certaines squences dans la banque, de la prsence de rgions rptitives (riches en A-T) perturbant lassembleur ou de la prsence dambiguts. Aprs lassemblage de chaque chromosome, une centaine de contigs ont t obtenues (http://www.tigr.org). La richesse du gnome en nuclotides A-T a prsent de nombreuses difficults en terme de construction de banques prcises mais aussi lors du comblement de lacunes. En effet, le processus de finition a t beaucoup plus long et plus dur que prvu car des groupes de contigs (ossatures) nont pas pu tre cartographis cause du manque de marqueurs microsatellites ou de sites de restriction informatifs dans ces rgions riches en A-T. Le comblement des lacunes entre contigs a consist en lutilisation de la technique de marche sur les plasmides avec des oligonuclotides spcifiques. Les lacunes entre les ossatures sont des aires o aucun clones physiques ne permet de faire le lien entre contigs proches. Ils sont donc combls par PCR, grce des amorces produites par complmentarit de la squence des contigs flanquant ces lacunes. Les produits de la PCR sont ensuite squencs. Pour simplifier ce processus, les ossatures sont localises sur les chromosomes par lutilisation de STS drivs des YAC cartographis et de marqueurs microsatellites. Les rgions riches en A-T ont du tre combles par dautres mthodes dont linsertion de transposons et la construction de microbanques qui assure une plus forte couverture. Une fois la squence termine et les lacunes combles, la squence a t dite en utilisant lditeur du TIGR et toutes les ambiguts sont
86

corriges directement par le programme ou par re-squenage des rgions en question. La squence est galement examine pour vrifier que chaque rgion est recouverte par deux clones et que chaque base de la squence est reprsente par au moins 2 squences de haute qualit. Les lectures provenant des YAC cartographis ont aussi servi de confirmation la colinarit de lassemblage des chromosomes (http://www.tigr.org; Gardner, 2001 ; Gardner et al., 2002). Lutilisation dune carte de restriction de haute rsolution ou carte optique de restriction couvrant entirement le gnome a servi dossature pour aligner et vrifier les contigs obtenues aprs squenage. La cartographie optique est une technique qui a fait ses preuves pour la construction de cartes de restriction partir de molcules dADN provenant dune varit de types de clones comme les BAC, les YAC et les clones avec des petits inserts (Lai et al., 1999). Lannotation des chromosomes a dbut lorsque toutes les lacunes ont t combles, que la structure finale du contig recouvrant lensemble du chromosome a t vrifie et enfin que la squence a t dite. F. Rsultats Les chromosomes 2 et 3 ont t respectivement squenc en 1998 et 1999 (Gardner et al., 1998 ; Bowman et al., 1999) . La squence finale des autres chromosomes a t publie en 2002 bien quil ne sagisse que dune bauche car seuls les chromosomes 1, 5, 9 et 12 sont entirement squencs lheure actuelle. Le travail de finition et de vrification est toujours en cours pour les chromosomes 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13 et 14 (Gardner et al., 2002). Grce au squenage, il a t possible de mettre en vidence la variation de la taille des chromosomes dune souche lautre. La rgion centrale reste bien conserve lintrieur de lespce mais aussi entre espces de Plasmodium. Par contre, les rgions subtlomriques peuvent tre beaucoup plus larges ou beaucoup plus petites que ce quon pourrait attendre. Cette variation de taille est principalement le fait de dltion(s) ou dinsertion(s) de nuclotides. La rgion subtlomrique prsente un intrt particulier pour les chercheurs car elle arbore des familles de gnes fortement polymorphes jouant un rle dans lvitement de la raction immunitaire de lhte. A lintrieur du gnome, 5279 gnes ont t identifis. Seuls 40% des protines issues de ces gnes sont semblables des protines rpertories dans les bases de donnes. Cela signifie que 60% des protines seraient uniques cet organisme. Il sagit dun pourcentage

87

lev par rapport aux autres eucaryotes refltant probablement la fois la distance volutive et la haute spcificit de la niche cologique que le parasite occupe. Seuls 733 des 5279 gnes putatifs sont des enzymes, ce qui semble faible vu leur importance au sein des voies mtaboliques. Il apparat que le Plasmodium est incapable de raliser des biosynthses cls comme les interconversions des acides amins par exemple. La plupart des voies de biosynthse se droulent au niveau de lapicoplaste. Bien que le gnome code seulement 57 protines, on a valu 10% le nombre de protines nuclaires transportes jusqu lapicoplaste. Le projet gnome a aussi recel la prsence de 59 gnes Var dont 35 en rgions subtlomriques et 24 en clusters la fin des chromosomes. La plupart de ces gnes sont plus courts que ceux qui avaient t assimils comme intervenant dans la cytoadhsion et les squences dADN sont trs variables dune rgion lautre. La fonction de ces gnes plus courts et plus nombreux reste dcouvrir. Aprs ce projet, il est devenu clair que 2 autres familles multigniques trs polymorphes sont associes aux gnes Var : les gnes Rif et Stevor. Les produits de ces gnes sont vraisemblablement exports la surface du globule rouge infect mais aucune fonction ne leur est attribue pour linstant (http://www.wellcome.ac.uk). G. Et aprs La valeur de linformation obtenue par le squenage est incalculable. Elle va permettre de progresser dans de nombreux domaines de recherche sur la malaria. Ainsi, toutes les voies mtaboliques du parasite pourront tre mises jour et de nouvelles cibles pour les mdicaments verront le jour. Le succs de ce squenage a lanc dautres initiatives dont le squenage dautres espces de Plasmodium qui pourront permettre la comparaison entre souches et entre espces. On pourra ainsi rvler les modifications dans les gnes intervenant au niveau immunitaire, au niveau pathognicit et les variations relatives linvasion de lhte et de ses organes (http://www.wellcome.ac.uk).

III. Mise disposition des donnes

88

Les projets de squenage ont fourni une immense quantit de donnes qui sont maintenant disposition de tous les chercheurs. Toutes ces donnes sont runies dans des banques afin de faciliter leur exploitation. En ce qui concerne les donnes sur lanophle et le Plasmodium, il faut respectivement consulter AnoDB (http://www.anobase.org/AnoDB/) et PlasmoDB (http://www.plasmodb.org). 1. Dfinition de la banque de donnes Une base de donnes est une collection dobjets prsentant des proprits et/ou des caractres communs et qui peut tre rutilise dans un processus de traitement. Elle suppose donc trois tapes : la collecte de donnes, leur mise en forme et leur diffusion. Les donnes sont issues dexpriences et techniques de laboratoire (dont fait partie le squenage), dinformations factuelles, dautres banques de donnes ou encore rsultant dun traitement informatique. Lapparition dInternet en 1993 a tendu les possibilits de connexion de nombreux laboratoires du monde entier. Les banques de donnes actuelles proposent des interfaces conviviales de saisie des informations pour la soumission des squences. La mise en forme des donnes se dfinie par lensemble des normes, standards et conventions ncessaires pour rpondre aux besoins de reprsentation des informations, dchanges (collecte et diffusion) et des traitements informatiques. Chaque enregistrement (ou entre) de la banque de donnes doit renfermer linformation ncessaire son reprage dans la collection (ou cl unique). Par exemple, le nom dun gne est souvent utilis comme identificateur mais ce nom est susceptible dvoluer au cours du temps en fonction des corrections qui pourront affecter sa squence. Pour lever le problme de traabilit qui peut dans ce cas se poser, on attribue chaque squence un numro daccession quelle conservera dune version lautre de la banque. La mise en forme consiste appliquer aux donnes deux types de standards qui vont formater de manire semblable chacune des fiches de la banque : un standard classificatoire qui est relatif au contenu, soit linformation biologique, dans le cas dune banque dADN et un standard structural qui a trait au contenant (format du document). Dans le standard classificatoire, des descripteurs tiquettent chacun des champs correspondant aux proprits et caractristiques de la squence. Les diffrents champs se rpartissent en 4 parties distinctes : lidentit biologique de la squence, les rfrences bibliographiques des publications relatives la production de la squence, les proprits de la squence et la squence proprement dite.

89

La diffusion des donnes a galement beaucoup volu ces dernires annes puisquelle est pass par lenvoi postal de bandes magntiques puis par le CD-ROM pour arriver actuellement laccs distance travers des rseaux informatiques haut dbit. 2. Interrogation et intgration des bases de donnes Laccs aux bases de donnes ncessite lintervention dun logiciel capable de lire et dextraire linformation de la base selon les critres choisis. Le schma conceptuel de chaque base de donnes est troitement li aux questions biologiques auxquelles la base tente de rpondre. Il est impossible dorganiser lensemble des donnes gnomiques au sein dune seule banque. Il est donc ncessaire de faciliter linteroprabilit de diffrentes bases, cest--dire la capacit les exploiter conjointement pour rpondre une requte complexe nonce par un biologiste qui possde sa propre problmatique. Un enjeu des Programmes Genome vise relier lensemble des diffrents types de donnes exprimentales quils produisent, dabord entre elles, et ensuite avec les autres sources dinformation disponibles. Lintgration de connaissance htrognes dans une reprsentation unifie des donnes offre une plate-forme gnrique, qui permet de formuler des requtes globales sur lensemble des informations disponibles dans le systme. Un des buts assigns ce processus dintgration consiste rendre possible la dtection de nouvelles corrlations parmi une masse de donnes qui ntaient jusqualors pas relies dans un mme systme pour linterrogation. 3. Les banques nucliques Au dbut des annes 1980, avec la dcouverte de la technique du squenage de lADN, les premires grandes banques gnralistes de squences voient le jour. Les squences nucliques des banques de donnes peuvent tre de 3 natures diffrentes : la squence peut tre fournie sous forme dADN, dARN ou dADNc. La plupart des grands centres de recherche sur les gnomes mettent disposition de la communaut scientifique un serveur permettant de consulter les rsultats disponibles dans leur base de donnes locales. Il existe aussi des bases de donnes internationales, chacune privilgiant un certain type dinformation : squences pour GenBank, cartographie pour le NCBI (National Center for Biotechnology Information), maladies gntiques pour lOMIM
90

