Guide Des Analyses en Hématologie 2018

Chez le même éditeur
Guide des analyses en immunologie – Indications, critères de réalisation et limites, par l’Association
des enseignants d’immunologie (ASSIM) et la Société française d’immunologie (SFI), 2014, 284 pages.
Immunologie fondamentale et immunopathologie – Enseignements thématique et intégré - Tissu
lymphoïde et sanguin / Immunopathologie et immuno-intervention, par le Collège des enseignants
d’immunologie, 2013, 280 pages.
Guide des analyses en
hématologie
Coordination :
Pr Marie Christine Béné

CHU et Faculté de médecine de Nantes
Co-coordination anomalies érythrocytaires :
Pr Patricia Martinez-Aguilar
CHU et Faculté de médecine, Montpellier
Co-coordination hémostase
Dr Dominique Lasne
AP-HP Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris
Co-coordination immuno-hématologie
Pr France Pirenne
EFS Île-de-France
Sous l’égide de la
Commission de biologie de la Société française
d’hématologie
Animateurs
Pr Valérie Ugo
CHU et Faculté de médecine d’Angers
Pr Anne-Marie Fischer
HEGP et Faculté de médecine Paris-Descartes
Pr Nadine Ajzenberg
Hôpital Bichat et Faculté de médecine Paris-Diderot
Pr Claude Preudhomme
CHRU et Faculté de médecine de Lille
et du
Collège national des enseignants d’hématologie, Société

française d’hématologie
Président
Pr Marc Maynadié
CHU et Faculté de médecine de Dijon
Elsevier Masson SAS, 65, rue Camille-Desmoulins, 92442 Issy-les-Moulineaux cedex, France
Guide des analyses en hématologie de la Société française d’hématologie.
© 2018 Elsevier Masson SAS
ISBN : 978-2-294-75359-6
e-ISBN : 978-2-294-75428-9
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Contributeurs
Nadine Ajzenberg, AP-HP, CHU hôpital Bichat, Lydie Da Costa, AP-HP, CHU hôpital Robert
Paris. Debré, Paris.
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Timone, Marseille. Georges Pompidou, Paris.
Martine Alhenc- Gelas, AP-HP, CHU hôpital Frédéric Davi, AP-HP, CHU hôpital de la Pitié-
européen Georges Pompidou, Paris. Salpêtrière, Paris.
Véronique Baccini, CHU de Pointe-à-Pitre. Emmanuel De Maistre, CHU de Dijon.
Anne Bauters, CHU de Lille. Emmanuelle De Raucourt, AP-HP, CHU hôpi-
Marie-Christine Béné, CHU de Nantes. tal Beaujon, Clichy.
Sébastien Bertil, AP-HP, CHU hôpital européen Bénédicte Delahousse, CHU hôpital Trousseau,
Georges Pompidou, Paris. Tours.
Odile Blanchet, CHU d’Angers. Maxime Delrue, AP-HP, hôpital Lariboisière,

Paris.
Élodie Boissier, CHU de Nantes.
Céline Desconclois, CHU, hôpital Antoine
Marie- Charlotte Bourrienne, AP-HP, CHU Béclère, Clamart.
hôpital Bichat, Paris.
Bernard Drenou, CH de Mulhouse.
Anne Bouvier, CHU d’Angers.
Georges Jourdi, AP-HP, CHU hôpital Cochin,
Leyla Calmette, AP-HP, CHU, hôpital Ambroise Paris.
Paré, Boulogne-Billancourt.
Marion Éveillard, CHU de Nantes.
Laurence Camoin, AP-HM, CHU La Timone,
Marseille. Pascale Flandrin Gresta, CHU de Saint-Étienne.
Claudine Caron, CHU de Lille. Claire Flaujac, CH de Versailles.
Jean Michel Cayuela, AP-HP, CHU hôpital Michaela Fontenay, AP-HP, CHU hôpital
Saint–Louis, Paris. Cochin, Paris.
Jacques Chiaroni, EFS Provence-Alpes-Côte- Loïc Garçon, CHU d’Amiens.

d’Azur-Corse. Pascale Gaussem, AP-HP, CHU hôpital euro-
Emmanuelle Clappier, AP-HP, CHU hôpital péen Georges Pompidou, Paris.
Robert Debré, Paris. Muriel Giansily-Balizot, CHU de Montpellier.
Pascale Cornillet-Lefebvre, CHU de Reims. Stéphane Giraudier, AP-HP, CHU hôpital
Nathalie Couque, AP-HP, CHU hôpital Robert Saint-Louis, Paris.
Debré, Paris. Isabelle Gouin, CHU de Rennes.
Laure Croisille, EFS Créteil. Jean Christophe Gris, CHU de Nîmes.
XII Contributeurs
Yves Gruel, CHU hôpital Trousseau, Tours. France Pirenne, EFS Île-de-France.

Michel Hanss, hospices civils, CHU de Lyon. Serge Pissard, AP-HP, CHU Henri Mondor,
Créteil.
Nathalie Hézard, AP-HM, CHU La Timone,
Marseille. Claire Pouplard, CHU hôpital trousseau, Tours.
Marie-Françoise Hurtaud, AP-HP, CHU hôpi- Annabelle Prado-Dupont, CHU de Lille.
tal Robert Debré, Paris. Claude Preudhomme, CHU de Lille.
Emmanuelle Jeanpierre, CHU de Lille. Valérie Proulle, AP-HP, CHU Bicêtre, Le Krem-
Philippe Joly, CHU de Lyon. lin-Bicêtre.
Olivier Kosmider, AP-HP CHU hôpital Cochin, Antoine Rauch, CHU de Lille.
Paris. Sophie Raynaud, CHU de Nice.
Dominique Lasne, AP-HP, CHU hôpital Anne Ryman, CHU de Bordeaux.
Necker-Enfants malades, Paris. Marie-Hélène Schlageter, AP-HP, CHU hôpital
Élodie Lainey, AP-HP, CHU hôpital Robert Saint-Louis, Paris.
Debré, Paris. Gérard Sébahoun, hôpital européen, Marseille.
Nicolas Le Chevallier, CHU de Bordeaux. Pierre Sié, CHU, hôpital Rangueil, Toulouse.
Maïlys Le Guyader, CHU d’Amiens. Virginie Siguret, AP-HP, CHU hôpital Lariboi-
Éric Lippert, CHU de Brest. sière, Paris.
Laurent Macchi, CHU de Poitiers. Alain Stépanian, AP-HP, CHU hôpital Lariboi-
sière, Paris.
Elizabeth MacIntyre-Davi, AP-HP, CHU hôpi-
tal Necker-Enfants malades, Paris. Pierre Suchon, AP-HM, CHU La Timone,
Marseille.
Patricia Martinez, CHU de Montpellier.
Sophie Susen, CHU de Lille.
Lætitia Mauge, AP-HP, CHU hôpital européen
Georges Pompidou, Paris. Brigitte Tardy, CHU de Saint-Étienne.
Pierre Morange, AP-HM, CHU La Timone, Catherine Ternisien, CHU de Nantes.

Marseille. Pierre Toulon, CHU de Nice.
Philippe Nguyen, CHU de Reims. Agnès Veyradier, AP-HP, CHU hôpital Lariboi-
Florence Nguyen Khac, AP-HP, CHU hôpital sière, Paris.
de la Pitié-Salpêtrière, Paris. Christophe Zawadzki, CHU de Lille.
Abréviations
2 HG 2 Hydroglutarate CSTf Coefficient de saturation

2,3-DPG 2,3-diphosphoglycérate de la transferrine
ACC Anticoagulant circulant CTAD Citrate, théophylline, adénosine,
ACD Anemia of Chronic Disease dipyridamole
aCL Anticorps anti-cardiolipine CV Coefficient de variation
ADAMTS13 A Disintegrin And Metalloprotease DDi D-Dimères
with ThromboSpondin type 1 repeats, DdPCR Digital droplet PCR
member 13 DImax Index de déformabilité maximale
AFC Association française de cytométrie DLI Donor Lymphocyte Infusion
AH Anémie hémolytique DRVVT Test au venin de vipère Russel dilué
AHAI Anémie hémolytique auto-immune EC Électrophorèse capillaire
Allo-SCT Allogeneic Stem Cell Transplantation ECAT External quality control of diagnostic
ANSM Agence nationale de sécurité assays and tests
du médicament et des produits EDTA Éthylène diamine tétra-acétique
de santé ELN European LeukemiaNet
AOD Anticoagulant oral direct EMA Éosine MAléimide
Apl Anticorps antiphospholipide EPO Érythropoïétine
ARN Acide ribonucléique ERIC European Research Initiative on CLL
AT Antithrombine ESLHO European Scientific Foundation
AVWS Acquired von Willebrand syndrome of Hemato-Oncology
BCR B-Cell Receptor EVTE Évènement veineux
BTK Bruton Tyrosine Kinase thromboembolique
CALR Calréticuline FFPE Formalin Fixed Paraffin Embedded
CCMH Concentration corpusculaire Fg Fibrinogène
moyenne en hémoglobine FISH Fluorescence In Situ Hybridization
CD Cluster of differentiation FLIPI Follicular Lymphoma International
CDAII Congenital Dyserythropoietic Anemia Prognostic Index
type 2 FT Facteur tissulaire
CDR3 3 Complementarity Determining FVIII:C Facteur VIII coagulant
Region GAT Granulocyte Agglutination Test
CFU-GEMM Colony Forming Unit-Granulocyte GBMHM Groupe de biologie moléculaire
CGR Concentré de globules rouges des hémopathies malignes
CHIP Clonal Hematopoiesis GEIL Groupe d’étude immunologique des
of Indeterminate Potential leucémies
CIVD Coagulation intravasculaire GFHC Groupe francophone d’hématologie
disséminée cellulaire
CMF Cytométrie en flux GFHT Groupe français d’étude sur
CNGOF Collège national des gynécologues l’hémostase et la thrombose
et obstétriciens français GIFT Granulocyte Immunofluorescence Test
CNRHP Centre national de référence GIHP Groupe d’intérêt en hémostase
en hémobiologie périnatale périopératoire
CNV Copy Number Variation GPI Glycosyl-phosphatidyl-inositol
CSP Cellule souche périphérique GPIb Glycoprotéine Ib plaquettaire
XIV Abréviations
GR Globule rouge MCL Mantle Cell Lymphoma

GS Groupe sanguin MGG May-Grünwald Giemsa
HAS Haute autorité de santé MK Mégacaryocytes MK
Hb Hémoglobine MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe
HbS Hémoglobine S Amplification
HBS Heparin Binding Site (site de liaison MM Myélome multiple
à l’héparine) MRD Minimal Residual Disease
HbF Hémoglobine fœtale ou Measurable Residual Disease
HBPM Héparines de bas poids moléculaire (maladie résiduelle)
HMW High Molecular Weight (haut poids MTEV Maladie thromboembolique
moléculaire) veineuse
HNA Human Neutrophil Antigens MYH9 Myosin Heavy chain 9
HNF Héparine non fractionnée NASDA Naphtol ASD acétate estérase
HPA Human Platelet Antigens NFS Numération formule sanguine
HPLC Chromatographie liquide haute NGS Next Generation Sequencing
pression (séquençage haut débit)
HPN Hémoglobinurie paroxystique NK Natural Killer
nocturne NMP Néoplasie myéloproliférative
HRM High Resolution Melting NP Numération plaquettaire
IAC Indice d’anticoagulant circulant NTBI Non-Transferrin Bound Iron
IG Immunoglobuline PCME Pathologie constitutionnelle
IGH Gène de chaîne lourde de la membrane érythrocytaire
des immunoglobulines PCR Polymerase Chain Reaction
IGHV Gène de chaîne lourde des PDF Produit de dégradation de la fibrine
immunoglobulines, domaine variable PE Phycoérythrine
IGK Gène de chaîne légère kappa PFA Platelet Function Analyzer
IGL Gène de chaîne légère lambda PHHF Persistance héréditaire
INR International Normalized Ratio d’hémoglobine fœtale
IPSS International Prognostic Scoring PIVKA Protein Induced by Vitamin K
System PK Prékallicréine
IRP Index de réactivité plaquettaire PL Phospholipide
KHPM Kininogène de haut poids PLG Plasminogène
moléculaire PML ProMyelocytic Leukemia
LA Lupus anticoagulant PPP Plasma pauvre en plaquettes
LAL Leucémie aiguë lymphoblastique PRP Plasma riche en plaquettes
LBA Lavage broncho-alvéolaire PS Protéine S
LCM Lymphome à cellules du manteau PTI Purpura thrombopénique
LCR Liquide céphalo-rachidien idiopathique
LF Lymphome folliculaire PTT Purpura thrombotique
LLC Leucémie lymphoïde chronique thrombocytopénique
LMC Leucémie myéloïde chronique PV Polycythemia Vera
LMCa Leucémie myéloïde chronique Q-PCR Polymerase Chain Reaction
atypique Quantitative
LMMC Leucémie myélomonocytaire RAI Recherche d’agglutinines irrégulières
chronique RCP Résumés et caractéristiques
LNC Leucémie neutrophile chronique du produit
LYSA LYmphoma Study Association RCP Réunion de concertation
MAIGA Monoclonal Antibody-Specific pluridisciplinaire
Immobilization of Granulocyte RIPA Ristocetin Induced Platelet
Antigens Aggregation (Agrégation
MAIPA Monoclonal Antibody-specific plaquettaire induite par la
Immobilization of Platelet Antigens Ristocétine)
MAT Microangiopathie thrombotique RMM Réponse moléculaire majeure
Abréviations XV
RPT Réaction post-transfusionnelle TDA Test direct à l’antiglobuline