(On-line Mendelian Inheritance in Man). La croissance de ces bases de donnes est quasiexponentielle. GenBank est lune des plus anciennes et volumineuses des bases de squences dADN, avec celle de lEMBL (Laboratoire europen de biologie molculaire, Heidelberg, Allemagne). Ces grandes banques gnralistes, denvergure internationale, sont maintenant devenues indispensables la communaut scientifique car elles reprsentent la mmoire des donnes produites dans les laboratoires et constituent de ce fait un gisement de connaissances explorer. En plus des squences, on trouve aussi une bibliographie, une expertise biologique et des annotations lies aux squences traites ainsi que des rfrences dautres bases de donnes. La principale mission des banques est de rendre publique les donnes issues de fonds publics et donc collectives. Pour cela, un processus de double publication sest impos depuis 1988 : les chercheurs doivent dposer leur squence aux banques avant de soumettre larticle associ aux revues scientifiques. Le fait que la majorit des squences connues soit runie en un seul ensemble de donnes est un lment fondamental pour la recherche de similitude avec une nouvelle squence. Il existe de nombreux programmes informatiques, limage de FASTA lUniversit de Virginie et de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) du NCBI, qui permettent la recherche rapide dalignements de nuclotides ou dacides amins et conduisent mettre en vidence des homologies de squences dADN ou de protines entre organismes. Cependant, ces banques souffrent de nombreux dfauts car seuls les auteurs sont responsables de la qualit des squences soumises. Ainsi, les squences soumises sont de nature htrogne (ADN nuclaire, ADN mitochondrial, etc.). Ltat des connaissances sur les squences sont trs variables car la dtermination de la fonction dune squence exige un travail exprimental et danalyse souvent dlaiss par les grands centres de squenage qui ne ralise que lannotation automatise. Des erreurs peuvent se glisser dans les squences comme sur lorigine du fragment squenc ou encore dues la mthodologie employe. On peut aussi observer un biais dchantillonnage quil soit taxonomique (ingalit dans la reprsentation des organismes dans les banques), squentiel (les gnes des gnomes tudis sont ingalement reprsents) ou d une redondance des donnes. Devant lhtrognit des squences des banques gnralistes, des banques spcialises se sont constitues autour de thmatiques biologiques particulires comme les banques gnomiques qui runissent les squences dune mme espce dans le but denrichir les annotations pour diminuer ou lever les ambiguts laisses par les grandes banques publiques (http://www.infobiogen.fr/doc/docindex.html).
91

4. Exemple de la banque de donnes de Plasmodium : PlasmoDB Cette banque de donnes a t cre en juin 2000. Elle contient des informations de sources multiples incluant les squences dADN et leurs annotations, les gnes et les protines prdits par annotation automatise, les donnes des cartes physiques et optiques. Toutes ces donnes runies permettent aux scientifiques dy accder et de pouvoir les intgrer dautres sources. Pour les scientifiques nayant pas accs Internet, un CD-ROM a aussi t cre et donne lui aussi accs toutes les donnes acquises sur le parasite. Les problmes lis des donnes incompltes lors de projet de squenage et le besoin daccompagnement pour lutilisation en vue de linterprtation des rsultats, sont devenus le premier challenge de PlasmoDB. Dans cette base de donnes, la possible redondance ou les assemblages incorrects ont t identifis par des comparaisons de grande rigueur de chaque squence avec le gnome entier de Plasmodium falciparum, et les comparaisons des squences ADN avec des cartes gntiques. Comment faire face tant dintgration de donnes et quels outils peuvent tre utiliss pour les analyser ? PlasmoDB est base sur une architecture relationnelle de base de donnes, construite autour de relations relevant de la biologie suivant le dogme central de la biologie : du gne lARNm la protine . Parce que toutes ces informations sont dans une seule base de donne, les questions peuvent combiner des recherches pour des gnes particuliers ayant un intrt avec lARN et lanalyse des expressions des protines, et des tudes sur les polymorphismes de population gntique et des comparaisons despces croises. PlasmoDB peut galement tre utilise pour construire des questions complexes en utilisant des oprateurs boolens. Deux points cls mergent de ces questions. Le premier est le pouvoir de la base de donnes dvou aux jeux de donnes des squences gnomiques provenant de lhabilit former des questions relationnelles, permettant aux chercheurs de composer leurs propres questions. Le second est que le but de ces questions nest pas de trouver la bonne rponse , mais de rduire les options, en limitant lanalyse du gnome un faible nombre de gnes (Kissinger et al., 2002).

92

APPLICATIONS DIRECTES DU SEQUENCAGE

93

I. Les puces ADN

1. Mthodologie Il est clair, vu la squence complte du gnome de Plasmodium falciparum, que beaucoup de molcules que l'on pense impliques dans l'invasion, sont membres d'une famille plus larges de gnes. L'implication spcifique de ces molcules dans les voies d'invasion, ainsi que leur importance dans l'induction de l'immunit du parasite, devient plus claire. L'accession au gnome de Plasmodium falciparum a acclr la comprhension du processus complexe d'invasion. Par modle, l'examen de la base de donnes de Plasmodium falciparum pour des molcules contenant des domaines EGF-like a men l'identification de molcules impliques dans l'invasion de l'rythrocyte. 2. Les puces laide des tudes du Transcriptome et du Protome Les recherches biologiques et biomdicales sont aujourd'hui en pleine transition dont les deux composantes principales sont: l'augmentation importante de donnes concernant le squenage des gnomes et le dveloppement de nouvelles technologies pour l'exploiter. Malheureusement, les milliards de bases composant ces squences ne nous disent pas le rle de chaque gne, le fonctionnement de chaque cellule, comment les cellules forment un organisme ou ce qui ne fonctionne pas lors d'une maladie. Pour tirer le meilleur parti de cette disponibilit croissante d'information concernant les squences d'organismes, de nouvelle technologies sont requises telles que les puces ADN qui sont parmi les outils les plus puissants et les plus polyvalents pour tudier la gnomique. Les puces d'acides nucliques fonctionnent par hybridation d'ARN ou d'ADN en solution des molcules d'ADN fixes sur une surface. Celles-ci ont une localisation spcifique, et l'hybridation est gouverne par les lois de reconnaissance molculaire de brins d'acides nucliques complmentaires. Les fragments d'ADN fixs la surface de la puce, ou sonde, sont souvent des ADN complmentaires (ADNc), de l'ADN gnomique ou provenant de banques de plasmides, et le matriel hybrider est marqu radioactivement et plus rcemment avec une sonde fluorescente. L'utilisation de fluorescence ainsi que de verre comme support pour la puce ont permis une miniaturisation de la technique ainsi qu'une augmentation d'efficacit (cf. fig. ci-

94

dessous)(Fodor et al., 1991 ; DeRisi et al., 1997). Aujourd'hui, il est possible de dposer 20 000 sondes par cm2. Bien qu'il soit possible de synthtiser ou dposer des fragments d'ADN de squence inconnue, la plupart des requtes sont faites avec des sondes connues. Une des plus importantes applications des puces ADN est le screening de l'expression de gnes (via le taux d'ARN messager : ARNm). La collection de gnes qui est exprime ou transcrite partir de l'ADN gnomique (ADNg), parfois appele profil d'expression ou encore "transcriptome", est un dterminant majeur du phnotype et de la fonction cellulaire. A la diffrence du gnome, le transcriptome est trs dynamique et peut changer trs rapidement et radicalement en rponse des perturbations ou lors d'vnements cellulaires tels que la rplication ou la division cellulaire. De plus, le changement de pattern de multiples protines peuvent fournir des indices concernant les mcanismes de rgulation et les voies biochimiques. Dans le contexte de la sant humaine et de la mdication, les connaissances acquises par ce type de mesures peuvent permettre la dtermination des causes et consquences de maladies, ou comment les produits de gnes peuvent avoir une action thrapeutique ou en tre la cible (Lockhart et al., 2000).

95

3. Puce ADN et paludisme : un exemple d'tude Nous avons vu prcdemment que l'on peut dposer jusqu' 20 000 sondes par cm2. On peut donc facilement imaginer que l'tude du gnome, du transcriptome et du protome par

96

puce ADN fournit une alternative pratique l'exploration traditionnelle de Plasmodium falciparum. Le secret d'une bonne analyse par puce ADN rside dans la capacit du logiciel intgrer les donnes. Par exemple, il est montr Figure 1, un diagramme putatif des nergies de liaison calcules pour chacun des oligonuclotides (70 pb) d'un possible gne var. Lorsque l'on dfinit la sonde de l'oligonuclotide, il faut prter attention la structure secondaire qui peut tre la source d'une mauvaise hybridation. De plus, la prsence d'une squence peu complexe peut rsulter en une hybridation non spcifique. Par exemple, le gnome de Plasmodium falciparum contient un grand nombre d'lments de squence peu complexes, due une grande frquence de squences riches en nuclotides A et T la fois dans les rgions non-codantes et codantes.

97

Fig. 1 : Diagramme dnergies de liaison doligonuclotides un membre de la famille var Bozdech et al. (2003) ont choisi de comparer les stades schizonte et trophozote du cycle de vie asexu intra-rythrocytaire de Plasmodium falciparum, ceci dans le but de caractriser les spcificits des stades du cycle de ce parasite. Trophozote et schizonte reprsentent deux stades de dveloppement distincts lors des 48 heures de vie intra-rythrocytaire. Ces stades varient
98

entre

eux

au

niveau

morphologique,

proprits

biochimiques

et

activit

transcriptionnelle. Le trophozote, 18-24 heures post-invasion, renferme une activit transcriptionnelle forte avec beaucoup d'euchromatine. De plus, les trophozoites sont caractriss par une concentration importante de ribosomes cytoplasmiques et la formation rapide d'organelles par exemple. En revanche, les schizontes (36-42 heures) sont cactriss par la rplication d'ADN (16-32 copies). Les gnes spcifiques aux stades schizonte et trophozote identifis pralablement fournissent une excellente source de contrles positifs pour des expriences avec des puces. Six hybridations indpendantes ont t effectues (cf. fig. 2). Dans les trois premires, l'ADNc driv de schizontes a t marqu au Cy3 (vert) et l'ADNc driv de trophozotes au Cy5 (rouge). Dans les trois autres expriences, les marquages ont t inverss. Sur les 854 gnes expriments prsentant une expression diffrentielle, 525 ont montr une transcription relative plus importante chez les trophozotes que chez les schizontes, tandis que 326 prsentent une transcription plus importante chez les schizontes. Les rsultats obtenus par puces sont confirms par Northern Blot et mnent l'observation de deux catgories de gnes, correspondant aux gnes exprims diffrentiellement entre les stades trophozote et schizonte. De plus, une valuation des homologies de gnes de ces catgories rvlent plusieurs groupes fonctionnels de gnes. Ces groupes incluent des gnes codant pour des sous-units ribosomiques, des facteurs multiples de transcription et traduction, des enzymes de voies de biosynthse ou cataboliques, ou encore intervenant dans l'adhsion du mrozote et dans la machinerie d'invasion. Ces rsultats confirment l'hypothse d'une transcription spcifique en fonction du stade de dveloppement. D'autres donnes vont dans le sens de l'utilisation de puces pour comparer le protome des stades sexus et asexus (Rathod et al, 2002).

99

Fig. 2 : Comparaison Trophozote / Schizonte La technologie de puces ADN est principalement utilise aujourd'hui dans le but de confirmer les rsultats obtenus avant l'arrive de cette technique, ceci pour la valider et la rendre fiable (David, com. pers.). Elle deviendra alors un outil extrmement puissant pour les tudes de transcription de gnes et de relation entre les gnes selon leurs fonctions. Les donnes apportes par cette technique viendront complter les informations concernant la squence du gnome de Plasmodium falciparum et d'autres pathognes. De plus, l'intgration des donnes protomiques

100

avec celles obtenues par puces permettront une meilleure comprhension des mcanismes molculaires de rgulation et d'adaptation.

II. Les moustiques transgniques

Lavance des outils molculaires pour la manipulation des insectes, comme Drosophila melanogaster, permet aux chercheurs dappliquer ces techniques des vecteurs de maladies comme la malaria. Les chercheurs, avec ces techniques, pourraient en thorie gnrer un moustique qui bloquerait le dveloppement et la transmission du parasite de la malaria. Plusieurs axes de recherche se sont mis en place pour obtenir des stratgies qui puissent tre utilises pour contrler le moustique vecteur de cette maladie. Toutes ces stratgies sont considres comme des nouveaux moyens de lutte en utilisant des moustiques gntiquement modifis. Les axes de recherche se situent sur la transgnse chez le moustique, avec lobtention de moustiques striles (mles et femelles), lutilisation de transposons, de virus ou de symbiontes. Le squenage du vecteur Anopheles gambiae et du parasite Plasmodium falciparum vont aider dans la dcouverte de gnes impliqus dans la capacit du moustique tre rsistant aux parasites de la malaria ainsi que dans la manipulation de ces gnes afin de contrler la transmission du parasite. Des avances ont t faites dans quatre aires. Premirement, par lintroduction de gnes trangers dans la ligne germinale du moustique. Ensuite, par la caractrisation de promoteurs spcifiques de tissus. Des avances ont galement eu lieu dans lidentification de produits de gnes qui bloquent le dveloppement du parasite dans le moustique. Et enfin, par la gnration de moustiques transgniques qui altrent la transmission de la malaria. Les voies dinteraction entre le vecteur et le parasite sont explorer cette interface est aussi importante que celle avec lhte humain au niveau de la transmission du parasite. La premire ligne de recherche repose sur lidentification de gnes qui pourraient inhiber le dveloppement du parasite. Une deuxime ligne de recherche est dans linitiative de dvelopper des mcanismes pour amener les gnes slectionns tre introduit dans les populations naturelles. 1. Les mthodes utilises

101

La transgnse comprend une phase dingnierie molculaire surtout base sur lutilisation de transposons. Elle ncessite chez les insectes la catalyse enzymatique et de nombreux essais ont t raliss par les transposons. Depuis 1982, le seul insecte quil tait possible de transformer tait Drosophila melanogaster. En 1995, la transformation de la mouche mditerranenne a donn beaucoup despoir mais il a fallu attendre des annes pour crer des moustiques transgniques et introduire un gne susceptible dempcher la propagation dorganismes pathognes. En 1998, Aedes aegypti a t transform pour un gne marqueur de la couleur de lil grce aux transposons mariner et hermes. Les transposons une fois entrs dans une population peuvent se propager rapidement travers elle. Le plus connu est llment P (trouv chez la drosophile). Lide est dinsrer lintrieur dun transposon appropri, des gnes qui rendent le moustique rsistant et de regarder sils se propagent. Les gnes de rsistance peuvent tre dcrochs de leur transposon et donc tre perdus. De plus, aprs quun transposon particulier se soit propag dans une population, il ne peut plus tre rutilis. Le plus grand souci est que si la modification reste stable long terme, elle peut tre balaye travers la population globale et tre contreselectionne aprs un certain nombre dannes. A.Utilisation de virus et de bactries Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires qui utilisent lappareillage enzymatique des cellules pour se rpliquer, se multiplier et se propager dans un organisme. Ce sont des systmes dexpression de certains de ces insectes que les chercheurs veulent utiliser pour crer des moustiques transgniques et introduire un gne susceptible dempcher la propagation des virus pathognes. Cependant, lADN introduit dans la cellule sous forme de plasmide ne sincorporerait pas au gnome. Deux virus sont tests, ce sont Sindbis (un alphavirus) et lAeDNV (un parvovirus). Lutilisation de bactries symbiotes modifies gntiquement pour produire des molcules antiparasitaires est ltude.

B.Utilisation de moustiques striles

102

Une des voies possible est dobtenir des moustiques striles (www.inapg.inra.fr). Un gne ltal pourrait tre li un promoteur spcifique pour la femelle (type vitellognine) et pour le mle, une strilisation par systme gntique cest--dire un gne qui induirait une strilit mle, pourrait tre envisage. Le lancement dinsectes portant des dominances ltales ou autres mcanismes de gntique sexuelle prsente dautres challenges comme, par exemple, la ncessit de ne relcher que des mles pour ne pas augmenter le nombre ou la nature des piqres par personne et par nuit. C.Utilisation de la transgnse De nombreuses expriences sont en cours, en vue de crer un moustique transgnique capable de contrler la malaria. Les stratgies gntiques sont bases aujourdhui sur la modification de la capacit de dveloppement du parasite, et non plus sur llimination ou la rduction de la population de vecteur. Le concept initial, en 1991, tait de fabriquer des moustiques avec un phnotype altr qui pourrait tre introduit dans les populations de telle sorte que ce nouveau trait pourrait se propager et devenir dominant. Ctait une stratgie qui visait le parasite par lintermdiaire du moustique. Cest en 2000 que la premire exprience dinsertion dun gne dans le gnome dun moustique a t effectue et russie. Lquipe de F. Catteruccia a insr le gne de la GFP (Green Fluorescence protein) dans le vecteur Anopheles stephensi (vecteur de la malaria en Inde) (Catteruccia et al., 2000). Ce gne a permis au moustique dexprimer le vert quand il tait excit par les ultraviolets (cf. fig. 3). Cela donne lieu une prochaine tape qui serait dinsrer des gnes qui inhiberaient le dveloppement du parasite.

Fig 3 : une larve dAnopheles gambiae portant le gne de la GFP (Enserink, 2002) Le mcanisme de pntration dans lpithlium des glandes salivaires du moustique nest pas clair, mais des recherches suggrent que ce processus pourrait tre spcifique,

103

associant des intractions ligand-rcepteur. En effet, des recherches ont permis de dcouvrir un peptide (nomm SM1, cf. fig. 4) qui possde une haute affinit pour la paroi de lintestin moyen et lpithlium des glandes salivaires du moustique (Enserink et al., 2001). Il a t identifi partir dune banque de bactriophages. Les expriences in vitro ont indiqu que le parasite et le peptide reconnaissent le mme rcepteur qui est ncessaire pour pntrer dans les deux pithliums (intestin moyen et glandes salivaires). Le gne qui code ce peptide de 12 acides amins est capable de bloquer les rcepteurs dans lintestin moyen et les glandes salivaires du moustique dont le parasite a besoin pour se rpliquer.

Fig 4 : Modle dinterfrence de linvasion du parasite par le peptide SM1.La surface de la lumire de lintestin moyen et des glandes salivaires sont reconnus par le parasite et le peptide SM1. En prsence dexcs de SM1, laccs des ookintes et des sporozotes la surface putative du ligand est bloqu. (Gosh et al. 2002) Les moustiques o ce peptide a t administr ne peuvent plus tre contamin par la malaria (cf. fig. 5). Ltape suivante tait donc dobtenir des insectes capables de sauto-administrer le SM1 et de transmettre cette proprit leur descendance (http://www.genetic.ch).

Fig. 5 : le peptide SM1 bloque les ookintes venant de lintestin moyen (Habeck 2001) Les recherches de M. Jacobs-Lorena et J. Ito montrent que lajout dun gne synthtique pour le peptide SM1 dans lespce Anopheles stephensi presque compltement interrompu la

104

capacit du moustique transmettre le Plasmodium berghei qui engendre la malaria chez la souris (Clarke, 2002 ; Habeck, 2001). Ils ont utilis un Anopheles stephensi transform avec un fragment dADN contenant un gne chimrique avec quatre units de SM1 jointes par quatre acides amins lis et attachs la squence signal de la carboxypeptidase et un fragment dpitope dhmagluttinine (HA) (Land, 2002 ; Ito et al., 2002). Le fragment dADN a t flanqu un promoteur spcifique du gne de la carboxypeptidase de lintestin pour obtenir une forte expression du peptide SM1. La carboxypeptidase a t utilise car cest une protase abondamment prsente dans la lumire de lintestin moyen du moustique. La squence signal cible qui est prsente dans la carboxypeptidase sert dj sortir le peptide de la lumire de lintestin. Les rsultats trouvs montrent que ces moustiques transgniques inhibaient la formation doocystes 80%, en comparant des moustiques contenant les plasmides contrls et des moustiques sauvages. Lintgration du fragment de gne a t confirme par des analyses par Sourthern Blot, et lexpression du gne chimre a t quant elle confirme par des analyses dARN messager. La prsence de SM1 a t dtecte en utilisant la microscopie contraste diffrentiel avec un anticorps anti-HA. Il ressort de cette exprience que la prvalence et lintensit des sporozotes ainsi que la comptence du vecteur (cest--dire lhabilit transmettre les parasites une souris saine) ont t fortement rduites dans les moustiques transgniques en comparaison aux moustiques contrles. Cette rduction est marque dans le dveloppement du parasite et dans la transmission. Exprimer un gne parasitaire reprsente alors un grand pas dans le potentiel contrler la malaria. Il faut cependant noter que cette tude concernait un parasite de la malaria de rongeur et ceci dans un environnement contrl. 2. Les diffrentes expriences de moustiques transgniques Au niveau des nouvelles recherches sur des moustiques transgniques pour contrler la malaria, le premier effort a t plac sur le dveloppement de transformation gntique de linsecte vecteur, en utilisant des promoteurs qui pouvaient augmenter lexpression des exognes dans des quantits importantes et dans un tissu spcifique. Le dernier challenge a t didentifier un produit de gne qui pourrait gner le dveloppement du parasite sans devenir nuisible pour le vecteur. La dcouverte dun anticorps reconnaissant les antignes la surface des glandes salivaires qui peuvent interfrer avec linvasion du Plasmodium dans cet organe a motiv la recherche de lidentit de cet anticorps.

105

Brennan et ses collgues ont identifi un anticorps monoclonal qui reconnat un antigne de 100 kDa la surface des glandes salivaires dAnopheles gambiae ( Brennan et al., 2002). Cet anticorps devient donc un outil potentiel pour contrler la capacit vectorielle des anophles. Une autre approche a t celle de L. Capurro avec un anticorps monoclonal contre le circumsporozote de Plasmodium gallinaceum (CSP) en utilisant un virus vecteur (Capurro et al., 2000). Le CSP est lantigne prdominant la surface des sporozotes et il serait requis dans la reconnaissance et linvasion des glandes salivaires. Linvasion des sporozotes dans les glandes salivaires est fortement inhibe dans les moustiques qui expriment cet anticorps (de lordre de 96,8 99,9%). Cet anticorps anti-CSP tait donc un excellent candidat pour lobtention de moustiques transgniques qui seraient altrs dans leur habilet transmettre le parasite. Il a t galement montr que la phospholipase A2 du venin dabeille (PLA2) inhibe fortement la formation doocystes, probablement en interfrant avec linvasion des ookines de lpithlium de lintestin moyen (Gosh et al., 2002). En se basant sur ces observations, un gne contenant le promoteur de la carboxypeptidase de Anopheles gambiae et la squence signal actionnant lexpression de PLA2 a t construit (AgCP[SM1]4). Ce gne a t introduit dans le transposon Piggybac et transform dans Anopheles stephensi. Quand les moustiques transgniques et non-transgniques se sont nourrit sur la mme souris infecte par Plasmodium berghei, la formation des oocystes dans les moustiques transgniques a t inhibe entre 77 et 99% dans les cinq expriences menes indpendamment. Pour valuer leffet de lexpression du transgne (AgCP[SM1]4) dans le dveloppement du parasite, des moustiques contrles et transgniques ont t mis en prsence de la mme souris infecte au mme moment et le nombre doocytes forms a t mesur. Dans neuf expriences, linhibition de la formation des oocytes varie entre 68,7 et 95,2% soit une moyenne de 81,6%. La capacit vectorielle du moustique transgnique est donc svrement altre. Les premires observations fates nont pas mis en vidence que le transgne imposerait un poids significatif la fitness du moustique. Un autre gne a t construit en mettant le ttramre [SM1]4 sous le contrle du promoteur de la vitellognine et dun peptide signal dans Anopheles stephensi (Vg[SM1]4). Celui-ci prsenterait de multiples vnements dintgration. Les premiers rsultats ont indiqu que linvasion des sporozotes dans les glandes salivaires serait fortement inhibe dans les moustiques recombinants. Au vu de cette tude sur de nombreux rsultats prometteurs, la forte rduction de la capacit des moustiques transmettre la malaria est possible. Il serait galement possible de combiner plus dun transgne (cest--dire AgCP[SM1]4 et Vg[SM1]4) dans le mme