RSTf Récepteur soluble de la transferrine TE Thrombocythémie essentielle
SAO Ovalocytose mélanésienne TFPI Tissue Factor Plasma Inhibitor
SAPL Syndrome des antiphospholipides TGMH Teneur globulaire moyenne
SBS Syndrome de Bernard Soulier en hémoglobine
SCA Syndrome coronarien aigu TIH Thrombopénie induite
SFH Société française d’hématologie par l’héparine
SFNV Société française neuro-vasculaire t-PA Tissue Plasminogen Activator/
SH Sphérocytose héréditaire Activateur tissulaire
SHU Syndrome hémolytique urémique du plasminogène
SLP Syndrome lymphoprolifératif TPO Thrombopoïétine
SM Spectrométrie de masse TQ Temps de Quick
SMD Syndrome myélodysplasique TRALI Transfusion Related Acute Lung
SMP Syndrome myéloprolifératif Injury
SMYH9 Syndrome MYosin Heavy chain 9 TT Temps de thrombine
SNP Single Nucleotide Polymorphism USS Syndrome d’Upshaw-Schulman
SRA Serotonin Release Assay (test VASP Vasodilatator Stimulated
de libération de la sérotonine Phosphoprotein
radiomarquée) VGM Volume globulaire moyen
SSC Side SCatter VPM Volume plaquettaire moyen
TAFI Thrombin Activatable Fibrinolysis VWD Von Willebrand Disease (maladie
Inhibitor de Willebrand)
TCA Temps de céphaline avec activateur VWF Von Willebrand Factor (facteur
TCK Temps de céphaline kaolin von Willebrand)
TCMH Teneur corpusculaire moyenne VWF:Act Facteur Willebrand activité
en hémoglobine VWF:Ag Facteur Willebrand antigène
TCR T-cell Receptor (récepteur à VWFpp Propeptide du facteur
l’antigène des lymphocytes T) von Willebrand
Chapitre 1
Cytologie
Guide des analyses en hématologie

© 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
4 Cytologie : tests généraux
Fiche 1.1
Hémogramme
Code NABM 1104
Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

L’hémogramme est une ponction de sang veineux indications de prescription
ou capillaire réalisée sur anticoagulant EDTA. Un hémogramme est réalisé devant tout tableau
L’hémogramme permet l’analyse quantitative et clinique évocateur d’une anomalie qualitative
qualitative des éléments figurés du sang (héma- et/ou quantitative d’une ou plusieurs lignées
ties, plaquettes et globules blancs). Pour la lignée hématopoïétiques : c’est-à-dire pâleur, tachycar-
érythrocytaire, il mesure l’hématocrite (en %), die, dyspnée, infections, syndrome hémorragique
le nombre de globules rouges (en Tera [1012] avec purpura, syndrome tumoral, altération de
par litre), le taux d’hémoglobine (en g/dL ou l’état général... Un hémogramme est également
en g/L), le volume globulaire moyen (VGM, nécessaire dans le suivi de certaines pathologies
en fL), la teneur globulaire (ou corpusculaire) (leucémies) ou dans la surveillance de traitements
moyenne en hémoglobine (TGMH ou TCMH, connus pour avoir un retentissement hématolo-
en pg/cellule, qui correspond à la masse moyenne gique (héparine, antibiotiques cytopéniants, cyto-
d’hémoglobine présente dans un globule rouge toxiques). Les caractéristiques des hématies, et
[hémoglobine divisée par le nombre d’érythro- en premier lieu l’hémoglobine, permettent de
cytes]), la concentration corpusculaire moyenne suspecter une anémie (normocytaire, microcytaire
en hémoglobine (CCMH en g/dL ou g/L ou macrocytaire (VGM), normochrome ou hypo-
qui correspond à la concentration moyenne en chrome (CCMH) ou de détecter une polyglobu-
hémoglobine par hématie [hémoglobine divisée lie (néoplasie myéloproliférative [NMP] de type
par hématocrite]). Pour la lignée plaquettaire, Polycythemia Vera (PV) ou maladie de Vaquez).
il mesure le nombre de plaquettes (en Giga Les variations des taux de plaquettes sont asso-
[109] par litre), et le volume plaquettaire moyen ciées aux diagnostics de thrombopénies (centrales
(en fL). Pour les globules blancs, il mesure le ou périphériques) et de thrombocytose (NMP
nombre total de leucocytes (en Giga [109] par de type thrombocythémie essentielle [TE]). Une
litre). L’ensemble de ces paramètres représente la diminution du taux de leucocytes définit une
numération sanguine. Un examen plus complet leucopénie alors qu’une leucocytose est associée
est représenté par la numération formule sanguine aux infections ou aux leucémies. Les cytopénies
(NFS) qui évalue de plus, en fonction de leurs peuvent toucher toutes les lignées (pancytopénie)
caractéristiques physiques mesurées, les nom- ou une seule.
bres de polynucléaires neutrophiles, éosinophiles
et basophiles, de monocytes et de lymphocytes Place dans la hiérarchie d’un
(en Giga [109] par litre). bilan d’exploration
Chaque fournisseur d’analyseur d’hémogramme
L’hémogramme est un examen biologique de
automatisé peut ajouter d’autres paramètres,
première intention devant toute symptomatologie
en particulier de dispersion, aidant à l’inter-
clinique évocatrice d’une anomalie quantitative
prétation et à l’analyse qualitative des différentes
ou qualitative d’une ou plusieurs lignées héma-
lignées.
topoïétiques.
Chapitre 1. Cytologie 5
Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA di ou tripotassique.

Recommandations pour la qualité du Examen à réaliser idéalement dans les 12 heures maximum suivant le prélèvement.
prélèvement
Contraintes d’acheminement Température ambiante.
Mode de conservation Réfrigéré 24 heures maximum.
Principe méthodologique Impédance, cytométrie en flux, cytochimie, spectrophotométrie, calcul sur automate
dédié.
Type de méthode Méthode automatisée.
Type de test Mesure quantitative et qualitative.
CIQ Commercial.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation et Les automates de numération sont extrêmement précis et surveillés par des
performances contrôles de qualité internes et externes. Les valeurs de référence dépendent de
l’âge et du sexe. De manière très schématique, l’hématocrite est d’environ 40 %,
le taux d’hémoglobine est entre 11 et 16 g/dL, le nombre de globules rouges
autour de 5 T/L, le VGM entre 80 et 100 fL, la TGMH de 27 à 32 pg/cellule, la CCMH
de 32 à 36 g/dL. Le taux de plaquettes est entre 150 et 400 G/L avec un VPM
de 7,5 à 12 fL. Le taux normal de leucocytes est entre 4 et 10 G/L. Les polynu-
cléaires neutrophiles sont les plus nombreux (2 à 7 G/L) chez l’adulte, suivis des
lymphocytes (1 à 4 G/L) et des monocytes (0,2 à 0,7 G/L). Les éosinophiles et les
basophiles sont en nombre très faible, inférieur à 0,5 G/L. La formule sanguine
peut également être exprimée en % des leucocytes, mais c’est la valeur absolue
qui doit être interprétée. Les automates sont programmés pour générer des alarmes
en présence de résultats anormaux, initiant soit une « repasse » soit une formule
manuelle. Cette dernière consiste, après avoir étalé et séché sur une lame de verre
une petite goutte d’échantillon, à colorer cette lame avec par exemple, la séquence
de colorants d’un May Grünwald Giemsa. Cette lame est ensuite examinée au
microscope pour effectuer une analyse morphologique des hématies, leucocytes
et plaquettes orientant le diagnostic. Cette évaluation « manuelle » fait partie
intégrante de l’hémogramme. Voir aussi Fiche 1.6.
Causes d’erreur, limites du test Pseudo-thrombopénie liée à l’anticoagulant EDTA (nécessite un examen micro-
scopique à la recherche d’agrgats plaquettaires et une nouvelle numération
plaquettaire sur tube citraté).
Conditions pré-analytiques diverses : ponction diluée (prélèvement à proximité d’une
perfusion), coagulation partielle de l’échantillon, échantillon trop âgé.
Fiche 1.2
Hématocrite
Code NABM 2108
Signification biologique du paramètre de l’érythropoïétine liée à la mutation V617F

La mesure de l’hématocrite fait partie de l’hémo- de JAK2. Chez ces patients, on observe une
gramme et est réalisée par les automates de augmentation de l’hématocrite en raison de la
numération ou évaluée par microcentrifugation. production exagérée d’hématies. Selon les critères
Il représente le volume, exprimé en pourcentage, OMS 2016, une PV doit être suspectée devant un
occupé par les globules rouges dans le sang total. hématocrite supérieur à 49 % chez l’homme ou
Les variations de valeur de l’hématocrite sont liées à 48 % chez la femme. L’hémoglobine est dans
à celles du nombre de globules rouges, de leur ce cas supérieure à 16,5 g/dL ou 16 g/dL res-
volume et du taux d’hémoglobine. pectivement. Ces valeurs sont plus basses, voire
normales, en cas de carence martiale associée.
C’est alors le nombre de globules rouges qui
Objectifs de l’analyse et principales
permet de suspecter le diagnostic.
indications de prescription
On observe également une augmentation de
L’hématocrite est un examen de routine de la l’hématocrite si le volume des globules rouges est
numération formule sanguine ou hémogramme et augmenté. Enfin, la déshydratation entraîne une
n’est plus prescrit de façon isolée. Cependant une fausse augmentation de l’hématocrite.
vérification par centrifugation, ou de préférence
par microcentrifugation, peut s’avérer nécessaire Place dans la hiérarchie d’un
pour une mesure précise. bilan d’exploration
Une baisse de l’hématocrite est observée en cas
d’anémie ou lorsque le volume de plasma aug- La mesure de l’hématocrite fait partie de
mente. C’est le cas dans l’hémodilution physio- l’hémogramme qui est un examen de première
logique de la grossesse ou des hémodilutions intention (c’est l’examen biologique le plus
pathologiques associées aux œdèmes des insuffi- prescrit au monde). L’hématocrite peut être
sances hépatiques ou cardiaques. perturbé en cas de signes cliniques évocateurs
La polyglobulie de Vaquez ou Polycythemia Vera d’anémie (pâleur, fatigue, essoufflement) ou de
(PV) est une néoplasie myéloproliférative carac- polyglobulie (érythrose, sensibilité à l’eau, maux
térisée par une activation spontanée du récepteur de tête).
Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA.

Recommandations pour la Analyse dans les 24 heures.
qualité du prélèvement
Contraintes d’acheminement NA.
Principe méthodologique Les automates de numération sanguine calculent l’hématocrite à partir du nombre et du volume
des globules rouges. Il est également possible de mesurer la hauteur des globules rouges par
rapport au sang total après microcentrifugation dans un tube capillaire calibré (75 mm de hauteur,
1 mm de diamètre).
Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA.

Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. À noter qu’il existe des instruments de mesure rapide de
l’hémoglobine et de l’hématocrite en biologie délocalisée, disponibles près des blocs opératoires
pour guider les choix transfusionnels.
Type de test Mesure quantitative.
CIQ Commercial.
EEQ Commercial
Valeurs de référence/ L’hématocrite d’un sujet adulte a une valeur de 36-48 % chez la femme et 40-52 % chez
Interprétation et performances l’homme. Des taux plus élevés sont observés chez les nouveau-nés, les sujets âgés ou en
situation d’hypoxie (pathologique ou simplement lors de séjours en altitude où le nombre de
globules rouges augmente pour favoriser l’oxygénation des tissus en atmosphère moins riche en
oxygène). Il existe également des variations ethniques de l’hématocrite qui est plus élevé chez les
Caucasiens.
Causes d’erreur, limites du Hémolyse, hyperleucocytose. À noter aussi que le dopage, notamment par l’administration
test d’érythropoïétine, entraîne une augmentation de la production d’hématies et donc de
l’hématocrite.
Fiche 1.3
Numération des réticulocytes
Code NABM 1109
Signification biologique du paramètre certains traitements (fer, vitamine B12, érythro-

Le réticulocyte est une hématie riche en ARN poïétine [EPO]) et après une greffe de cellules
qui vient de parvenir dans la circulation. Il est souches hématopoïétiques.
identifiable pendant 24 heures environ, tant que
persistent des organites cytoplasmiques : mito- Place dans la hiérarchie d’un
chondries, ribosomes et centriole. Le taux de réti- bilan d’exploration
culocytes sanguin est un reflet de la production La numération des réticulocytes est un examen de
médullaire érythrocytaire. deuxième intention destiné à caractériser l’origine
centrale ou périphérique d’une anémie objectivée
Objectifs de l’analyse et principales par un hémogramme.
La numération des réticulocytes est nécessaire
à l’exploration d’une anémie lors du suivi de
Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA.

Recommandations Examen à réaliser dans les 12 heures suivant le prélèvement.
pour la qualité du prélèvement
Principe méthodologique Cytométrie en flux sur automate dédié ou coloration par des colorants supravitaux (bleu de crésyl
brillant ou bleu de méthylène) puis numération sur frottis sanguin.
Type de méthode Méthodes automatisées et manuelles.
CIQ Commercial.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Les automates de numération sont extrêmement précis et vérifiés par des contrôles de qualité
Interprétation et performances internes et externes.
Pour la numération manuelle, un compte doit être fait sur un minimum de 1000 hématies sur
deux lames différentes (500 hématies/lame).
Causes d’erreur, limites du Conditions pré-analytiques diverses : ponction diluée (prélèvement à proximité d’une perfusion),
test échantillon trop âgé, prélèvement hémolysé.
Décompte manuel insuffisant (< 1000 hématies).
Confusion avec les corps de Heinz.
Fiche 1.4
Plaquettes (thrombocytes), étude isolée
Code NABM 1107
Signification biologique du paramètre le SMYH9) et ne sont pratiquement pas colorées

La numération plaquettaire fait partie de l’hémo- par le May-Grünwald Giemsa (MGG), en raison
gramme et est réalisée par les automates de numé- de l’absence de granules alpha. Certaines fausses
ration. Dans certaines circonstances, il peut être thrombopénies sont liées à la présence d’agrégats
nécessaire de procéder à un examen cytologique plaquettaires en présence d’EDTA, détectables au
spécifique des plaquettes, mettant en évidence des microscope et qui nécessitent parfois un contrôle
anomalies de taille ou de coloration. sur un nouveau prélèvement recueilli sur citrate
de sodium.
Place dans la hiérarchie d’un
bilan d’exploration
En présence d’un nombre anormal de plaquettes,
l’examen microscopique peut compléter le bilan. L’étude isolée des plaquettes est un examen de
Des plaquettes de grande taille, voire géantes, sont seconde intention qui peut néanmoins être réalisé
présentes en cas d’anomalies du cytosquelette ou sans qu’il soit nécessaire de prélever de nouveau
des glycoprotéines membranaires. C’est le cas par le patient lorsque le laboratoire est alerté par
exemple dans le syndrome MYH91 (SMYH9) un hémogramme anormal. C’est également un
et dans le syndrome de Bernard Soulier (SBS) examen à prescrire après avoir exclu les causes
par ailleurs caractérisé par un défaut d’adhésion fréquentes de thrombopénie telles que les fausses
des plaquettes au facteur Willebrand. Dans la thrombopénies (agrégats) ou le purpura throm-
thrombopénie congénitale associée au syndrome bopénique auto-immun, accompagnant souvent
des plaquettes grises, les plaquettes sont de taille une infection virale chez l’enfant, et en cas de
augmentée (mais moins que dans le SBS et dans suspicion de thrombopénie congénitale.
Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA ou sur citrate de sodium.

Recommandations Analyse dans les 24 heures.
pour la qualité du
prélèvement
Contraintes NA.
d’acheminement
Mode de conservation Température ambiante.
Principe La numération plaquettaire est effectuée par les automates de numération, éventuellement après
méthodologique marquage par un fluorochrome (fluorimétrie). Une numération plaquettaire en hématimètre peut être
indiquée en cas de thrombopénie profonde.
L’analyse morphologique des plaquettes est réalisée sur un frottis sanguin après coloration classique au
MGG. Les automates de numération peuvent renseigner sur la taille des plaquettes (volume plaquettaire
moyen, VPM). Les résultats doivent être interprétés en fonction du type d’automate utilisé. Certains
automates ne sont, en effet, pas capables de repérer une augmentation de VPM.
Les automates utilisant la fluorimétrie permettent d’évaluer le contenu en ARN des plaquettes qui peut
être un indicateur de la taille plaquettaire. La littérature montre que, plus il y a d’ARN, plus la plaquette
est grosse. Ceci est bien documenté pour le syndrome MYH9.
Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée.

CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Le volume plaquettaire moyen (VPM) déterminé par les automates de numération est de 7 à 10 fL.
Interprétation et L’examen morphologique doit être effectué par un hématologiste cytologiste spécialiste. Les plaquettes
performances normales sont de petits éléments granuleux irréguliers de 2 à 4 µm de diamètre, colorés en pourpre au
MGG.
Causes d’erreur, limites Mauvaise coloration, prélèvement coagulé. À noter que l’absence de proportions adéquates sang/
du test anticoagulant peut activer les plaquettes et gêner l’interprétation.
Ce test est indiqué comme ne devant pas être cumulé avec une numération formule. Cette fiche
a essentiellement été rédigée pour préciser les caractéristiques plaquettaires à examiner lors de
l’observation d’une lame de sang.
1. MYH9 : MYosin Heavy chain 9. Les mutations de ce gène sont associées à différentes anomalies congénitales de
transmission autosomique dominante.
Fiche 1.5
Dosage de la thrombopoïétine (TPO) sérique
ou plasmatique
Code RIHN E032

La thrombopoïétine (TPO) est une cytokine qui indications de prescription
stimule la formation et la prolifération des méga- 1. Thrombopénies : déterminer si la thrombopé-
caryocytes (MK) et des cellules souches, mais nie est liée à une anomalie de production (défaut
aussi certaines fonctions des plaquettes. La TPO de MK) ou à une anomalie par excès de des-
est synthétisée essentiellement par le foie (cellules truction (purpura thrombopénique idiopathique,
parenchymateuses, cellules endothéliales sinusoï- PTI). Les taux de TPO les plus élevés sont
dales) et le micro-environnement médullaire. Elle retrouvés dans les thrombopénies par défaut de
est également produite dans une moindre mesure production dans les aplasies médullaires. Dans ce
par le rein (cellules des tubules proximaux) et par cas, une corrélation inverse est observée entre le
les muscles striés. taux de TPO et le nombre de plaquettes. Chez
La synthèse hépatique de la TPO est régulée par les patients avec PTI, on trouve des taux de TPO
l’interleukine-6 (IL-6) et son élimination par son variables selon les études : soit normaux, soit plus
récepteur MPL (CD110). La fixation de la cyto- élevés que la normale, mais inférieurs à ceux des
kine sur son récepteur induit une internalisation patients ayant une aplasie médullaire.
du couple cytokine/récepteur conduisant ainsi 2. Thrombocytoses : déterminer chez les rares pa
à une diminution de la quantité de TPO dis- tients sans anomalies moléculaires caractéristiques
ponible pour stimuler les autres cellules portant des néoplasies myéloprolifératives (thrombocyté-
ce récepteur. De ce fait, la masse plaquettaire mie essentielle, TE) si une production de TPO
et de MK conditionne directement les taux de augmentée est responsable de la thrombocytose.
TPO. Un taux bas de plaquettes et de MK induit Les résultats de la littérature sont variables, avec
une augmentation des taux de TPO et donc une des taux normaux ou élevés.
plus grande quantité de cytokine potentiellement
disponible pour se fixer, stimuler, faire proliférer Place dans la hiérarchie d’un
et maturer les progéniteurs mégacaryocytaires. bilan d’exploration
Inversement, un taux élevé de plaquettes est censé
Le dosage de la TPO est un élément de seconde
induire une diminution des taux de TPO par
intention dans l’évaluation des thrombopénies et
captation accrue de la cytokine.
des thrombocytoses.
Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou EDTA ou hépariné : à vérifier auprès du laboratoire exécutant.
Recommandations pour la Néant.
Contraintes d’achemi- Température ambiante si transport rapide, sinon isolement du plasma ou du sérum réfrigéré à + 4 °C
nement ou congelé à – 20 °C (à vérifier auprès du laboratoire exécutant).
Mode de conservation Réfrigération pendant 2-3 jours, congélation au-delà. Éviter les congélations et décongélations répé-
tées. Aliquoter les échantillons avant de les congeler. Éviter les échantillons hémolysés ou lipidiques.
En cas de dosage sur plasma, préparer un plasma pauvre en plaquettes. Conditions à vérifier auprès
du laboratoire exécutant.
Principe méthodologique Immunodosage de type sandwich.
Type de méthode Méthode manuelle (ELISA).
Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou EDTA ou hépariné : à vérifier auprès du laboratoire exécutant.
CIQ CIQ du fournisseur de réactifs, pool de sérums.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Les performances du dosage de TPO ne sont pas établies en termes de sensibilité et de spécificité.
Interprétation et Par ailleurs, les résultats de la littérature ne sont pas tous concordants.
performances Un fait est cependant retrouvé dans toutes les études : des taux très élevés de TPO sont mesurés
dans les thrombocytopénies par défaut de production de plaquettes comme dans les aplasies
médullaires. Des taux normaux ou moyennement élevés de TPO sont mesurés chez les patients
avec PTI.
Dans les thrombocytoses, les taux de TPO sont variables : normaux ou élevés et peuvent permettre
dans certains cas d’orienter vers un diagnostic.
Causes d’erreur, limites En cas de dosage sur plasma, la préparation du plasma est un facteur de variation du taux de TPO.
du test Il faut autant que possible préparer un plasma pauvre en plaquettes car le récepteur à la TPO est
présent sur les plaquettes.
Fiche 1.6
Frottis sanguin. Frottis : immunomarquage
sur lame par Ac
Code LC E157

Le frottis sanguin est un étalement sur lame d’une indications de prescription
goutte de sang veineux ou capillaire prélevé sur Le frottis sanguin est réalisé devant certaines
anticoagulant EDTA. Il permet, par observation alarmes analytiques déclenchées par les auto-
microscopique après coloration, la réalisation de mates, devant des anomalies quantitatives de
la formule leucocytaire sanguine, l’évaluation de l’hémogramme, notamment à la recherche de
la morphologie des différents éléments figurés cellules anormales ou pour une analyse mor-
du sang (leucocytes, hématies, plaquettes) et la phologique spécifique. La recherche d’antigènes
recherche de cellules anormales. Il est égale- cellulaires par immunomarquage concerne des
ment possible d’utiliser les frottis sanguins pour marqueurs non détectables en cytométrie en flux,
détecter certains antigènes cellulaires par immu- par exemple les PML2-bodies ou NPM13 dont la
nomarquage, mais ceci reste exceptionnel. Ce localisation est modifiée en conditions patholo-
code concerne seulement les immunomarquages giques (translocation du noyau au cytoplasme).
mais cette fiche détaille les analyses manuelles
d’identification des éléments figurés du sang, qui Place dans la hiérarchie d’un
font partie intégrante de l’hémogramme, suite bilan d’exploration
à la génération d’alarmes par les automates (cf.
Le frottis sanguin coloré est un examen biolo-
Fiche 1.1).
gique de deuxième intention faisant suite à un
hémogramme pathologique.

Recommandations pour la qualité du prélèvement Étalement sur lame à réaliser dans les 12 heures suivant le prélèvement.
La coloration et la lecture peuvent être différées. Il en va de même pour
les immunomarquages.
Mode de conservation Température ambiante dans un endroit sec et à l’abri de la poussière.
Principe méthodologique Étalement manuel ou réalisé par un automate étaleur-colorateur. Colo-
ration des frottis au May-Grünwald Giemsa puis lecture microscopique
aux objectifs × 10, ×50 et ×100. Immunomarquage avec révélation en
fluorescence ou en immunocytochimie.
Type de méthode Méthode manuelle automatisable par analyse d’image.
CIQ Maison.
EEQ Oui.