106

moustique, ce qui produirait un moustique qui serait presque compltement rfractaire la transmission du parasite. 3. Actions sur le systme immunitaire dAnopheles gambiae Andrea Crisnati et ses collgues de lImperial College de Londres, travaillent sur les manipulations gntiques qui dirigent le systme immunitaire de Anopheles gambiae contre Plasmodium falciparum. Une fois que la meilleure cible sera identifie, lobtention dun moustique transgnique pourra se concrtiser. Un moustique transgnique qui rsisterait linfection aurait un systme immunitaire ayant le potentiel de tuer les parasites de la malaria diffrents stades de leur dveloppement. En parallle aux tudes sur la rponse immunitaire du moustique, il y a des tudes gntiques qui sont faites sur les approches de localisation et didentification des gnes impliqus dans la rponse immunitaire. Plusieurs gnes qui dterminent la diffrence entre une ligne sensible et une slectionne pour tre rfractaire au parasite ont t localiss dans le gnome du moustique. Une approche prometteuse en ce moment est la transformation dun moustique avec des gnes lis des transposons. Plusieurs dentre eux sont actuellement capable de transformer des moustiques de type Anophles. Les modles basiques de gntique des populations montrent quun transposon peut se propager pour se fixer si le transposon cr suffisamment de drive gntique cest--dire si le transposon est transmis la descendance avec une probabilit suprieure aux 50% de la sgrgation mendlienne (Bote et al., 2002). Cependant, les systmes de transposons connus actuellement chez les moustiques semblent montrer une sgrgation mendlienne de linsert transgne et donc de ne donneraient pas dinformation sur la drive gntique. 4. Etudes sur les lments transposables Avec laide apporte par le squenage du gnome du moustique, les chercheurs vont pouvoir affiner les recherches dj en cours sur les lments transposables, qui reprsentent 16% du gnome. Cest lquipe de Tu qui soccupe principalement de ltude de ces lments (Tu et al., 2001). En plus dtre utiliss pour introduire de nouveaux gnes dans le gnome du moustique, en tant que gnes qui bloquent la transmission de la maladie lintrieur du moustique en stoppant le cycle du parasite, ils peuvent galement tre utiliss comme marqueurs pour faire la distinction entre deux populations de moustiques de la mme espce.
107

Ces marqueurs aideraient donc faire la diffrence entre les populations qui sont plus ou moins rsistantes la maladie si ces diffrences stablissent sur une base gntique. Lquipe de Tu travaille sur trois types dlments transposables : des rptitions non terminales (non-LTR), des courtes squences dlments rpts et parsems (SINEs) et des lments transposables miniatures rpts et inverss (MITEs) chez Anopheles gambiae. Les non-LTR et les SINEs sont des lments transposables de lARN. Les MITEs sont des lments transposables de lADN. Par lutilisation de programmes informatiques, ils ont dcouvert de nouvelles familles et les ont caractrises. En regardant le gnome entier, ils essaient de voir combien de non-LTR, de MITEs et de SINEs sont prsents, comment ils sont distribus et comment ils peuvent les utiliser comme outils gntiques. Les systmes dintroduction des gnes prsentent un hasard potentiel car ils peuvent gnrer des phnotypes inattendus et peuvent amener des effets cologiques nuisibles. Les transposons autonomes peuvent augmenter le taux de mutation par de multiples insertions travers le gnome, amenant des altrations dans la biologie des espces cibles mais qui ntaient pas prvues. Les manipulations gntiques sur les moustiques pourraient permettre denvisager la substitution des populations naturelles par des populations transgniques. Les tudes de laboratoire peuvent dans un premier temps valuer la stabilit, les contraintes de fitness et la scurit des modifications gntiques. Il faudrait que les expriences avancent sur les gnes qui vont tre utiliss dans un environnement contrl qui imite la nature le plus possible. On observe trois catgories principales de stratgies de contrle gntique testes sur le terrain. La premire est le dveloppement doutils dingnierie gntique pour tre utilis avec les vecteurs. La seconde est lidentification des gnes efficaces qui pourraient bloquer la transmission, et la troisime est le dveloppement de mthodes efficaces pour conduire ces gnes efficaces se fixer dans les populations naturelles de vecteurs. Les deux premires ont largement t ralises avec la transformation de lignes germinales et des constructions gntiques qui ont rduit significativement la comptence du vecteur dans les modles exprimentaux de malaria. Il ny a cependant pas de progrs faits dans le dveloppement de mthodes pour amener les gnes dsirs dans les populations sauvages et spcialement pour assur le lien entre le systme qui va introduire le gne et le gne lui-mme. 5. Les limites des moustiques transgniques

108

Pour connatre la propagation et la stabilit des transgnes introduits, des tudes sur lcologie des moustiques gntiquement modifis doivent tre faites (Scott et al., 2002). Les cologistes ont besoin dtudier le flux de gnes (en insistant sur les patterns daccouplement et le comportement reproductif), les tailles et la structure des populations, les mcanismes de rgulation, les changes gntiques entre populations voisines et la fitness, et les effets phnotypiques de la colonisation. Le succs dpendrait de la comprhension des groupes de moustiques qui participent la reproduction et qui sont importants pour la propagation du transgne. Les effets bnfiques des transgnes rsistants introduits peuvent tre annuls cause de moustiques non transforms qui continueraient transmettre les parasites. La rgulation de la taille des populations peut tre au dtriment ou bnfique pour la stabilit et la propagation des transgnes. La probabilit quun transgne puisse tre conduit par des moustiques gntiquement modifis dans les populations sauvages peut dpendre de la balance entre la solidit et la fidlit du mcanisme dintroduction et de la rduction de la fitness dans les populations de laboratoire. Un des thmes les plus important est la reconnaissance des stratgies de contrle associant les Organismes Gntiquement Modifis (OGM) qui peuvent potentiellement provoquer de srieuses mfiances de la part du public (Alphey et al., 2002). Cependant, la production dOGM avec lintention dtre destine la sant humaine peut tre perue plus favorablement par le public que la production dOGM pour la recherche agronomique et lagriculture. La plus grande limitation scientifique est limportance des tudes cologiques et des tudes de gntique des populations sur des populations potentiellement cibles. Parce que la biologie des populations de vecteurs sur chaque site doit tre tudie de nombreuses annes avant que les essais sur le terrain ne soient dcids, la communaut ne peut tudier diffrents sites successivement. La ncessit dtudes sur le terrain se fait de plus en plus sentir. Certains proposent des aires comme laboratoire naturel dtude. Il y aurait ainsi une aire au Kenya appele Malariasphere , une gigantesque maison verte qui pourrait devenir un terrain de test appropri (Clarke, 2002). Elle est couramment utilise dans les tudes de dynamique des populations dAnopheles gambiae et dans leur habilit transmettre la maladie. Une autre ide serait les les Hawa ; il y a en effet le Culex quiquefasciatus qui transmet une forme de malaria aux oiseaux. La rsistance transgnique de Culex quiquefasciatus pourrait aider pour les tester les nombreuses inconnues cologiques et en mme temps, tirer un avantage de lexcellente infrastructure scientifique (qui nexiste pas dans les rgions atteintes par Plasmodium falciparum). La richesse des informations sur la dynamique cologique des populations
109

dAnopheles gambiae qui peuvent tre obtenues par la recherche pourra tre prcieuse pour renseigner sur les autres efforts pour combattre la malaria en sattaquant ses vecteurs. Le passage du laboratoire au terrain reste quand mme un obstacle avec ses incertitudes cologiques. Il va en effet falloir prvoir le risque dapparition de souches de parasites encore plus agressives et slectionnes par les barrages pour ces moustiques transgniques. Cette valuation est difficile tant donn la diversit des moustiques et des parasites et de leur volution rapide. Des tudes donnent des informations sur la relation entre le EIR (taux dinoculation entomologique) et la mortalit (Scott et al., 2002). Le EIR est le nombre de moustique contenant des sporozotes qui piquent une personne par unit de temps. En prenant lexemple de la Tanzanie du Sud, le risque dinfection augmente avec lEIR quand les infections concernent des personnes faibles. Quand les infections sont fortes, la transmission devient sature et laugmentation de lEIR nlve pas la parasitose chez les bbs. Quand la transmission est faible, leffet rebond peut tre vit. Parce que les infections primaires chez les adultes causent des maladies plus svres que chez les enfants, il peut rsulter de la rduction de densit du vecteur long terme, une transmission de la malaria instable et une pidmie qui ne serait pas anticipe et qui augmenterait au niveau des maladies primaires chez les adultes. Parce que la malaria dans les lieux donns est toujours transmise par plusieurs espces de moustiques, si une forme ou espce est rendue rfractaire alors les autres transmettront toujours les parasites. Pour promouvoir la propagation des transgnes, il faut analyser les effets possibles sur la sant humaine si lapplication des insecticides est interrompue aprs le lcher des moustiques transgniques. Dautres obstacles potentiels pour contrler la malaria et rduire sa prvalence dans les populations humaines sont prsents. Dune part, la propagation et lefficacit des gnes dans les populations naturelles ainsi que la rponse volutive du parasite. Si cest possible de contourner ces obstacles, cela requiererait que la recherche actuelle sur les moustiques transgniques soit largie pour inclure lcologie volutive de la rsistance. 6. Les consquences possibles dintroduction de moustiques transgniques De nombreuses consquences sont alors envisager. Les transgnes qui rduisent la fitness de lhte peuvent tre relis aux mcanismes de conduite et donc tre limin par slection. Au niveau des transposons, il existe des piges potentiels qui doivent tre pris en compte. Un transposon saute lintrieur du gnome, il peut donc perturber les autres gnes avec des rsultats qui ne sont prdictibles. Changer les relations entre le moustique et le parasite
110

peut avoir des impacts cologiques inattendus. Le transposon pourrait en effet donner la capacit au moustique de transmettre dautres maladies. Si des gnes striles sont utiliss pour liminer Anopheles gambiae, quelles autres espces, qui seulement occasionnellement piquent les humains, sinstalleront et les remplaceront ? Le parasite pourra alors sadapter rapidement un autre vecteur pour continuer son cycle de vie. De nombreuses questions sont galement souleves par lutilisation de ces moustiques gntiquement modifis (Clarke, 2002 ; Scott et al., 2002 ; Enserink, 2002 ; Bote et al., 2002). Par exemple, est-ce que le moustique sera capable de saccoupler aux femelles sauvages ? Quand il y a des souches multiples de malaria dans une rgion, une absence de la protine pourra-t-elle bloquer la transmission sous toutes ses formes ? Le moustique modifi va-t-il dvelopper une rsistance ? Que prendre comme terrain dessai pour que lexprience nchappe au contrle des scientifiques ? Comment les gnes codant pour que les moustiques soient rsistants pourront tre efficaces dans les conditions naturelles ? Comment sassurer que le moustique transgnique va compltement sinfiltrer dans la population sauvage ? Est-ce que les modifications apportes vont tre stables ? Quelles vont tre les implications de sant publique si ce schma a seulement un succs partiel ? Devant de telles questions, il est urgent de dvelopper des procds uniformes pour soccuper des issues thiques, lgales et sociales relevant de la technologie des moustiques gntiquement modifis. En plus du remplacement des populations, des stratgies gntiques pour la rduction des populations de moustiques dans des aires urbaines mriteraient considration. De tels propos ncessitent une collaboration entre cologistes et gnticiens molculaires, ainsi que le besoin de fonds financiers adquats. Rpondre aux questions prcdemment cites peut prendre des annes de recherche de laboratoire et de terrain. Certains scientifiques disent quil faudrait dpenser plus pour les autres approches du contrle de la malaria. Dans les deux dernires annes, les gnticiens, entomologistes mdicaux et experts de la sant publique se sont rencontrs trois fois pour discuter de la recherche qui pourrait tre demand sil y avait crer un futur sans malaria travers le lcher de moustiques rsistants. Il faut enfin considrer les problmes logistiques comme le traitement rgulier de vastes aires de rgions trs pauvres, et les problmes stratgiques comme laprs traitement linsecticide, les niches biologiques qui supportent la croissance dune large population de moustiques rests intacts en favorisant donc la recolonisation.

111

POLEMIQUES LIEES AU SEQUENCAGE

112

"Un ou deux gnomes nradiqueront pas le paludisme"

(Titre emprunt lhebdomadaire Courrier International du 24 octobre 2002) Le paludisme tue chaque anne entre 1,7 et 2,4 millions de personnes, le plus souvent en Afrique Subsaharienne. On estime 300 millions le nombre de cas cliniques associs cette maladie. Lune des dernires avances dans la lutte contre ce flau a t de squencer les gnomes des 3 organismes impliqus : Plasmodium falciparum, Anopheles gambiae, et lhomme. Certes, la publication de ces squences gntiques va apporter beaucoup dans la comprhension de la maladie, dans la biologie du moustique, de son parasite et cela va ouvrir des portes vers de nouveaux moyens de lutte. En ce sens, le squenage est essentiel. Mais on est galement en droit de se poser la question : largent inject dans ces programmes naurait-il pas t plus utile ailleurs, et surtout est-ce que la connaissance de ces squences va apporter des solutions prcises et court terme dans la lutte contre le paludisme ? Ny a-t-il pas un risque que comme pour le SIDA, des mdicaments restent ltat de test et quaucune entreprise pharmaceutique naccepte de les commercialiser, sous prtexte que le march nest pas assez rentable, car se situant en Afrique ? De mme, largent investi dans la lutte contre la malaria (environ 200 millions deuros chaque anne) est-il suffisant au regard du nombre de victimes, quand dans le mme temps plusieurs centaines de millions deuros sont investies dans la recherche contre le SIDA? Le Medecines for Malaria Venture (MMV), bas Genve, travaille depuis 5 ans au dveloppement de nouveaux mdicaments. Les rsultats sont excellents et lheure actuelle, 7 mdicaments ont pu tre mis au point tandis que 5 projets de dveloppement sont en route. Et pourtant, le MMV ne reoit que 15 millions deuros par an, dont 5 millions rien que de la part de Bill Gates Ce dernier a galement financ hauteur de 50 millions deuros un programme de recherche sur de nouveaux vaccins au Malaria Vaccine Initiative, Rockville. Sur ces 2 exemples, il est clair que les pouvoirs publics sont peu mobiliss et que la recherche sur la malaria ne doit sa survie quaux dons. LOMS, lors dune rcente tude a calcul que pour contrler la malaria, il faudrait au bas mot 2,5 milliards deuros dici 2007, ce qui est loin dtre le cas lheure actuelle. La publication des 3 squences va apporter un nombre de donnes considrables et il faudra beaucoup de temps et dargent pour en extraire toutes les informations utiles. Certains

113

scientifiques voudront ds lors sinvestir dans la recherche de nouveaux mdicaments alors que dautres voudront amliorer les moyens de lutte sur le terrain dj existants, comme les moustiquaires imprgnes dinsecticides. De nombreux centres de recherches craignent que le temps de convertir les nouvelles donnes en vaccins efficaces soit beaucoup trop important. Entre 1975 et 1996, prs de 1300 mdicaments ont t mis au point et seulement 3 concernaient la malaria (Trouiller et al.,1999). Et lheure actuelle, les scientifiques travaillent sur de nouveaux mdicaments issus uniquement de 3 familles : quinolines, antifolates, artemisines (dont seule la dernire ne prsente pas encore de rsistance). Et mme si les perspectives de nouveaux traitements sont plutt bonnes avec notamment la fosmidomycine, un inhibiteur de la voie synthtique des acides gras chez Plasmodium (qui est en phase exprimentale), il est peu probable quun vaccin soit dcouvert dans les annes venir. Il y a un manque cruel de subventions et les chercheurs nont mme pas les moyens de tester les antignes quils connaissent ce jour, alors si lon ajoute les retombes du squenage Dailleurs certains ont un avis tranch sur le squenage : "Si nous avions 100 millions de dollars supplmentaires dpenser pour la recherche dun vaccin antipaluden, jen consacrerais trs peu ltude du gnome du parasite" dit Adrian Hill, de lUniversit dOxford, qui considre que lavenir est dans le renforcement du systme immunitaire de lhomme aux antignes de Plasmodium falciparum. Un autre chercheur va mme plus loin : "Si lon dpensait plus dargent mettre au point les vaccins potentiels, au lieu de se concentrer sur le gnome, je crois que lon sauverait davantage de vies." Dun autre cte, certains considrent que la connaissance du gnome est essentielle pour trouver de nouveaux points faibles chez Anopheles et chez Plasmodium et viter de dvelopper exprimentalement des mdicaments coteux qui nont aucune chance dtre commercialiss. En plus, il existe un srieux problme de communication : "Les scientifiques des pays dvelopps qui tudient la gnomique ne travaillent gnralement pas en collaboration avec les scientifiques des aires impaludes et avec les institutions locales" dclare Gerald Keusch, le directeur du Centre international de sant Fogarty, Bethesda. "Pour que la promesse du gnome du parasite se ralise, il faut favoriser la confiance, la transparence et la collaboration avec les institutions des pays dans lesquels les fruits de la recherche du paludisme et sur le gnome du moustique seront utiliss". Certains chercheurs regrettent galement quaucun pays en voie de dveloppement nait t inclus dans un des 3 programmes de squenage, car mme si leurs infrastructures sont moins dveloppes, ils auraient aisment pu participer lanalyse des donnes, ce qui aurait acclrer le processus. Ces derniers sont dailleurs en train de rattraper petit petit leur retard,
114

limage de lAfrique du Sud qui va construire un centre de recherche de plus de 40 millions deuros. Il existe donc de nombreuses polmiques sur lintrt dun tel squenage et surtout sur les applications directes qui en dcouleront. Anne Mills, membre de la Commission sur la Macroconomie et la Sant lOMS, dclare ce sujet : "Pendant que les scientifiques en sciences biomdicales et que les experts en sant publique dbattent des intrts dinvestir dans les gnomes ou de lapplication des mthodes de lutte actuelle, ce qui manque vraiment cest largent"

115

LIMITES DE LA SCIENCE POUR LUTTER CONTRE LE PALUDISME

116

La lutte globale contre la malaria a dbut dans les annes 50 et sest avre trs efficace : lpidmie a t srieusement rduite dans des dizaines de pays travers la plante. Mais tout le monde saccorde dire aujourdhui quune radication complte de la maladie nest pas possible, tout du moins lheure actuelle. Cependant, il semble essentiel de remettre en place un effort de lutte lchelle de la plante pour une efficacit optimale. Jeffrey D. Sachs, dans larticle publi dans Science donnent 3 raisons principales cela : Labandon des efforts a permis une rsurgence de la maladie dans les pays les plus pauvres qui payent le prix fort en terme de vie, notamment en Afrique o lon trouve prs de 90% des victimes. De plus, lutilisation systmatique des mmes mdicaments et insecticides ont permis le dveloppement de rsistances chez le moustique et chez le parasite. Les avances rcentes comme la publication des squences dAnopheles gambiae et de Plasmodium falciparum ouvrent la voie pour des mdicaments alternatifs, qui pourraient contourner les mcanismes de rsistance. De nouveaux programmes de lutte globale ont t mis en place rcemment (Roll Back Malaria, Multilateral Initiative on Malaria), et prouvent ainsi limplication des pays industrialiss pour les pays les plus durement touchs par le paludisme. La lutte sest ralentie avec lapparition des premires rsistances aux DDT, qui mme sil devenait moins efficace, permettaient de limiter la transmission du parasite. En effet, jamais cette poque le nombre de morts na r-atteint les taux davant le DDT. Une autre raison essentielle dans le problme pour radiquer la malaria est dordre politique. En effet, tant que la maladie tait prsente dans les pays dvelopp (Europe, ExURSS, Amrique latine), les campagnes de prventions se multipliaient. Une fois ces zones "scurises", les pays qui faisaient des recherches sur le paludisme et qui avaient les moyens de mettre au point des mdicaments efficaces ont peu peu abandonn leurs travaux. A cela sest ajout une forte diminution des crdits octroys par les gouvernements et les institutions nationales (Banque Mondiale, FMI) aux pays pauvres, dj en crise cette poque. Heureusement, lheure actuelle ces derniers reoivent de plus en plus daide, surtout dans les rgions o une activit conomique est dveloppe, attirant ainsi les investisseurs. Les gouvernements ont fait des choix dans la rpartition de leur aides technologiques, en dfaveur des pays africains le plus souvent et les grandes socits pharmaceutiques ont interrompu leurs

117

programmes de recherche au dbut des annes 80. Il nexiste aujourdhui aucune entreprise pharmaceutique qui ait un programme de recherche concernant la malaria. Cependant, le MMV (Medecine for Malaria Vanture) prvoit de dvelopper de nouveaux mdicaments anti-paludiques tous les 5 ans, pour un cot avoisinant les 150 millions deuros, alors que les scientifiques saccordent dire que 1 milliard deuros serait ncessaire. On voit donc bien que le problme principal reste largent, et surtout la manire dont il est reparti entre les diffrentes maladies. Le programme Roll Back Malaria a t cr pour aider mieux rpartir les fonds entre les programmes de recherche et de dveloppement, les moyens de lutte sur le terrain, et la fabrication des mdicaments anti-paludiques. Tout est donc une question de volont et de beaucoup dargent, mais le prix payer nest pas comparable au nombre de morts que lon pourrait viter.