Valeurs de référence/Interprétation et performances Le frottis sanguin doit être lu par un cytologiste averti, qu’il s’agisse de
l’observation microscopique ou de la validation du classement proposé
par l’analyseur d’image. En plus des décomptes des types cellulaires, il
permet la mise en évidence et la caractérisation de cellules anormales,
et/ou d’anomalies morphologiques d’éléments normalement présents.
Causes d’erreur, limites du test Conditions pré-analytiques :
- échantillon trop âgé altérant la morphologie des cellules ;
- mauvaise homogénéisation du prélèvement avant réalisation de
l’étalement.
Conditions analytiques :
- qualité de la coloration au MGG, notamment le pH de l’eau ;
- expérience du cytologiste.
2. PML-bodies : granules nucléaires délocalisés dans le cytoplasme des blastes des leucémies promyélocytaires
(ProMyelocytic Leukemia PML).
3. NPM : NnucléoPhosMine délocalisée dans le cytoplasme des blastes leucémiques en cas de mutation.
Fiche 1.7
Cytologie des liquides et appositions
Code LC E200
Signification biologique du paramètre • vitré : recherche d’un lymphome oculaire ; dans

Plusieurs types de liquides biologiques peuvent ce cas, l’analyse en cytométrie en flux et un dosage
contenir, de façon normale ou anormale, des d’IL-10 sont indiqués ;
éléments cellulaires. L’analyse cytologique de • lavage broncho-alvéolaire (LBA) : suspicion
ces liquides permet de dénombrer et caractériser de syndrome lymphoprolifératif, de sarcoïdose,
ces cellules. À noter que, dans de nombreux d’alvéolite allergique, de pneumonie à éosino-
cas, cet examen cytologique peut être complété philes, de métastases d’une tumeur solide ;
utilement par une étude en cytométrie en flux. • liquide pleural, liquide d’ascite : suspicion de
Les appositions consistent à effleurer la surface lymphome ;
d’une lame de verre avec la tranche d’une pièce • ganglion : suspicion de lymphome, d’envahis-
biopsique (en hématologie essentiellement un sement métastatique d’une tumeur solide.
ganglion excisé et coupé ou une biopsie ostéo-
médullaire) de manière à déposer une couche des Place dans la hiérarchie d’un
cellules composant ce tissu. L’examen cytologique bilan d’exploration
après coloration permet alors de déterminer si L’examen du LCR fait partie du bilan d’extension
l’échantillon est normal ou contient des éléments des leucémies aiguës lymphoblastiques et des leu-
tumoraux. cémies aiguës myéloblastiques hyperleucocytaires
ou accompagnées de signes neurologiques. Il est
Objectifs de l’analyse et principales également indiqué en première ligne en cas de
indications de prescription suspicion d’un lymphome du système nerveux
Les objectifs et les indications hématologiques central. La décision de ponctionner un liquide
varient selon les échantillons : ou de réaliser un LBA fait rapidement suite à
• liquide céphalo-rachidien (LCR, aussi appelé l’examen clinique ou d’imagerie dans la prise en
fluide cérébro-spinal) : la plupart du temps, il charge initiale des patients ou en cas de suspicion
s’agit du bilan d’extension d’une leucémie aiguë de rechute. L’excision ou la biopsie de ganglions
ou d’une suspicion de lymphome du système suspects sont fréquemment remplacées ou précé-
nerveux central ; dées par une ponction à l’aiguille, moins invasive,
qui peut aussi être analysée en anatomocytopa-
thologie.
Nature du prélèvement Dépend du site prélevé.

Recommandations pour la qualité du prélèvement Les liquides non hémorragiques peuvent être recueillis sur tube
sec sans anticoagulant. Certains centres utilisent des produits de
conservation pour le LCR mais ces derniers diluent l’échantillon et
faussent la numération des éléments cellulaires. Les appositions
doivent être faites très légèrement pour déposer une couche
cellulaire la plus fine possible (monocellulaire) et sans mouvement
latéral pour ne pas déformer les cellules.
Contraintes d’acheminement Le plus rapidement possible, idéalement l’analyse doit être réalisée
dans les 2 heures.
Mode de conservation À température ambiante.
Principe méthodologique Pour les liquides, une numération est d’abord réalisée au microscope
à l’aide d’un hématimètre, éventuellement après dilution en tampon
salin, dont il faudra tenir compte pour exprimer les résultats (en
nombre de cellules par mm3). Seuls les éléments nucléés, repérables
en augmentant le contraste de phase, sont énumérés. Il est possible
d’ajouter un colorant vital (bleu trypan) pour évaluer le nombre de
cellules mortes. Un aliquote de l’échantillon est ensuite étalé sur
lame à l’aide d’une cytocentrifugeuse, éventuellement en ajoutant un
peu de sérum de veau fœtal ou d’albumine humaine pour protéger
les cellules. Après séchage de l’étalement, une coloration MGG clas-
sique est réalisée avant l’examen microscopique. À noter que des
éléments microbiens ou certains parasites peuvent également être
détectés dans certains liquides (surtout LBA). Une coloration de Perls
des LBA peut être réalisée pour évaluer la présence d’hémosidérine
dans les macrophages, associée aux hémorragies intra-alvéolaires.
Pour les appositions, après séchage, une coloration classique est
réalisée avant examen au microscope.
Type de méthode Méthode manuelle. Certains automates de numération proposent un
module « liquides ».
CIQ Non.
EEQ Commerciaux.
Valeurs de référence/Interprétation et performances Normalement le LCR et le vitré sont acellulaires. La composition
normale d’un LBA est connue, comportant essentiellement des
macrophages (∼90 %), quelques lymphocytes T avec un rapport
CD4/CD8 normal (∼2), des polynucléaires neutrophiles et éosinophiles.
Un épanchement pleural ou ascitique est par définition anormal mais
peut ne contenir que des éléments inflammatoires réactionnels.
Causes d’erreur, limites du test Les liquides hémorragiques peuvent être contaminés par des
éléments anormaux présents dans le sang (blastes, cellules lym-
phomateuses) et peuvent être ininterprétables. Les LBA contenant
trop de cellules bronchiques (cellules ciliées, normalement < 5 %)
peuvent également donner des résultats erronés non représentatifs
du contenu alvéolaire.
Fiche 1.8
Myélogramme
Code NABM 1101
Signification biologique du paramètre • une insuffisance rénale ou une neuropathie péri-

Le myélogramme est une ponction-aspiration de phérique non expliquée (c’est-à-dire myélome).
moelle osseuse permettant l’analyse cytologique, Un myélogramme est également réalisé pour :
cytochimique, phénotypique, caryotypique et • effectuer une étude des molécules membra-
moléculaire des précurseurs des cellules sanguines naires et cytoplasmiques par cytométrie en flux
matures. Il permet de distinguer les anomalies des cellules hématopoïétiques normales, anor-
hématologiques d’origine médullaire centrale des males ou extra hématopoïétiques ;
anomalies hématologiques d’origine périphérique • réaliser un examen cytogénétique et/ou molé-
mais nécessite de bien connaître le contexte cli- culaire médullaire ;
nique et biologique au préalable. • évaluer la maladie résiduelle ;
• effectuer une congélation de cellules médul-
laires.
Il peut aussi être utile pour rechercher une exten-
sion médullaire d’un cancer chez un patient por-
Le myélogramme est réalisé pour le diagnos- teur d’une tumeur solide.
tic d’une ou plusieurs anomalies hématologiques
d’origine centrale, pour évaluer les réserves Place dans la hiérarchie d’un
médullaires en fer (très rarement), pour le suivi bilan d’exploration
de certaines hémopathies malignes, pour l’éva-
luation de la maladie résiduelle, mais aussi devant Le myélogramme n’est pas un examen de pre-
certaines situations cliniques particulières. mière intention en dehors de l’observation sur le
Un myélogramme doit être réalisé devant : frottis sanguin de cellules anormales (blastes, cel-
• une thrombopénie significative non expliquée lules lymphomateuses). Il est indispensable avant
en première intention par la présence d’agrégats sa réalisation d’éliminer toutes les causes périphé-
plaquettaires, une prise médicamenteuse, une riques possibles des anomalies observées (en parti-
maladie auto-immune ou une coagulation intra- culier les cytopénies). Ainsi, on doit établir la liste
vasculaire disséminée (CIVD) ; des médicaments pris par le patient à la recherche
• une neutropénie significative non expliquée en d’une éventuelle toxicité (thrombopénie, neutro-
première intention par une prise médicamenteuse, pénie), réaliser un bilan infectieux (neutropénie) à
une infection bactérienne ou virale ; la recherche d’une infection bactérienne, virale ou
• une anémie non régénérative macrocytaire non parasitaire, mesurer le taux de réticulocytes devant
expliquée en première intention par une consom- une anémie normocytaire ou macrocytaire,
mation alcoolique ; effectuer des dosages vitaminiques et un bilan
• une pancytopénie non expliquée en première thyroïdien devant une anémie normocytaire ou
intention par une prise de cytotoxiques ou un macrocytaire non régénérative. Il faut également
hypersplénisme ; rechercher un hypersplénisme, donc effectuer un
• la présence sur le frottis sanguin de cellules bilan hépatique.
hématopoïétiques anormales (blastes) ; Cet examen peut aussi présenter également une
• une compression médullaire, qui ne fait pas sa valeur médico-légale et il est possible de réaliser
preuve rapidement (c’est-à-dire myélome) ; un prélèvement post mortem.
Nature du prélèvement Suc médullaire sur seringue sèche, héparinée ou sur tube EDTA.
Recommandations pour la qualité du Les frottis destinés à la coloration MGG doivent être étalés immédiatement.
prélèvement Les prélèvements destinés aux analyses cytogénétiques (héparinés),
phénotypiques et moléculaires (EDTA) doivent être homogénéisés.
Mode de conservation Température ambiante 12 heures maximum, prélèvement sur milieu de
conservation spécial au-delà.
Principe méthodologique Coloration des frottis médullaires au MGG. Mise en culture avec des agents
mitotiques pour l’analyse caryotypique. Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN
pour les analyses moléculaires.
Type de méthode Méthode manuelle.
Type de mesure Mesure qualitative et semi-quantitative.
CIQ Maison.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation et Le myélogramme s’il est correctement réalisé et cellulaire permet l’analyse
performances cyto-morphologique des cellules médullaires et la réalisation des analyses
complémentaires phénotypiques, cytogénétiques et moléculaires.
Causes d’erreur, limites En cas d’hémodilution du prélèvement, l’analyse est non contributive.
En cas de myélofibrose, la ponction-aspiration peut être un échec et contrain-
dre à la réalisation d’une biopsie ostéomédullaire, indispensable en cas de
prélèvement paucicellulaire. Dans certaines hémopathies focales (myélome), le
myélogramme peut être négatif en raison de l’absence de cellule pathologique
dans la zone de prélèvement.
La présence d’une thrombopénie, l’utilisation d’anticoagulants ou d’anti-
agrégants plaquettaires ne contre-indiquent pas le myélogramme.
Fiche 1.9
Étude complémentaire de cytochimie (moelle ou sang)
Code NABM 1102
Signification biologique du paramètre d’appartenance des blastes de leucémie aiguë.

L’observation microscopique des éléments figurés La recherche de dépôts de fer est un élément
du sang et de la moelle, après coloration, fournit du diagnostic des syndromes myélodysplasiques
beaucoup d’indications sur la nature et les pro- (cytopénie avec sidéroblastes en couronne) ou
portions des populations cellulaires présentes. Plu- d’hémophagocytose (macrophages contenant de
sieurs techniques cytochimiques peuvent apporter l’hémosidérine).
des informations complémentaires. La recherche
d’activités enzymatiques comme la myéloperoxy- Place dans la hiérarchie d’un
dase ou la butyrate estérase confirme l’apparte- bilan d’exploration
nance des cellules aux lignées granulocytaire ou Ces examens sont de seconde intention après
monocytaire. La recherche de fer mitochondrial ou l’examen morphologique. Ils peuvent être réalisés
macrophagique par la coloration de Perls caracté- sans nouveau prélèvement sur un frottis sanguin
rise les sidéroblastes et les dépôts d’hémosidérine. ou médullaire (lames blanches effectuées à partir
d’une goutte de sang de l’hémogramme ou lors
Objectifs de l’analyse et principales de l’aspiration médullaire).
Les recherches d’activités enzymatiques sont
des éléments de confirmation de la lignée
Nature du prélèvement Sang ou moelle sur EDTA, étalés sur lame de verre.
Recommandations pour la qualité Étalements de bonne qualité.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement NA
Mode de conservation Température ambiante. Lames d’étalement non colorées.
Principe méthodologique La recherche de myéloperoxydase et de butyrate estérases repose sur une réaction enzyma-
tique (activité fonctionnelle de l’enzyme) avec un substrat générant un dépôt coloré dans les
cellules. Pour la myéloperoxydase, il s’agit d’une réaction cytochimique basée sur l’oxydation
d’un substrat chromogène, la benzidine, précipitant sous forme de granulations marron-vert
ou l’alpha-naphtol pyronine qui précipite en un produit rouge. Pour les butyrates estérases,
on réalise une hydrolyse de l’alpha-naphtyl butyrate qui produit une coloration rouge brun. Il
est également possible de rechercher les estérases non spécifiques (NASDA) par hydrolyse
du Naphtol-ASD-Acétate qui produit des précipités bleus. À noter que la recherche de
l’antigène myéloperoxydase est couramment réalisée en cytométrie en flux. Cette méthode
permet aussi l’identification antigénique du lysozyme dans les cellules engagées dans la
lignée monocytaire.
La coloration de Perls repose sur une coloration du fer ferreux (Fe3+), coloré en bleu par le
bleu de Prusse.