118

PERSPECTIVES DANS LA LUTTE CONTRE LE PALUDISME

119

Les gnomes du parasite de la malaria Plasmodium falciparum et de son vecteur Anopheles gambiae ont t squencs dans le but den apprendre plus sur leur mode de vie et avec lespoir que ces gnomes nous rvlent des cibles potentielles pour les mdicaments. Pendant plus dun sicle, un des objectifs des programmes de contrle de la malaria tait de bloquer la transmission du parasite par les moustiques. Ces approches ont t bnfiques pour la comprhension de la biologie du moustique et des intractions entre le moustique et Plasmodium falciparum. Que va-t-on tenter de dvelopper partir du squenage de ces organismes (Pennisi, 2002 ; Morel et al., 2002 ; Malaria after the genome, 2003 ; Wirth, 2002 ; De Gregorio et al., 2002 ; Hoffman et al., 2002 ; Bowman et al., 2002 ; Walgate 2003) ? Pourquoi avoir squenc le gnome du parasite ? Tout dabord pour en apprendre plus sur le fond. En effet, le parasite a un cycle de vie compliqu, avec des tapes chez le moustique et chez lhomme. Une des caractristiques les plus curieuses dans les stades chez lhomme est la rponse immunitaire humaine ; il y a une forte activit immunitaire, mais elle ne contrle pas efficacement linfection, ne fournissant pas les moyens de protection contre des futures infections. De nombreuses personnes sont atteintes par la malaria, dautres ont le risque dtre infectes, des millions denfants en meurent et celles qui survivent le font par une combinaison danmie et dimmuno-suppression qui les rendent plus vulnrables dautres maladies. En plus du dveloppement de rsistances aux mdicaments, tout ceci souligne le besoin de trouver des nouveaux traitements contre la malaria et de nouvelles voies de prvention. Le projet de squenage du gnome a t conu dans ces buts. Les chercheurs travaillant sur la malaria ont une opportunit sans prcdent pour trouver des gnes qui sont potentiellement uniques, ou trs fortement diffrents, pour comparer Plasmodium falciparum dautres espces. Ces gnes pourraient devenir de bonnes cibles pour les mdicaments avec moins de risques deffets secondaires. Bien avant que la totalit du gnome ne soit squence, de nouvelles cibles de mdicaments ont t identifies par des recherches sur des donnes de squences de gnes uniques partiellement assembles. Mais la squence totale va donner une image plus complte du fonctionnement interne du parasite et une chance didentifier des aspects vulnrables. Quels sont ces points faibles potentiels ? Et que vont-ils dcouvrir sur les moyens du parasite djouer la rponse immunitaire humaine ? Une caractristique notable du gnome du parasite est labsence apparente de gnes codant pour des protines, qui sont la cl du mtabolisme dans les autres espces. Le nombre de gnes prdits (environ 10%) codant des protines associes lapicoplaste est intressant. Ce compartiment cellulaire essentiel est connu pour tre important dans la biosynthse dacides gras et disoprnoides, composants de nombreuses protines de membrane, et du mtabolisme
120

du fer. Mais les analyses de ces gnes peuvent rvler dautres fonctions possibles, et donc de nouvelles cibles de mdicaments. La squence gnomique a dj permis lidentification de molcules de lapicoplaste qui sont des cibles de plusieurs mdicaments existants. Pendant son cycle de vie, Plasmodium falciparum subit plusieurs changements dans son dveloppement. Un des plus spectaculaires est la diffrentiation sexuelle et la formation des gamtes mles et femelles. Les tudes du protome sur ces stades ont mis jour une question fondamentale : comment le parasite rgule les niveaux de ces protines ? Le gnome code pour relativement peu de protines qui contrlent la transcription des gnes en ARN messager. De plus, il semble y avoir peu dlments rgulant la transcription dans le gnome, ou au plus, il y a peu dlments qui sont connus dans dautres organismes. Ces tudes du protome ont dj montr que les protines impliques dans les processus dARN messager et de synthse de protines (traduction) sont exprimes dans des proportions plus importantes au niveau des gamtocytes, particulirement dans les gamtocytes femelles, quau niveau des autres stades. Curieusement, des protines qui sont prsentes dans chaque zygote semblent tre absentes dans les gamtocytes, alors que les ARN messagers codant ces protines sont abondamment prsents. Tout ceci est cohrent avec lhypothse selon laquelle la rgulation des niveaux de protines est contrle travers les processus dARN messagers et de translation, plus que par la transcription du gne. Peut-tre est-ce une caractristique gnrale du parasite et donc une autre cible potentielle pour les mdicaments ? De plus, une des tudes du protome a rvl des groupes de gnes o la rgulation apparat tre coordonne. Quelques gnes exprims simultanment sont regroups dans le gnome ; la comparaison de ces gnes et de leurs squences flanquantes peut fournir plus dinformations pour connatre leurs modes de rgulation. Enfin, les extrmits des chromosomes de Plasmodium sont trs particulires. Il y aurait une famille de gnes (tels que les gnes var).Ceux-ci coderaient pour des protines de surface qui interagissent avec le systmes immunitaire humain. Mais, elles saltrent frquemment, ce qui permet au parasite dchapper laction immunitaire. Ltude du gnome du parasite peut rvler beaucoup dinformations sur la faon dont Plasmodium falciparum interagit avec ses htes et porteurs, et sur les gnes qui sont impliqus dans la reconnaissance du parasite par le systme immunitaire humain. Dcoder linformation dans ces gnomes et la transcrire en remdes efficaces est la fois un challenge et une opportunit pour la communaut scientifique.

121

Le gnome dAnopheles gambiae fournit un chafaudage architectural pour cartographier, identifier, slectionner et exploiter des gnes dinsectes vecteurs. Cela va favoriser la connaissance de la biochimie, de la physiologie et du comportement du moustique dans lpidmie de la malaria, et peut stimuler le dveloppement de nouvelles interventions de sant publique. De plus, la squence complte du gnome peut acclrer lingnierie des moustiques rsistants au Plasmodium et dvelopper des mthodes pour amener ces gnotypes se fixer dans les populations sauvages (cf. fig. 1). Cela peut dj mettre jour les mcanismes molculaires des rsistances aux insecticides, stimulant le dveloppement de nouvelles gnrations dinsecticides. Lidentification de nouveaux gnes peut amliorer la connaissance de la biologie du vecteur, des comportements de reproduction, des piqres et des rponses immunitaires contre le Plasmodium et autres pathognes. Cribler lactivit des insecticides contre des cibles gnomiques spcifiques au lieu des insectes est maintenant faisable et peut acclrer le dveloppement de nouveaux insecticides et insectifuges. La squence du gnome dAnopheles gambiae a t compare celle de Drosophila melanogaster car ils sont dans le mme ordre taxonomique : les Diptres. Ils ont cependant des styles de vie diffrents et des habitats environnementaux distincts. Les insectes ont un systme immunitaire efficace pour combattre les pathognes quils rencontrent. Trouver comment Anopheles rpond linfection de Plasmodium est essentiel pour obtenir des cls dans le contrle de la malaria. Les profils dexpression de quelques gnes immuns dAnopheles gambiae suggrent que le moustique montre des rponses immunitaires spcifiques adaptes diffrents types de pathognes. La disponibilit de la squence entire dADN associe aux outils tels que les puces ADN peuvent faire dAnopheles un puissant modle pour tudier la biologie des insectes. Les donnes du gnome peuvent dj aider dvelopper des stratgies de lutte contre la malaria. Quelques stratgies peuvent inclure la rduction du nombre et de la dure de vie des moustiques infects, en analysant ce qui les attire chez les hommes, et limiter la capacit des parasites se dvelopper dans linsecte vecteur. Les efforts les plus spcifiques dans ce projet sont focaliss sur les tissus du moustique avec lesquels le parasite interagit, incluant lintestin moyen, les hmaties, les graisses et les glandes salivaires, ou sur les gnes exprims dans les tissus tels que la tte et les antennes qui peuvent servir dintermdiaire aux comportements de slection de lhte et de reproduction. Le prochain challenge est dinventer des stratgies de conduite efficace et permettre des gnotypes rsistants stables de se maintenir dans les populations sauvages de moustiques.

122

Les informations apportes par le squenage des gnomes peuvent aider dans lidentification des gnes et des chemins impliqus dans la transmission, la phatognicit et les rponses aux mdicaments. Ce combat ne peut videmment se faire que si des fonds financiers et des structures internationales le permettent. La malaria est caractrise par un jeu trs complexe dintractions entre le parasite, le vecteur et lhte. Maintenant que les gnomes des trois acteurs ont t squencs avec succs, lre post-gnomique pour combattre cette redoutable maladie peut rellement commencer.

Fig. 1 : les perspectives du squenage du gnome dAnopheles gambiae

123

INTRODUCTION
Bischoff, E. (2001), Etude de deux membres de la superfamille multigenique Pf60/var de Plasmodium, exprim par codage traductionnel programm, Thse, Prambule. Greenwood, B. and T. Mutabingwa (2002), Malaria in 2002, Nature 415, 670-672. Hastings, I. M., Bray, P. G. and S. A. Ward. (2002), A requiem for Chloroquine, Science 298, 74-76. Hemingway, J., Field, L. and J. Vontas (2002) An overview of insecticide resistance, Science 298, 96-98. Martin, P. H and M. G. Levebvre (1995), Malaria and climate : sensitivity of Malaria potential transmission to climate, Ambio 24, 200-207. Poser, C. M., Bruyn, G. W. (1999), Illustrated history of malaria. ISBN 1-85070-068-0. Richie, T. L. and A. Saul (2002), Progress and challenges for malaria vaccines, Nature 415, 694-699. Ridley, R. G. (2002), Medical need, scientific opportunity and the drive for anti-malaria drugs, Nature 415, 686-693. Vogel, G. (2002), An elegant but imperfect tool, Science 298, 94-95. Vogel, G. (2002), In Pursuit of a killer, Science 298, 87-89. http://www.asnom.org http://www.medias.obs http://www.snof.org http://www.rbm.who.int http://www.rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria Encyclopaedia universalis : Le paludisme.

PRESENTATION BREVE DES COMPLEXE PARASITAIRE

TROIS

PARTENAIRES

DE

CE

Abderrazak, S. B., Oury, B., Lal, A. A., Bosseno, M. F., Force-Barge, P., Dujardin, J.-P., Fandeur, T., Molez, J. F., Kjellberg, F., Ayala F. J. and M. Tibayrenc (1999). Plasmodium falciparum : Population Genetic Analysis by Multilocus Enzyme Electrophoresis and Other Molecular Markers. Experimental Parasitology 92, 232-238. Budiansky, S., (2002). Creatures of Our Own Making. Science 298, 80-86.

124

Coluzzi, M., (2002). Plasmodium falciparum en Afrique subsaharienne. Annales de lInstitut Pasteur Vol.13, 81-99. Fleury, H., (2003) Les moustiques anophles vecteurs du paludisme. La lettre de lInstitut Pasteur N 40, 5. Hughes, A. L. and F. Verra (1998). Ancient Polymorphism and the Hypothesis of a Recent Bottleneck in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Genetics 150, 511-513. Manguin, S. and M. Boussinesq (1999). Apport de la tldtection en sant publique: lexemple du paludisme et autres perspectives. Md Mal Infect 29, 318-324. Manguin, S., Fontenille, D., Chandre, F., Lochouarn, L., Mouchet, J., Kengne, P. and P. Guillet (1999). Gntique des populations anophliennes. Bull Soc Pathol Exot, 92, 4, 229-235. Martin, P. H. and M. G. Lefebvre (1995). Malaria and Climate: Sensitivity of Malaria Potential Transmission to Climate. Royal Swedish Academy of Sciences Vol 24, No 4, 200-207. Okanda, F. M., Dao, A., Njiru, B. N., Arija, J., Akelo, H. A., Tour, Y., Odulaja, A., Beier, J. C., Githure, J. I., Yan, G., Gouagna, L. C., Knols, B. G. J. and G. F. Killeen (2002). Behavioural determinants of gene flow in malaria vector populations: Anopheles gambiae males select large females as mates. Malaria journal 1, 10. Rich, S. M., Licht, M. C., Hudson, R. R. and F. J. Ayala (1998). Malarias Eve: Evidence of a recent population bottleneck throughout the world populations of Plasmodium falciparum. PNAS Vol. 95, issue 8, 4425-4430. Rihet, P., (2002). Prdisposition gntique au paludisme. Annales de lInstitut Pasteur Vol.13, 65-80. Tibayrenc, M., (1997). Genetic epidemiology of parasitic protozoa and other infectious agents: the need for an integrated approach. International Journal for Parasitology 28, 85-104. Tibayrenc, M., (1999). Toward an Integrated Genetic Epidemiology of Parasitic Protozoa and Other Pathogens. Annu. Rev. Genet. 33, 449-477. Torre, A. della, Costantini, C., Besansky, N. J., Caccone, A., Petrarca, V., Powell, J. R. and M. Coluzzi (2002). Speciation Within Anopheles gambiae-the Glass Is Half Full. Science, 298, 115-117. Waters, A. P., Higgins, D. G. and T. F. McCutchan (1993). Evolutionary Relatedness of Some Primate Models of Plasmodium. Mol. Biol. Evol. 10, 914-923. http://rph.wa.gov.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.html http://www.medinfos.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.shtml http://www.med.univ-angers.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie/palu.pdf

125

EXPLORATION DU POLYMORPHISME GENETIQUE DES PARTENAIRES DE CETTE TRIADE AVANT LE PROJET DE SEQUENCAGE
Barnwell, J. W., Asch, A. S., Nachman, R. L., Yamaya, M., Aikawa, M. and P. Ingravallo (1989). A human 88-kD membran glycoprotein (CD 36) function in vitro as a recepetor for a cytoadherence ligand on Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J.Clin.Invest. 84, 765772. Berendt, A. R., Simmons, D. L., Tansey, J., Newbold, C. I. and K. Marsh (1989). Intercellular adhesion molecule-1 is an endothelial cell adhesion receptor for Plamsodium falciparum. Nature 341, 57-59. Bir Singh Sidhu, A., Verdier-Pinard, D. and D. A., Fidock (2002). Chloroquine resistance in Plasmodium falciparum malaria parasites conferred by pfcrt mutations. Science 298, 210-212. Black, C. G., Wu, T., Wang, L., Hibbs, A. R. and R. L. Coppel (2001). Merozoite surface protein 8 of Plasmodium falciparum contains two epidermal grouth factor-like domains. Mol. Biochem. Parasitol. 114, 217. Borre, M. B., Dziegel, M., Hogh, B.,Petersen, E., Rieneck, K., Riley, E., Meis, J. F., Aikawa, M., Nakamura, K., Harada, M., Wind, A., Jakobsen, P. H., Cowland, J., Jepsen, S., Axelsen, N., H. and J. Vuust (1991). Primary structure and localization of a conserved immunogenic Plasmodium falciparum glutamate rich protein (GLURP) expressed in both the preerythrocytic and erythrocytic stages of the vertrebate life cycle. Mol.Biochem.Parasitol. 49,119 1991. Butler, D., (2002). What difference does a genome make? Science 298, 426-428. Cowman , A. F.and B. S. Crabb (2002). The Plasmodium falciparum genome--a blueprint for erythrocyte invasion. Science 298, 126-128. Cowman, A. F., Saint, R. B., Coppel, R. L., Brown, G. V., Anders, R. F. and D. J. Kemp (1985). Conservedsequences flank variable tandem repeats in two S-antigen of Plasmodium falciparum. Cell 40,775-783. Dame, J. B., Williams, J. L., McCutchan, T. F., Weber, J. L., Wirtz, R. A., Hockmeyer, W. T., Lee Maloy, W., David Haynes, J., Schneider, I., Roberts, D., Sanders, G. S., Premkumar Reddy, E., Diggs, C. L. and L. H. Miller (1984). Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen on the sporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science, 225, 593-599. Dame, J. B., Williams, J. L., McCutchan, T. F., Weber, J. L., Wirtz, R. A., Hockmeyer, W. T., Maloy, W. T., Haynes, J. D., Schneider, I., Roberts, D., Sanders, G. S., Reddy, E. P., Diggs, C. L. and L. H. Miller (1984). Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen on the sporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum, Science 225, 593-599.

126

Dimopoulos G., Richman A., Mller H. M. and F. C. Kafatos (1997). Molecular immune responses of the mosquito Anopheles gambiae to bacteria and malaria parasites, PNAS 94, 11508-11513. Dimopoulos, G., Seeley, D., Wolf, A. and F. C. Kafatos (1998). Malaria infection of the mosquito Anopheles Gambiae activates immune-responsive genes during critical transition stages of the parasite life cycle. The EMBO Journal 17-21, 6115-6123. Escalante, A. A., Lal, A. A. and F. J. Ayala (1998). Genetic polymorphism and natural selection in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genetics 149, 189-202. Fisher, K., Horrocks, P., Preu, M., Wiesner, J., Wnsch, S., Camargo, A. A. and M. Lanzer (1997). Expression of var genes located within polymorphic subtelomeric domains of Plasmodium falciparum chromosomes. Mol.Cell.Biol 17, 3679-3686. Harinasuta T., Migasen S. and D. Boonag (1962), Chloroquine resistance in Plasmodium falciparum in Thailand, UNESCO First Regional Symposium on Scientific Knowledge of Tropical Parasites, Singapore University. Hastings, I. M., Bray, P. G. and S. A. Ward (2002). A Requiem for chloroquine. Science 298, 74-75. Hemingway, J., Field, L. and J. Vontas (2002). An Overview of Insecticide Resistance Hernandez-Rivas, R., Mattei, D., Sterkers, Y., Peterson, D. S., Wellems, T. E. and A. Sherf (1997) Expressed var genes are found in Plasmodium falciparum subtelomeric regions. Mol.Cell.Biol 17, 604-611. Kaufman, T. C., Severson, D. W. and G. E. Robinson (2002). The Anopheles Genome and Comparative Insect Genomics, Science 298, 97-98. Kemp, D. J. and A. F. Cowman (1990). Genetic diversity in Plasmodium falciparum. Advances in Parasitology, 29, 75-125. Matuschewski, K., Nunes, A. C., Nussenzweig, V. and R. Mnard (2002). Plasmodium sporozoite invasion into insect and mammalian cells is directed by the same dual binding system. The EMBO Journal 21, 1597-1606. McBride, J. S., Walliker, D., Morgan. and G. Morgan (1982). Antigenic diversity in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science 217, 254-257. Miller, L. H. and B. Greenwood (2002). Malaria-a shadow over Africa. Science 298, 121-122. Mota, M. M., Pradel, G., Vanderberg, J. P., Hafalla, J. C. R., Frevert, U., Nussenzweig, R. S., Nussenzweig, V. and A. Rodriguez (2001). Migration of Plasmodium sporozoites throught cells before infection. Science 291, 141-144. Nussenzweig, V. and R. S. Nussenzweig (1985). Circumsporozoite proteins of malaria parasites. Cell 42, 401-403.

127

Oduol, F., Xu, J. N., Niare, O., Natarajan, R. and K. D. Vernick (2000). Genes identified by an expression screen of the vector mosquito Anopheles gambiae display differential molecular immune response to malaria parasites and bacteria, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97, 11397-11402. Olliaro, P., Cattani, J. and D. Wirth (1996). Malaria : the submerged disease, JAMA 275-3, 230-234. Padua, R. A. (1981). Plasmodium chabaudi : Genetics of resistance to chloroquine, Experimental Parasitology 52, 419-426. Ranson, H., Claudianos, C., Ortelli, F., Abgrall, C., Hemingway, J., Sharakhova, M. V., Unger, M. F., Collins, F. H. and R. Feyereisen (2002). Evolution of supergene families associated with insecticide resistance. Science 298, 179. Reed, M. B., Saliba, K. J., Caruana, S. R., Kirk, K. and A.F. Cowman (2000), Pgh1 modulates sensitivity and resistance to multiple antimalarials in Plasmodium falciparum, Nature 403, 906-909. Rich, S. M. and F. J. Ayala (1998). The Recent origin of allelic variation in antigenic determinants of Plasmodium falciparum. Genetics 150, 515-517. Rich, S. M., Hudson, R. R. and F. J. Ayala (1997). Plasmodium falciparum antigenic diversity : Evidence of clonal population structure. Evolution 94, 13040-13045. Richman A. M., Dimopoulos G., Seeley D. and F. C. Kafatos (1997). Plasmodium activates the innate immune response in Anopheles gambiae mosquitoes, The EMBO Journal 16, 61146119. Roberts, D.J., Craig, A. G., Berendt, A. R., Pinches, R., Nash, G., Marsh, K. and C.I. Newbold (1992) Nature 357, 689-692. Rosario, V. E. (1976). Genetics of chloroquine resistance in malaria parasites, Nature 261, 585-586. Smith, J. D., Craig, A. G., Kriek, D., Hudson-Taylor, D., Kyes, S., Fagen, T. Pinches, R., Baruch, D. I., Newbold, C. and L. H. Miller (2000). Identification of a Plasmodium falciparum intercellular adhesion molecule-1 binding domain: a parasite adhesion trait implicated in cerebral malaria. PNAS 97, 1766-1771. Su, X. Z., Heatwole, V. M., Wertheimer, S. P., Guinet, F., Herrfeldt, J. A., Peterson, D. S., Ravetch, J. A. and T. E. Wellems (1995). The large diverse gene family var encodes proteins involved in cythoadherence and antigenic variation of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Cell 82, 89-100. Tahar, R., Boudin, C., Thiery, I. And C. Bourgoin (2002). Immune response of Anopheles gambiae to the early sporogonic stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. The EMBO Journal 21-24, 6673-6680. Volkman, S. K., Harti, D. L., Hartl, Wirth, D. F., Nielsen, K. M., Choi, M., Batalov, S., Zhou, Y., Plouffe, D., Le Roch, K. G., Abagyan, R. and E. A. Winzeler (2002). Excess

128

polymorphisms in gene for membrane proteins in Plasmodium falciparum. Science 298, 216218. Wellems, T. E., (2002). Plasmodium chloroquine resistance and the search for a replacement antimalarial drug. Science 298, 124. Zheng, L., Cornel, A. J., Wang, R., Erfle, H., Voss, H., Ansorge, W., Kafatos, F. C. and F. H. Collins (1997). Quantitative Trait Loci for refractoriness of Anopheles Gambiae to Plasmodium cynomolgi B. Science 276, 425-428.