Type de test Mesure qualitative mais numération des sidéroblastes en couronne et des blastes positifs
pour la myéloperoxydase.
CIQ Témoins maison.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Interprétation L’interprétation est aidée par la présence de ces enzymes dans les éléments résiduels
et performances d’hématopoïèse normale (polynucléaires neutrophiles, monocytes). Classiquement, le seuil
de 3 % de cellules marquées est retenu pour la MPO. Un taux de sidéroblastes en couronne
entre 5 et 15 % peut justifier la demande d’une recherche de mutation de SF3B1.
Causes d’erreur, limites du test Certains marquages très faibles peuvent être difficiles à interpréter et nécessitent de répéter
la réaction ou d’utiliser une autre technique comme la cytométrie en flux.
Fiche 1.10
Diagnostic des hémopathies malignes (moelle ou sang)
Code NABM 1105
Signification biologique du paramètre précisé et complété afin d’orienter au mieux le

Les hémopathies malignes constituent un groupe traitement mais aussi de permettre son suivi, aussi
de pathologies cancéreuses du système hémato- bien pour affirmer la rémission que pour détecter
poïétique hétérogènes aussi bien par leur présen- précocement une rechute. Il repose à l’heure
tation clinique que par leur gravité, leur traitement actuelle sur une démarche intégrée associant un
et leur pronostic. Ces différences dépendent en faisceau d’arguments et d’examens : la cytologie,
grande partie du caractère aigu ou chronique l’immunophénotypage, la cytogénétique et la bio
de l’installation de l’hémopathie mais aussi de la logie moléculaire.
lignée hématopoïétique concernée (lymphoïde ou
myéloïde) et du stade de différenciation à l’ori- Place dans la hiérarchie d’un
gine du processus malin. De plus, pour la majorité bilan d’exploration
des hémopathies malignes, les traitements restent Selon l’hémopathie suspectée, un ou plusieurs
très lourds, souvent basés sur des associations de de ces examens complémentaires devront être
chimiothérapies, et le pronostic demeure souvent réalisés afin d’établir le diagnostic. Pour les leucé-
sombre. Le diagnostic d’une hémopathie maligne mies aiguës, ces quatre examens sont requis. En
est donc une étape essentielle qui consiste non revanche, le diagnostic d’une leucémie lymphoïde
seulement à affirmer le caractère tumoral et malin chronique pourra être réalisé simplement par un
des cellules hématopoïétiques en cause, mais aussi immunophénotypage sur le sang périphérique, les
à typer avec précision la nature, la lignée et autres explorations ne devenant utiles qu’en cas
les propriétés particulières de ces cellules. Cette d’évolution de la pathologie nécessitant l’initia-
démarche diagnostique est indispensable pour tion d’un traitement.
délivrer le traitement le plus adapté au patient. La cytologie reste à l’heure actuelle le premier
examen à réaliser et le point d’appel des autres
Objectifs de l’analyse et principales examens complémentaires. Depuis de nom-
indications de prescription breuses années, elle est épaulée et consolidée
Une hémopathie maligne peut survenir à tous les dans la foulée par l’immunophénotypage, qui
âges de la vie. Elle peut être suspectée devant des permet de compléter et de conforter le diagnostic
signes cliniques évocateurs d’un processus tumo- dans la même journée. La cytogénétique et la
ral (altération de l’état général, perte de poids, biologie moléculaire demandent des délais plus
sueurs nocturnes, adénopathies, saignements, longs (quelques jours). L’immunophénotypage
infections, asthénie, etc.) mais peut aussi être est une technique de cytométrie en flux qui
découverte de manière complètement fortuite permet de déterminer précisément le lignage de
sur un bilan sanguin systématique. Le diagnostic l’hémopathie en mettant en évidence les antigènes
est apporté par un prélèvement de sang périphé- présents à la surface ou à l’intérieur des cellules
rique et/ou de moelle osseuse (myélogramme ou hématopoïétiques tumorales. D’autre part, la
biopsie ostéo-médullaire) et/ou d’un ganglion ou cytogénétique et la biologie moléculaire présen-
masse tumorale. Certains épanchements permettent un intérêt pronostic par la mise en évidence
tent également de porter ce type de diagnostic. Le de réarrangements chromosomiques et/ou de
typage de l’hémopathie maligne doit ensuite être mutations géniques.
Nature du prélèvement Sang, moelle osseuse, ganglions, tumeurs, épanchements.

Recommandations pour la qualité du prélèvement Prélèvement sur tube EDTA, sans autre condition particulière.
Moelle osseuse : limiter au maximum l’hémodilution en ne prélevant
que le volume minimal requis.
Pas d’anticoagulant pour les épanchements.
Biopsies à l’état frais en anatomocytopathologie qui peut éventuellement
réaliser des appositions et/ou demander une cytométrie en flux avant
de réaliser la fixation et l’inclusion en paraffine pour examen de coupes
tissulaires.
Mode de conservation Température ambiante ou congélation. Fixation pour une partie des
pièces biopsiques.
Principe méthodologique Cytologie, immunophénotypage, cytogénétique, biologie moléculaire
(voir items correspondants).
Type de méthode Méthodes manuelles ou semi-automatisées.
Type de test Mesure qualitative et quantitative.
CIQ Maison et commerciaux.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation et performances Ces examens spécialisés dépendent des compétences des
biologistes entraînés qui les réalisent.
Causes d’erreur, limites du test Prélèvements coagulés, ponctions blanches, hémodilution.
Fiche 1.11
Vitesse de sédimentation

La vitesse de sédimentation est la mesure de indications de prescription
la hauteur de plasma surmontant les éléments Une vitesse de sédimentation – ou actuellement, de
figurés du sang après incubation à 1g dans un préférence, une mesure des protéines de l’inflam-
tube vertical calibré pendant respectivement une mation comme la protéine C réactive, les alpha2
heure et deux heures. Normalement, les héma- globulines ou le fibrinogène – est indiquée en
ties, leucocytes et plaquettes, en suspension dans cas de suspicion d’une pathologie inflammatoire,
du sang anticoagulé, sédimentent très lentement aiguë ou chronique. Les principales indications
dans le plasma. Les protéines de l’inflammation, sont les infections et les pathologies chroniques
qui peuvent être en grande quantité dans le sang, comme la polyarthrite rhumatoïde. Elle peut être
accélèrent la vitesse de sédimentation. Il en va de augmentée dans certains cancers, ainsi que dans
même pour les immunoglobulines monoclonales les anémies hémolytiques auto-immunes où les
ou paraprotéines du myélome multiple et des anticorps agglutinent les hématies. Il s’agit égale-
pathologies apparentées qui empilent les hématies ment d’un moyen de suivi thérapeutique.
en « rouleaux » (visibles sur un état frais ou un
frottis sanguin) qui sédimentent plus vite. La Place dans la hiérarchie d’un
vitesse de sédimentation est donc un reflet de bilan d’exploration
l’état inflammatoire du patient. Cet examen est
La mesure des protéines de l’inflammation est
maintenant obsolète.
un examen de première ou deuxième ligne, à
réaliser en même temps qu’un hémogramme ou
en fonction des résultats de ce dernier.

Recommandations pour la qualité du prélèvement Examen à réaliser rapidement suivant le prélèvement.
Principe méthodologique Des tubes calibrés sont positionnés de façon verticale dans un
endroit stable et calme après avoir été remplis de sang anticoagulé
bien homogénéisé. La hauteur de plasma est mesurée à 1 h, 2 h,
voire 24 h, sans que le tube ait été déplacé. Il existe des techniques
rapides de mesure de la vitesse de sédimentation par centrifugation
standardisée en tubes calibrés.
CIQ Non.
EEQ Oui, commerciaux.
Valeurs de référence/Interprétation et performances La vitesse de sédimentation normale est de 2 à 5 mm à la première
heure, 5 à 10 mm à la deuxième heure, un peu plus rapide chez la
femme.
Causes d’erreur, limites du test Sang coagulé, déplacement des tubes de mesure.
Bibliographie du chapitre 1 immune thrombocytopenia : a multicentric, real life

study. Br J Haematol 2013;162:112–9.
FICHE 1.1 – Hémogramme y compris plaquettes
FICHE 1.5 – Dosage de la Thrombopoïétine (TPO)
Geneviève F, Godon A, Marteau-Tessier A, et al. Ano-
sérique ou plasmatique
malies et erreurs de détermination de l’hémo-
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Chapitre 2
Cytométrie en flux

Fiche 2.1
Phénotypage des cellules anormales (moelle ou sang)
Code NABM 1103
Signification biologique du paramètre cellule : présentation ou reconnaissance de l’antigène,

Les cellules anormales de la moelle et du sang sont activation cellulaire, adhésion, activité enzymatique,
caractéristiques des leucémies, des syndromes lym- etc. Il en existe à ce jour plus de 360 qui permettent,
phoprolifératifs (SLP), des néoplasies myéloprolifé- indépendamment de ces fonctions cellulaires, la clas-
ratives (NMP) ou des syndromes myélodysplasiques sification des cellules. C’est sur la reconnaissance de
(SMD). Dans tous les cas, ces cellules sont absentes ces antigènes par des anticorps monoclonaux couplés
du sang ou de la moelle normale ou y sont très peu chacun à un fluorochrome que s’appuie la technique
représentées. L’immunophénotypage par cytométrie d’immunophénotypage en cytométrie en flux. Celle-
en flux est une technique qui permet d’analyser les ci est essentielle dans le diagnostic de la majorité des
cellules en mettant en évidence des antigènes spéci- hémopathies malignes afin d’affirmer d’une part
fiques de lignée à leur surface, dans leur cytoplasme le caractère malin des cellules suspectes et d’autre
ou dans leur noyau, grâce à des anticorps mono- part de préciser leur lignage (lymphoïde B, T, NK,
clonaux couplés chacun à un fluorochrome et dirigés myéloïde [progéniteurs]), granuleux, monocytaire,
spécifiquement contre les antigènes recherchés. Dans plaquettaire, érythroblastique, etc.). Un immuno-
le cas des hémopathies malignes, les cellules suspectes phénotypage doit ainsi être réalisé lors d’une sus-
sont analysées vis-à-vis de chacun des marqueurs tes- picion d’hémopathie maligne. Il est indispensable
tés. Ces marqueurs sont combinés entre eux afin de au diagnostic des leucémies aiguës. Dans les SLP, il
déterminer le lignage de l’hémopathie et d’en pré- permet d’affirmer la monotypie B, de déterminer les
ciser le diagnostic. À ce jour, les cytomètres utilisés caractéristiques spécifiques de certaines entités (LLC,
en routine peuvent combiner jusqu’à 13 anticorps LCM, LF, MM1, etc.) et d’identifier les trous phéno-
dans un même tube, ce qui porte à 15 le nombre de typiques des proliférations T/NK. Il prend une place
paramètres analysés par tube en tenant compte des croissante dans le diagnostic intégré des SMD. Il est
paramètres optiques de taille et de structure. plus rarement demandé dans les NMP, mais a une
Les combinaisons des anticorps conjugués dans place dans le dépistage sanguin des leucémies myélo-
les tubes analysés en cytométrie constituent un monocytaires chroniques (LMMC). Il est aussi utile
« panel ». Certains panels comportent plusieurs pour la recherche de maladie résiduelle (MRD)2.
tubes. Pour une meilleure analyse comparative,
certains panels comportent quelques anticorps Place dans la hiérarchie d’un
identiques dans chaque tube. On parle de backbone. bilan d’exploration
D’une manière générale, l’utilisation de CD45 est L’immunophénotypage est essentiel pour le diag-
une constante dans ces panels. Cet anticorps pan- nostic et le suivi de la majorité des hémopathies,
leucocytaire permet de réaliser une « cartographie » en seconde ligne après l’examen morphologique,
des cellules nucléées sanguines et médullaires. ou de façon concomitante. C’est une technique
rapide qui permet de préciser le diagnostic dans
les heures qui suivent l’arrivée du prélèvement.
Elle présente également l’avantage de pouvoir
indications de prescription être réalisée sur différents liquides biologiques, les
Toutes les cellules présentent à leur surface des plus communs étant le sang et la moelle osseuse,
protéines, dénommées Cluster of Differentiation (ou voire sur des tissus (ganglion, leucémide, plas-
CD) dont les propriétés sont multiples pour la mocytome, etc.).
Chapitre 2. Cytométrie en flux 29
Nature du prélèvement Sang, moelle osseuse, ganglion, tissu. LCR dans les deux heures.
Recommandations Prélèvement sur tube EDTA, sans autre condition particulière.
pour la qualité du Moelle osseuse : limiter au maximum l’hémodilution en ne prélevant que le volume minimal requis (1 mL
prélèvement maximum, idéalement dans une nouvelle logette).
Liquides : sans anticoagulant sauf si hémorragique. LCR et vitré dans les deux heures.
Tissus : dans une compresse imbibée de sérum physiologique.
Contraintes d’achemi- Température ambiante.
nement
Mode de conservation Température ambiante, de préférence à plat. Exceptionnellement à + 4 °C.
Principe méthodolo- Après une première phase fluidique où les cellules marquées par les anticorps sont guidées par un liquide de
gique gaine, elles passent une par une devant un faisceau laser (excitation) qui provoque l’émission d’une lumière
dans une autre longueur d’onde (émission) par les fluorochromes. Cette lumière émise est recueillie et trans-
formée en signal électronique. Concomitamment, les caractéristiques de taille et de granularité des cellules
sont recueillies en fonction de la diffraction du faisceau laser par les cellules seules.
Type de méthode Méthode manuelle, le cytomètre n’est pas un automate. Il existe cependant des automates de préparation
des échantillons. La phase d’interprétation des signaux acquis est cruciale.
CIQ Commerciaux
EEQ Oui mais peu.
Valeurs de référence/ La présence de cellules anormales est par définition une anomalie. Par convention, le marquage de
Interprétation et 10 % des cellules d’un échantillon est considéré comme significatif. Une meilleure appréciation consiste
performances à comparer l’expression d’un marqueur sur une population cellulaire à celle des éléments « normaux »
de l’échantillon. Un moyen efficace est de travailler sur des échantillons dans lesquels les globules
rouges ont été lysés, mais conservant toutes les populations leucocytaires. Une comparaison simple sur
un histogramme biparamétrique de la diffraction cellulaire (SSC, Side SCatter) versus chaque fluoro-
chrome permet une approche rapide de la « positivité » d’un marqueur. Cependant, l’interprétation d’un
immunophénotypage doit intégrer l’ensemble des paramètres mesurés, par l’utilisation d’histogrammes
biparamétriques de marqueurs deux à deux sur des populations ciblées et en ayant recours à la
projection de la population identifiée sur une cartographie CD45/SSC.
Causes d’erreur, limites L’identification des cellules anormales est une technique très sensible, mais qui souffre de façon
du test récurrente dans les prélèvements médullaires, de l’hémodilution des échantillons.
Pour les SLP-B, la nécessité de se débarrasser des immunoglobulines solubles du plasma, par un lavage
préalable de l’échantillon, fausse les données quantitatives. La perméabilisation, pour l’identification de
marqueurs intracellulaires, a le même effet.
La préparation manuelle des mélanges d’anticorps est une source d’erreur (oubli d’un marqueur,
saturation par double pipettage). La nécessité de compenser les signaux de fluorochromes émettant à
des longueurs d’onde voisines peut également conduire à de faux résultats (surcompensation ou sous-
compensation). Les stratégies de fenêtrage lors de l’analyse doivent être rigoureuses.
1. LLC : Leucémie lymphoïde chronique ; LCM : Lymphome à cellules du manteau ; LF : Lymphome folliculaire ;
MM : Myélome multiple.
2. MRD: Minimal Residual Disease ou Measurable Residual Disease.
Fiche 2.2
Quantification des cellules CD34+
Code LC E018
Signification biologique du paramètre dans le sang des cellules mobilisées (facteurs de

L’antigène de différenciation CD34 est une sialo- croissance et/ou chimiomobilisation). La quan-
mucine, protéine fortement glycosylée, exprimée tification des cellules CD34 est effectuée avant
sur les cellules souches hématopoïétiques et les de réaliser une autogreffe de CSP ou chez un
précurseurs les moins différenciés. La quantifica- donneur sain avant allogreffe de CSP ;
tion des cellules exprimant le marqueur de surface • la qualité hématopoïétique d’un greffon prélevé ;
CD34, qui reflète la quantité de ces progéniteurs, • la valeur pronostique du nombre de cel-
permet d’évaluer la capacité de reconstitution lules CD34+ dans le sang d’un patient atteint de
hématopoïétique de l’échantillon cellulaire testé. myélofibrose primitive (plus rare).

Déterminer : C’est un examen de première intention avant
• la possibilité d’effectuer une cytaphérèse de quantification des CFU-GM en culture pour
cellules souches périphériques (CSP) par analyse l’analyse d’un greffon (seule analyse dans le sang).
Nature du prélèvement Sang sur EDTA, greffon hématopoïétique (pour les cytaphérèses ou la greffe de cellules hématopoïétiques
médullaires
Recommandations pour la Limiter au maximum le délai d’analyse car la viabilité est un facteur évalué par le test.
Contraintes d’achemine- Non.
ment
Mode de conservation Température ambiante et analyse rapide.
Principe méthodologique Il s’agit d’une approche en immunofluorescence directe en cytométrie en flux utilisant les marqueurs
CD45 couplé au FITC (Fluorescein isotyhiocyanate) et CD34 couplé à la PE (phycoerythrine), associés
à une élimination des cellules mortes par exclusion des cellules marquées par le 7AAD.
Une adjonction de billes de quantification à l’échantillon permet une numération du nombre de
cellules CD34+ vivantes directement (valeur absolue) en s’affranchissant des calculs incluant la
viabilité ou la détermination du nombre de cellules nucléées (Malassez/automate). Cette technique
est dite en « simple plateforme ».
Type de méthode Des trousses sont disponibles, rassemblant les principaux réactifs pour la réalisation de la technique.
Certaines sociétés mettent à disposition un logiciel simplifiant l’analyse ou la ré-analyse sur leurs
cytomètres. Des systèmes commerciaux intégrés sont prévus pour automatiser la totalité du processus,
simplifiant ainsi l’accréditation.
Type de test Méthode de quantification du nombre de cellules CD34+.
CIQ Oui, commerciaux.
EEQ Oui, commercial.
Valeurs de référence/Inter- Le but est d’obtenir, en règle, une sensibilité de moins de 2 cellules/mm3 pour un chiffre absolu de
prétation et performances 10 cellules CD34+/mm3 qui est le seuil de déclenchement usuel du prélèvement par cytaphérèse.
Causes d’erreur, limites La présence de plaquettes en grand nombre ou de cellules en apoptose est la cause la plus fréquente
du test d’erreurs. Ce phénomène est normalement limité avec l’utilisation des trousses qui intègrent un
marqueur de viabilité.
Fiche 2.3
Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)
Code NABM 1119
Signification biologique du paramètre toute hémolyse à test de Coombs négatif, les

La détection d’un clone HPN, en cytométrie en aplasies médullaires, les myélodysplasies à moelle
flux (CMF), correspond à l’observation de cellules pauvre, les cytopénies inexpliquées et les throm-
déficitaires en molécules membranaires caractéri- boses profondes, en particulier les thromboses
sées par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol splanchniques.
(GPI). La perte de CD55 (DAF) et de CD59
(MIRL), molécules « GPI liées », régulatrices du Place dans la hiérarchie d’un
complément, à la surface des hématies, est res- bilan d’exploration
ponsable de l’hémolyse nocturne « complément La CMF est la technique de référence pour la
médiée » caractéristique de la maladie HPN clas- détection des clones HPN. Elle doit être réalisée
sique. Ce déficit en molécules GPI liées concerne en première intention sur les leucocytes (polynu-
plusieurs lignées sanguines et est total ou partiel, cléaires neutrophiles et monocytes). La détection
définissant respectivement les clones de type III sur les hématies doit être réalisée en deuxième
ou II, les cellules normales étant dites de type I. intention dans certains cas (cf. infra). La biolo-
gie moléculaire n’a pas sa place en dehors des
Objectifs de l’analyse et principales protocoles de recherche. Les techniques in vitro
indications de prescription d’hémolyse des hématies en gradient de pH ou
Le but de ce test est de mettre en évidence des en gradient de pI sont désuètes. L’analyse peut
« clones HPN » habituellement prépondérants se faire avec deux niveaux de sensibilité pour la
dans la maladie HPN classique qui est rare. Des détection de clones de taille de plus de 1 % dans
clones de petite taille sont observés plus fréquem- « l’HPN maladie » ou avec une forte sensibilité
ment dans les insuffisances médullaires. Ainsi les pour la détection de petits clones dans les autres
indications du test sont : une hémoglobinurie, situations.
Nature du prélèvement Sang sur EDTA.

Recommandations pour la À garder à température ambiante mais pas plus de 24 heures.
Contraintes d’acheminement Non.
Principe méthodologique En CMF multiparamétrique, le clone est recherché en première intention sur les leucocytes avec
des marqueurs de fenêtrage (CD45 Ag pan-leucocytaire, CD15 pour les polynucléaires [PN],
CD33 ou CD64 pour les monocytes [MN]) associés à des marqueurs « GPI liés » tels que CD24
ou CD16 (à noter que les éosinohiles n’expriment pas CD16) pour les PN et CD14 pour les
MN. FLAER, toxine bactérienne, couplée à un fluorochrome, marque toutes les molécules « GPI
liées » et est recommandée dans ces combinaisons. CD157 est aussi informatif sur les PN
et les MN. Dans un second temps, une recherche est effectuée sur les hématies avec CD235
(glycophorine A) pour le fenêtrage et CD55 + CD59. Les lymphocytes ou les basophiles sont
utilisés comme contrôles internes positifs.
Type de méthode Méthode manuelle, aucune trousse ni logiciel n’est disponible.
Type de test Mesure quantitative. La sensibilité du test dépend du nombre de marqueurs et des cellules
analysées. En fonction du nombre d’événements HPN, un résultat détectable ou quantifiable
(limites de détection ou de quantification) est obtenu.
CIQ Une mesure de la sensibilité de la combinaison utilisée doit être définie dans chaque laboratoire
sur des échantillons normaux. Il n’existe pas de CIQ.
EEQ Différents EEQ sont disponibles. La recommandation en France est de participer à l’échange
interlaboratoires qui est organisé avec l’Association Française de Cytométrie (AFC) à partir
d’échantillons frais et de cas virtuels à analyser.
Valeurs de référence/Inter- La sensibilité de 1 % est obtenue avec 2/3 marqueurs pour diagnostiquer l’HPN classique. La
prétation et performances haute sensibilité (0,01 %), avec 5 marqueurs, nécessite l’analyse de plus de 200 000 cellules
pour avoir un nuage de 20 cellules en cas de positivité. En cas de leucopénie qui ne permet
pas d’atteindre la limite de détection, il faut avoir recours à l’étude des hématies.
Causes d’erreur, limites du test La mortalité cellulaire est certainement une cause de détection de « faux petits clones », ce qui
nécessite de réaliser l’analyse aussi rapidement que possible. Les échantillons avec « myélé-
mie » génèrent des erreurs peu connues. Il ne faut pas effectuer ce test sur la moelle osseuse.
Il faut être prudent dans l’utilisation de CD16, GPI-lié sur les PN mais transmembranaire sur
les cellules NK qui peuvent être un bon témoin, mais il faut noter que les éosinophiles sont
CD16-. En cas de cytopénies, limitant l’analyse de nombreux PN, il faut effectuer l’analyse des
hématies. L’étude du clone sur les hématies donne néanmoins en règle une taille plus petite du
clone du fait de l’hémolyse et de la possibilité de transfusion d’hématies normales.
Fiche 2.4
Marquage cellulaire quel qu’il soit en cytométrie en flux
(par anticorps)
Code LC G0653
Signification biologique du paramètre Par exemple, l’immunophénotypage d’une leucé-

Le développement des anticorps monoclonaux a mie à tricholeucocytes nécessite dans un premier
conduit à la découverte de nombreux antigènes de temps d’identifier l’existence d’une restriction
différenciation leucocytaire. Leurs fonctions et les isotypique (monotypie des chaînes légères) sur
cellules auxquelles ils sont associés ont donné lieu à une population B CD19+ CD5- puis de confirmer
de nombreux travaux. Il existe désormais un consen- l’expression sur ces cellules des antigènes CD11c,
sus sur les marqueurs à rechercher sur des cellules CD25, CD103 et/ou CD123. La recherche de
normales ou anormales pour déterminer leur lignée sous-populations fonctionnelles spécialisées de
et poser un diagnostic reposant sur des proportions lymphocytes T nécessite également de vérifier la
anormales ou une expression atypique d’antigènes. co-expression ou l’expression sélective de cer-
Les mélanges d’anticorps, dans un ou plusieurs tains marqueurs. Cet item de la nomenclature
tubes, constituent des panels. Il est possible d’appli- a été proposé pour pouvoir tenir compte des
quer cette méthode à un grand nombre de types marqueurs additionnels nécessaires, en sus des
d’échantillons : sang, moelle, liquides biologiques, 8 premiers et jusqu’à 24 au total pour réaliser ces
liquides de lavage, cellules tissulaires dissociées, etc. immunophénotypages.