SEQUENCAGE DU PLASMODIUM ET DANOPHELE

Bowman, S., Lawson, D., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T., Churcher, M. C., Craig, A., Davies, M. R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Gwilliam, R., Hamlin, N., Harris, D., Holroyd, S., Hornsby, T., Horrocks, P., Jagels, K., Jassal, B., Kyes, S., McLean, J., Moule, S., Mungall, K., Murphy, L., Oliver, K., Quail, A. M., Rajandream, A. M., Rutter, S., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, E. J., Whitehead, S., Woodward, R. J., Newbold, C. and B.G. Barrell (1999). The complete nucleotide sequence of chromosome 3 of Plasmodium falciparum, Nature 400, 532-538. Doolittle, F. R. (2002). The grand assault, Nature 419, 493-494. Gardner, J. M. (2001). A status report on the sequencing and annotation of the P.falciparum genome, Molecular and Biochemical Parasitology 118, Issue2, 133-138. Gardner, J. M., Neil, H., Fung, E., White, O., Berriman, M., Hyman, W. R., Carlton, M. J., Pain, A., Nelson, E. K., Bowman, S., Paulsen, T. I., James, K., Elsen, A. J., Rutherford, K., Salzberg, L. S., Craig, A., Kyes, S., Chan, M-S, Nene, V., Shallom, J. S., Suh, B., Peterson, J., Angluoll, S., Pertea, M., Allen, J., Selengut, J., Haft, D., Mather, W. M., Valdya, B. A., Martin, A. M. D., Fairlamb, H. A., Fraunholz, J. M., Roos, S. D., Ralph, A. S., Mcfadden, I. G., Cummings, M. L., Manl Subramanian, G., Mungall, C., Venter, C. J., Carucci, J. D., Hoffman, L. S., Newbold, C., Davies, W. R., Fraser, M. C. and B. Barrell (2002). Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum, Nature 419, 498-511. Gardner, J. M., Tettelin, H., Carucci, J. D., Cummings, M. L., Aravind, L., Koonin, V. E., Shallom, S., Mason, T., Yu, K., Fujii, C., Pederson, J., Shen, K., Jing, J., Aston, C., Lai, Z., Schwartz, C. D., Pertea, M., Salzberg, S., Zhou, L., Sutton, G. G., Clayton, R., White, O., Smith, O. H., Fraser, M. C., Adams, D. M., Venter, C. J. and S. L. Hoffman (1998). Chromosome 2 Sequence of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum, Science 282, 1126-1132. Holt, A. R., Mani Subramanian, G., Halpern, A., Sutton, G. G., Charlab, R., Nusskern, R. D., Wincker, P., Clark, G. A., Ribeiro, C. M. J., Wides, R., Salzberg, L. S., Loftus, B., Yandell, M., Majoros, H. W., Rusch, B. D., Lai, Z., Kraft, L. C., Abril, F. G., Anthouard, Arensburger, P., Atkinson, W. P., Baden, H., De Berardinis, V., Baldwin, D., Benes, V., Biedler, J., Blass, C., Bolanos, R., Boscus, D., Barnstead, M., Cai, S., Center, A., Chatuverdi, K., Christophides, K. G., Chrystal, A. M., Clamp, M., Cravchik, A., Curwen, V., Dana, A., Delcher, A., Dew, I., Evans, A. C., Flanigan, M., Grundschober-Freimoser, A., Friedli, L., Gu, Z., Guan, P., Guigo, R., Hillenmeyer, E. M., Hladun, L. S., Hogan, R.

129

J., Hong, S. Y., Hoover, J., Jaillon, O., Ke, Z., Kodira, C., Kokoza, E., Koutsos, A., Letunic, I., Levitsky, A., Liang, Y., Lin, J-J., Lobo, F. N., Lopez, R. J., Malek, A.J., McIntosh, C. T., Meister, S., Miller, J., Mobarry, C., Mongin, E., Murphy, D. S., O'Brochta, A. D., Pfannkoch, C., Qi, R., Regier, A. M., Remington, K., Shao, H., Sharakhova, V. M., Sitter, D. C., Shetty, J., Smith, J. T., Strong, R., Sun, J., Thomasova, D., Ton, Q. L, Topalis, P., Tu, Z., Unger, F. M., Walenz, B., Wang, A., Wang, J., Wang, M., Wang, X., Woodford, J. K., Wortman, R. J., Wu, M., Yao, A., Zdobnov, M. E., Zhang, H., Zhao, Q., Zhao, S., Zhu, C. S., Zhimulev, I., Coluzzi, M., Della Torre, A., Roth, W. C., Louis, C., Kalush, F., Mural, J. R., Myers, W. E., Adams, D. M., Smith, O. H., Broder, S., Gardner, J. M., Fraser, M. C., Birney, E., Bork, P., Brey, T. P., Venter, C. J., Weissenbach, J., Kafatos, C. F., Collins, H. F., and S. L. Hoffman (2002). The Genome Sequence of The Malaria Mosquito Anopheles gambiae, Science 298, 129-148. Kissinger, C. J., Brunk P. B., Crabtree, J., Fraunholz, J. M., Gajria, B., Milgram, J. A., Pearson S. D., Schug, J., Balh, A., Diskin, J. S., Ginsburg, H., Grant, R. G., Gupta, D., Labo, P., Li, L., Mailman, D. M., Mcweeney, K. S., Whetzel, P., Stoeckert JR, J. C., and D. S. Roos (2002). The Plasmodium genome database, Nature 419, 490-492. Lai, Z., Jing, J., Aston, C., Clarke V., Apodaca J., Dimalanta, T. E., Carrucci, J. D., Gardner, J. M., Mishra, B., Anantharaman, S. T., Paxia S., Hoffman, L.S., Venter, J. C., Huff, J. E. and D. C. Schwartz (1999). A shotgun optical map of the entire Plasmodium falciparum genome, Nature genet. 23 n 3, 309-313. La mthodologie du squenage et des bases de donnes a t ralis principalement partir des sources suivantes : Bernot, A., Analyse de Gnomes, Transcriptomes et Protomes, 2001, 3e dition, Editions Dunod http://www.infobiogen.fr

APPLICATIONS DIRECTES DU SEQUENCAGE

Alphey, L., Beard, C. B., Billingsley, P., Coetzee, M., Crisanti, A., Curtis, C., Eggleston, P., Godfray, C., Hemingway, J., Jacobs-Lorena, M., James, A. A., Kafatos, F. C., Mukwaya, L. G., Paton, M., Powell, J. R., Schneider, W., Scott, T. W., Sina, B., Sinden, R., Sinkins, S., Spielman, A., Tour, Y. and F. H. Collins (2002), Malaria Control with Genetically Manipulated Insect Vectors, Science 298, 119-121. Bote, C. and J. C. Koella (2002), Evolutionary ideas about genetically manipulated mosquitoes and malaria control, TRENDS in Parasitology 19 n1, 32-38. Bowman, S. and P. Horrocks (2002), Assesing the impact of Plasmodium falciparum genome sequencing, Microbes and Infection 2 n12, 1479-1487. Bozdech, Z., Zhu, J., Joachimiak, M. P., Cohen, F. E., Pulliam, B. and J. L. DeRisi (2003). Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodium falciparum with a long-nucleotide microarray. Genome Biology 4 R9.

130

Brennan, J. D. G., Kent, M., Dhar, R., Fujioka, H. and N. Kumar (2000), Anopheles gambiae gland proteins as putative targets for blocking transmission of malaria parasite, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13859-13864. Capurro, L., Coleman, J., Olson, K., Beerntsen, B. T., Rocha E., Krettli, A. V. and A. A. James (2000), Virus-expresed, recombinant single-chain antibody blocks sporozote infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti, Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-433. Catteruccia, F., Nolan, T., Loukeris, T. G., Blass, C., Svakis, C., Kafatos, F. C. and A. Crisanti (2000), Stable germline transformation of the malaria mosquito, Anopheles stephensi, Nature 405, 959-962. Clarke, T., (2002), Mosquitoes minus malaria, Nature 419, 429-430. De Gregorio, E. and B. Lemaitre (2002), The post-genomic era opens, Nature 419, 496-497. DeRisi, J. L., Iyer, V. R. and P. O. Brown (1997). Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278, 680-686. Enserink, M., (2001), Tow New Steps Toward A Better Mosquito, Science 293, 2370-2371. Enserink, M., (2002), Ecologists See Flaws in Transgenic Mosquito, Science 297, 30-31. Fodor, S. P. A., Leighton, R. J., Pirrung, M. C., Stryer, L., Lu, A. T., and D. Solas (1991). Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251, 767-773. Gosh, A. K., Moreira, L. A. and M. Jacobs-Lorena (2002), Plasmodium-mosquito interactions, phage display librairies and transgenic mosquitoes impaired for malaria transmission, Insect Biochemistry and Molecular Biology 32, 1325-1331. Habeck, M., (2001), Transgenic mosquitoes to control malaria, The Lancet Infectious Diseases 1, 219. Hoffman, S. L., Subramanian, G. M., Collins, F. H. and J. C. Venter (2002), Plasmodium, human and Anopheles genomics and malaria, Nature 415, 702-709. Ito, J., Ghosh, A., Moreira, L. A., Wimmer, E. A. and M. Jocobs-Lorena (2002), Transgenic anopheline mosquitoes impaired in transmission of malaria parasite, Nature 417, 452-455. Land, K. L., (2002), Transgenic mosquitoes in crontrolling malaria transmission, TRENDS in Parasitology 18 n9, 383. Lockhart, D. J. and E. A. Winzeler (2000). Genome, gene expression and DNA microarrays. Nature 405, 827-835. Malaria after the genome (2003), Nature 421, 97- 99.

131

Morel, C. M., Tour, Y., Dobrokhotov, B. and A. M. J. Oduola (2002), The Mosquito Genome-a Breakthrough for Public Health, Science 298, 79. Newbold, C., Warm, P., Black, G., Berendt, A., Craig, A., Snow, B., Msobo, M., Peshu, N. and K. Marsh (1997). Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398. Pennisi, E., (2002), Parasite Genome Sequenced, Scrutinized, Science 298, 33-34. Rathod, P. K., Ganesan, K., Hayward, R. E., Bozdech, Z. and J. L. DeRisi (2002). DNA microarrays for malaria. Trends Parasitol. 18, 39-45. Scott, T. W., Takken, W., Knols, B. G. J. and C. Bote (2002), The Ecology of Genetically Modified Mosquitoes, Science 298, 117-119. Tu, Z., (2001), Eight novel families of miniature inverted repeat transposable elements in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1699-1704. Walgate, R., (2003), Paludisme : le squenage, et aprs ?, La Recherche 361, 55-59. Wirth, D. F., (2002), The parasite genome : Biological revelations, Nature 419, 495-496. http://www.inapg.inra.fr : Les nouveaux moyens de lutte (INAP-G et INRA) http://www.genetic.ch : Vos, A., (23 mai 2002), contre la transmission de la malaria, les chercheurs crent le moustique transgnique.

AUTRES PARTIES
Sachs, J. D., (2002). A New global effort to control malaria. Science 298, 96-97 Trouiller P. and P. Olliaro (1999). Drug development output from 1975 to 1996 : what proportion for tropical diseases?, International Journal Infectious Diseases 3, 61-63.

132