Les panels d’anticorps utiles pour le diagnostic de Il s’agit d’examens de première/deuxième inten-
pathologies hématologiques ou immunologiques tion dans le diagnostic d’une suspicion d’hémopa-
peuvent comporter un nombre de marqueurs thie sur la base d’un hémogramme anormal ou
dépassant les 8 anticorps figurant dans le code d’images morphologiques atypiques. Un immu-
NABM 1103. C’est le cas pour les leucémies nophénotypage exhaustif permet de poser un
aiguës ou certains syndromes lymphoprolifératifs. diagnostic en quelques heures, facilitant la prise
en charge rapide des patients.
Nature du prélèvement Sang périphérique ou moelle osseuse sur EDTA. Tube sec pour la majorité des liquides. Cellules
fraîchement dissociées (ex. ganglion).
Recommandations pour la Analyse dans les 24 heures.
Contraintes d’achemine- NA.
ment
Principe méthodologique L’immunophénotypage repose sur l’incubation de l’échantillon à tester avec un mélange d’anticorps
monoclonaux conjugués à des fluorochromes. La technique la plus simple est dite de « lyse sans
lavage » et consiste à incuber directement l’échantillon avec les anticorps, à lyser les hématies si
nécessaire et à analyser l’échantillon avec un cytomètre en flux (il est également possible de les
examiner en microscopie UV). Les lavages peuvent parfois améliorer la résolution des signaux mais
entraînent une perte aléatoire de cellules. Dans certains cas, s’il est nécessaire d’augmenter la
concentration cellulaire, une lyse préalable des hématies peut être réalisée dans ce qui est appelé
une lyse macrovolume.
Nature du prélèvement Sang périphérique ou moelle osseuse sur EDTA. Tube sec pour la majorité des liquides. Cellules
fraîchement dissociées (ex. ganglion).
Type de méthode Méthode manuelle. Le cytomètre en flux n’est pas un automate. À noter qu’il existe des automates de
préparation.
CIQ Commerciaux pour certains marqueurs.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- Il est nécessaire de bien connaître les caractéristiques immunophénotypiques associées aux
prétation et performances pathologies suspectées. L’interprétation nécessite un biologiste expérimenté capable d’analyser les
marquages parfois complexes impliquant des stratégies de fenêtrage pouvant être sophistiquées pour
certaines populations rares, notamment dans le cadre de la recherche de maladie résiduelle (MRD).
Causes d’erreur, limites Hémodilution pour les prélèvements de moelle osseuse, inadéquation des quantités d’anticorps.
du test
3. Voir aussi la fiche 2.1, Phénotypage des cellules anormales, NABM 1103.

Fiche 2.5
Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux
Code RIHN E003

Le contenu en ADN d’une cellule peut être mesuré indications de prescription
de façon précise en cytométrie en flux en utili- La mesure du cycle cellulaire en cytométrie en
sant un intercalant fluorescent, se liant à l’ADN flux permet d’apprécier la ploïdie et le taux
cellulaire de façon stœchiométrique. Ainsi, les de prolifération des leucémies aiguës. C’est un
différentes phases du cycle cellulaire, de G0 à G2 examen qui n’a pas d’application directe, sauf
se traduisent par une fluorescence croissante de la pour une appréciation rapide de la ploïdie qui a
cellule. Appliquée à une population tumorale, cette une valeur pronostique dans les leucémies aiguës
méthode permet de mesurer le taux de proliféra- lymphoblastiques (LAL) de l’enfant. Ce résultat
tion cellulaire. Une évaluation précise des popula- est également obtenu, mais après quelques jours,
tions en phase G0/G1, en phase S et en phase G2 par l’étude du caryotype en cytogénétique héma-
peut être dérivée des histogrammes de fluores- tologique ou en SNP (Single Nucleotide Polymor-
cence. Cette méthode permet aussi d’évaluer la phism) array qui qualifie les gains et les pertes de
ploïdie, les cellules hypoploïdes ayant une fluores- chromatine.
cence diminuée par rapport à des cellules témoins
quiescentes (par exemple des lymphocytes) alors Place dans la hiérarchie d’un
que les clones hyperploïdes ont une fluorescence bilan d’exploration
augmentée. Enfin, les cellules en apoptose présen-
Examen de seconde intention après le diagnostic.
tent une fluorescence en sub-G1 caractéristique
traduisant la perte progressive d’ADN consécutive
à la fragmentation des nucléosomes.
Nature du prélèvement Sang périphérique ou aspiration médullaire.

Recommandations pour la Acheminement rapide au laboratoire.
Contraintes d’achemine- Température ambiante.
ment
Principe méthodologique Cette technique de cytométrie en flux consiste à incuber un aliquote de sang ou de moelle osseuse
(100 µL) avec une solution contenant un perméabilisant des membranes, de la RNAse (pour éviter
le marquage de l’ARN) et un intercalant fluorescent tel que l’iodure de propidium. Le perméabilisant
lyse les hématies et permet à l’intercalant de pénétrer jusqu’au noyau des leucocytes. L’ADN des
cellules devient alors fluorescent avec une intensité proportionnelle à sa quantité. Les cellules quies-
centes ou en phase G1 (2 N d’ADN) émettent une fluorescence deux fois moindre que les cellules
en phase G2 (4 N). La quantité d’ADN peut être évaluée de façon plus précise en utilisant un étalon
interne (hématies de poussin haploïdes, ou lymphocytes sanguins humains diploïdes). Les cellules en
phase S émettent une fluorescence intermédiaire entre ces deux valeurs. Des logiciels spécifiques
établissent les gaussiennes des pics G1 et G2 et extrapolent la courbe de la phase S. Ils permettent
une quantification de chaque population. Un marquage préalable d’antigènes de différenciation
exprimés à la surface des sous-populations cellulaires permet d’isoler la population d’intérêt
(blastes) de façon précise.
Nature du prélèvement Sang périphérique ou aspiration médullaire.

CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- Les logiciels d’intégration des signaux de fluorescence permettent de déterminer précisément le
prétation et performances pourcentage de cellules à chaque phase du cycle cellulaire ou aneuploïdes.
Causes d’erreur, limites Il est important, lors de l’analyse, d’éliminer les doublets qui par définition donnent un signal 4N et
du test peuvent être confondus avec des cellules en phase G2.
Fiche 2.6
Lymphocytes T helper/suppresseurs
Code NABM 1122
Signification biologique du paramètre le présentent (cellules tumorales ou infectées

Les lymphocytes T représentent la population par un virus). Les nombres et proportions de
lymphocytaire sanguine majoritaire. Ces lympho- ces différentes populations sont très régulés et
cytes matures sont caractérisés par l’expression du leurs variations sont indicatives de divers types de
complexe moléculaire CD3 (chaînes gamma, delta, pathologies. La mesure des lymphocytes T helper/
epsilon (× 2), zeta-zeta ou zeta-eta : γε, εδ, ζζ/ζη). suppresseurs est le plus souvent associée à celle
Ils comportent deux sous-populations caractéri- des autres types lymphocytaires, lymphocytes B
sées par l’expression (normalement mutuellement (CD19+) et cellules Natural Killer (NK, CD16+
exclusive) des antigènes de différenciation CD4 et et/ou CD56+ et/ou CD57+). Tous ces éléments
CD8. Les lymphocytes T CD4+ sont aussi appelés cellulaires peuvent également être recherchés dans
lymphocytes helper ou auxiliaires. Leur rôle est de d’autres échantillons (voir infra).
reconnaître des antigènes exogènes présentés par
une molécule de classe II du complexe majeur Objectifs de l’analyse et principales
d’histocompatibilité (CMH, système HLA chez indications de prescription
l’homme). La reconnaissance d’un fragment L’immunophénotypage lymphocytaire vise à éva-
d’antigène (épitope), niché dans le sillon d’une luer les proportions des différentes sous-popula-
molécule CMH II, par le récepteur du lympho- tions, le plus souvent à la suite d’un hémogramme
cyte T (T-cell Receptor, TCR), n’entraîne l’acti- anormal, ou sur la base d’éléments cliniques. Les
vation du lymphocyte que si la molécule CD4 sous-populations lymphocytaires sont perturbées
se fixe à la molécule de CMH. L’activation des en cas de syndrome lymphoprolifératif, de défi-
lymphocytes CD4 est nécessaire à la mise en place cit immunitaire, d’infections, de maladies auto-
d’une réponse immunitaire spécifique, de par le immunes ou de lymphocytose réactionnelle.
rôle de ces cellules pour stimuler les autres acteurs
de cette réponse. Les lymphocytes T CD8+ sont
aussi appelés lymphocytes suppresseurs ou cyto-
toxiques. À l’instar des CD4, ils assurent que bilan d’exploration
l’épitope reconnu par le TCR est niché dans C’est un examen le plus souvent de seconde inten-
le sillon d’une molécule CMH I. L’antigène tion, parfois réalisé concomitamment à l’hémo-
est dans ce cas endogène et les réponses CD8 gramme. Il peut également être réalisé dans le
visent essentiellement à éliminer les cellules qui suivi des patients.
Nature du prélèvement Sang ou moelle sur EDTA. Liquides d’épanchement, liquide céphalo-rachidien (aussi appelé
fluide cérébro-spinal), liquides de lavage bronchoalvéolaire, tissus frais dissociés.
Recommandations pour la qualité L’utilisation d’un anticoagulant n’est pas nécessaire en dehors du sang et de la moelle, mais il
du prélèvement convient de vérifier la qualité hémorragique ou non du prélèvement.
Contraintes d’acheminement Examen à réaliser de préférence dans les 24 h.
Mode de conservation Température ambiante ou + 4 °C.
Principe méthodologique Cet examen est réalisé en cytométrie en flux multiparamétrique, généralement avec un seul
mélange d’anticorps monoclonaux (panel), conjugués à différents fluorochromes, dans un seul
tube. Il existe des variantes selon les laboratoires quant au panel utilisé et à la réalisation
d’une lyse des hématies avec ou sans lavage après l’incubation. Pour la réalisation d’une
numération concomitante des sous-populations, il convient de ne pas laver l’échantillon après
la lyse et d’utiliser un volume connu de billes calibrées permettant, par une série de règles de
trois, d’obtenir la valeur absolue de chaque sous-population (technique single platform). Sinon,
les proportions en pourcentages peuvent être rapportées à la valeur absolue des lymphocytes
obtenue sur un hémogramme.
Type de méthode Méthode manuelle pouvant être semi (préparation) ou totalement automatisée.
CIQ Maison.
Valeurs de référence/Interpréta- Les valeurs de référence publiées dans la littérature tiennent compte de l’âge et du genre.
tion et performances De manière schématique, les lymphocytes T totaux CD3+ représentent 70 à 80 % des lym-
phocytes, avec 6 à 15 % de lymphocytes B et 6 à 15 % de cellules NK. Les cellules CD3+/
CD4+ et CD3+/CD8+ sont dans des proportions 2/3-1/3, soit globalement 45 % et 25 % des
lymphocytes totaux. Il existe dans le sang périphérique normal de petites proportions de
lymphocytes T double positifs ou double négatifs pour CD4 et CD8. Ces petites populations
peuvent augmenter en cas d’infection ou de syndrome lymphoprolifératif T. L’index d’immuno-
régulation CD4/CD8 est typiquement inversé (abaissé) en cas d’infection virale et augmenté en
cas d’infection bactérienne ou de maladie auto-immune, attirant l’attention vers la recherche
d’autres signes cliniques ou perturbations biologiques.
Causes d’erreur, limites du test Échantillon coagulé, lyse défectueuse, oubli d’un anticorps, stratégie de gating inappropriée.
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Chapitre 3
Exploration des pathologies
érythrocytaires

Fiche 3.1
Recherche d’anomalies morphologiques des globules
rouges sur frottis (recherche de schizocytes, hématies
cibles, drépanocytes, elliptocytes, sphérocytes, etc.)
Code RIHN E011
Signification biologique du paramètre • hématies cibles : carences en fer, certaines

Tests cytologiques permettant la mise en évidence hémoglobinopathies ;
et l’évaluation d’anomalies morphologiques des • drépanocytes : syndromes drépanocytaires
hématies et/ou d’inclusions intra-érythrocytaires. majeurs ;
• elliptocytes : selon le nombre, elliptocytose
héréditaire, pyropoïkilocytose (HPP) ;
• sphérocytes : sphérocytose héréditaire (SH),
anémies hémolytiques auto-immunes de l’adulte
Objectifs : mise en évidence d’hématies de mor- ou incompatibilité ABO du nouveau-né/anémies
phologie anormale ou contenant des inclusions. allo-immunes, sphérocytes de reformation dans
Ces anomalies permettent souvent d’orienter le les hémoglobinopathies, HPP ;
diagnostic et de guider les explorations nécessaires • autres anomalies associées à la SH : cellules
en seconde intention, réduisant ainsi le temps et le en forme de champignon, acanthocytes, sphéro-
coût des investigations. acantocytes ;
Indications : test à réaliser dans un contexte • stomatocytes : stomatocytose héréditaire ;
d’anémie arégénérative ou régénérative, dans le • ponctuations basophiles : intoxication au
cadre d’une hémolyse chronique ou aiguë ou plomb, déficit en pyrimidine 5’ nucléotidase,
d’une hémolyse compensée sans anémie. thalassémies ;
L’analyse peut être globale ou orientée par la • « hémighosts » et « ghosts » dans un déficit en
clinique : G6PD en crise ;
• recherche de paludisme et parasitémie ; • acanthocytes dans un contexte d’hépatopathie.
• recherche et compte de schizocytes : hémolyses
mécaniques, syndrome hémolytique urémique Place dans la hiérarchie d’un
(SHU), purpura thrombotique thrombocyto bilan d’exploration
pénique (PTT), prothèse cardiaque, coagulation
intravasculaire disséminée (CIVD), gros Examen de première intention permettant
angiomes ; d’orienter le diagnostic étiologique d’une anémie
ou d’une hémolyse.
Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 43
Nature du prélèvement Sang total sur EDTA.

Recommandations pour la qualité Sang non hémolysé, non centrifugé, retournement du tube afin d’homogénéiser le sang.
du prélèvement Avant transfusion, pour une analyse de la morphologie des hématies du patient.
Contraintes d’acheminement Délai le plus court possible entre la réalisation du prélèvement, l’envoi au laboratoire
d’hématologie et l’étalement du frottis.
Mode de conservation Impossibilité de délai dans la réalisation du frottis pour l’analyse de la morphologie des
hématies. Une fois le frottis réalisé et coloré, conservation possible des lames lutées à
température ambiante.
Principe méthodologique Technique cytologique. Frottis sanguin coloré au MGG et examiné au microscope optique.
Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée de réalisation de frottis et de coloration MGG.
Type de test Mesure qualitative : description des anomalies morphologiques des hématies.
Méthode semi-quantitative : pourcentage de cellules affectées (schizocytes, hématies
infectées par du paludisme).
CIQ Non.
EEQ EEQ national sous forme de lames. Programme européen HEMAtimage.
Valeurs de référence/ Test très performant dans le bilan d’une anémie ou d’une hémolyse, compensée ou non,
Interprétation et performances pour le diagnostic étiologique, l’orientation diagnostique et la prescription des examens
complémentaires.
Test rapide, peu coûteux, réalisable sans automatisation poussée mais nécessitant une
expertise humaine.
Causes d’erreur, limites du test Tenant à la technique : délai de réalisation du frottis trop long par rapport au prélèvement,
responsable d’anomalies morphologiques artéfactuelles, problèmes de coloration (réactifs ou
problème d’étaleur/colorateur si frottis automatisé) responsables souvent de la perte du halo
central des hématies rendant tout examen cytologique des hématies impossible.
Tenant à l’échantillon : cellules d’intérêt fragiles et détruites (hémolyse).
Analyse morphologique des hématies du patient impossible après transfusion.
Limites : nécessite des examinateurs entraînés.
Fiche 3.2
Drépanocytes : recherche (test de falciformation)
Code NABM 1111

Le test de falciformation est un test cytologique indications de prescription
permettant la mise en évidence et l’évaluation Ce test est réalisé pour le diagnostic d’un syn-
du nombre d’hématies falciformes, contenant de drome drépanocytaire majeur en situation
grandes quantités d’hémoglobine S (HbS), dans d’urgence, lorsqu’une étude de l’hémoglobine
un échantillon sanguin. C’est un test dynamique, et un dosage d’HbS, qui sont des techniques
basé sur la propriété de polymérisation de l’HbS longues, sont impossibles à réaliser chez un sujet
en situation d’hypoxie, entraînant in vitro la non connu pour cette pathologie.
déformation des hématies en forme de faux ou
faucille (hématies falciformées ou falciformes). Place dans la hiérarchie d’un
Le terme « drépanocytes » est plutôt réservé bilan d’exploration
à la mise en évidence d’hématies falciformes à
Examen de première intention et d’urgence.
l’examen d’un frottis sanguin coloré au MGG.
Le test de falciformation est aussi appelé test
d’Emmel, du nom de son découvreur en 1917,
Victor E. Emmel.

Recommandations pour la qualité du prélèvement Sang non hémolysé, non centrifugé.
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement : 2 h.
Principe méthodologique Technique cytologique. Le sang total est mis en contact avec une solution de
métabilsufite de sodium (agent réducteur) à 2 % préparée extemporanément,
qui accélère la falciformation en induisant une hypoxie rapide. Incubation en
chambre humide et lecture entre lame et lamelle à l’objectif × 40.
Type de test Mesure qualitative et semi-quantitative.
CIQ Pas de CQI commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle
négatif (sujet non drépanocytaire) et si possible un contrôle positif (sujet
drépanocytaire majeur connu)
EEQ Contrôles interlaboratoires.
Valeurs de référence/Interprétation Le test permet d’identifier la présence d’hématies falciformes.
et performances
Causes d’erreur, limites du test Des faux négatifs peuvent être liés à une transfusion récente ou à des
taux élevés d’hémoglobine fœtale (HbF). Chez les sujets porteurs d’un
trait drépanocytaire (hétérozygotie AS de la globine), le test peut être très
faiblement positif ou négatif.
Attention : la présence de rouleaux d’hématies (hématies vues de profil) peut
faire croire à tort à la présence d’hématies falciformes.
D’autres variants de la globine peuvent entraîner une falciformation (HbC Harlem).
Le test ne permet pas d’apprécier le taux d’HbS. Cependant, en cas de falciforma-
tion importante, le diagnostic de syndrome drépanocytaire majeur est probable.
Fiche 3.3
Corps de Heinz (recherche)
Code NABM 1110
Signification biologique du paramètre tétramères de chaînes de β globine très instables

Les corps de Heinz sont des inclusions intra-éry- (surtout visibles en cas d’hémoglobinose H).
throcytaires liées à la précipitation d’hémoglobine
dénaturée/oxydée (hémichromes). Ils se recher- Place dans la hiérarchie d’un
chent par coloration supra-vitale d’un frottis san- bilan d’exploration
guin telle que les colorations au bleu de crésyl • Examen de seconde intention devant une
brillant ou au violet de méthyle. hémolyse chronique inexpliquée à test de Coombs
négatif, après élimination de causes plus fréquentes
Objectifs de l’analyse et principales (hémoglobinopathies, sphérocytose héréditaire,
indications de prescription déficit enzymatique en pyruvate kinase) dans le
Cette recherche est indiquée dès lors qu’une but de rechercher une hémoglobine instable.
dénaturation oxydative de l’hémoglobine est sus- • Examen pouvant être réalisé à but diagnostique
pectée : dans les hémolyses dues à une hémoglo- en phase aiguë devant une crise d’hémolyse intravas-
bine instable (anémie hémolytique de transmission culaire avec suspicion de déficit en G6PD (contexte
dominante), mais aussi crise hémolytique aiguë clinique, présence d’hémighost ou hématies « mor-
d’un déficit en G6PD. Enfin, elle montre des dues » sur le frottis sanguin coloré au MGG).
images caractéristiques en « balles de golf » dans • Les corps de Heinz sont décrits dans d’autres
les thalassémies α du fait de la formation de causes plus rares de stress oxydatif in vivo, notam-
ment la maladie de Wilson.

Recommandations pour la qualité du Sang non hémolysé, non centrifugé.
prélèvement
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 24 h et le plus rapide possible.
Mode de conservation Conservation à + 4 °C.
Principe méthodologique Il s’agit d’une technique cytologique.
Dilution de 1 mL sang dans 0,5 mL d’une solution de bleu de crésyl.
Incubation à + 37 °C pendant 20 min, 2 h, 4 h et 24 h.
Étalement sur lames à chaque temps d’incubation.
Lecture au microscope à immersion.
Les corps de Heinz typiques sont des inclusions intra-érythrocytaires dont l’aspect
dépend du degré d’instabilité de l’hémoglobine. Dans les alpha-thalassémies,
ils prennent l’aspect de ponctuations fines réparties sur toute la surface éry-
throcytaire, en « balles de golf », associées souvent à de plus grosses inclusions. Il
ne faut pas les confondre avec les réticulocytes dont les inclusions ont un aspect
réticulé. En cas d’hémoglobine instable, l’aspect typique des hémichromes est une
(ou plusieurs) inclusion(s) juxta-membranaire(s) de plus ou moins grande taille, en
« méduse ». À noter que leur nombre augmente après splénectomie.
Type de méthode Méthode manuelle. Une nouvelle méthode en cytométrie en flux a été publiée en
2017, mais reste à valider à ce jour.
Type de test Mesure qualitative.
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Interprétation et Test permettant avant tout une orientation diagnostique rapide d’hémoglobine
performances instable (hémolyse chronique) ou de déficit en G6PD (hémolyse intravasculaire
aiguë) avant examens de confirmation.
Causes d’erreur, limites du test Sensibilité faible.
Fiche 3.4
Test de Kleihauer
Code NABM2109
Signification biologique du paramètre partir du test est supérieure à 4 mL, des doses
Ce test cytologique permet la mise en évidence supplémentaires doivent être administrées à la
et l’évaluation du nombre d’hématies fœtales mère dans un délai de 72 h maximum ;
(contenant majoritairement de l’hémoglobine • évaluation de pertes fœtales (transfusion fœto-
fœtale, HbF) parmi les hématies présentes dans maternelle) durant la grossesse, quel que soit le
un échantillon sanguin. Il est basé sur les pro- rhésus de la mère. Lors de traumatismes ou de
priétés de résistance de l’HbF aux agents acides. Il gestes invasifs, de souffrance ou de mort fœtale
permet de calculer le volume de sang fœtal corres- durant la grossesse, un passage d’hématies fœtales
pondant à ce nombre d’hématies. peut survenir. Le test de Kleihauer permet de
Synonyme : élution acide. quantifier ce volume afin d’envisager la prise en
charge obstétricale adéquate.
Deux situations sont plus rares :
• identification de la distribution pan ou hétéro-
cellulaire de l’HbF en cas de suspicion de persis-
L’objectif dépend de l’indication. Les principales tance héréditaire d’HbF (PHHF), de thalassémie,
indications sont : etc. ;
• prévention de l’immunisation rhésus fœto- • transfusion ou greffe non compatible RhD afin
maternelle : l’objectif est de quantifier le pour- d’adapter la prise en charge.
centage d’hématies fœtales circulant dans le sang
maternel en post-partum ou pendant la gros- Place dans la hiérarchie d’un
sesse, afin d’adapter la dose d’immunoglobulines bilan d’exploration
(Ig) anti-D à injecter à la mère. Toute femme
RhD- ayant un bébé RhD+ doit obligatoirement Il s’agit d’un examen de première intention. La
recevoir une dose standard d’Ig anti-D. Celle-ci quantification par cytométrie en flux peut être
est de 1 000 UI (200 µg en France) et permet indiquée en cas de difficulté diagnostique ou
de neutraliser au maximum 4 mL de sang fœtal afin de quantifier plus précisément un passage
transfusé. Si la quantité de sang fœtal calculée à important d’hématies fœtales.

Recommandations pour la qualité du Sang non hémolysé, non centrifugé.
prélèvement
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 48 h et la plus rapide possible afin de respecter
le délai de 72 h pour une éventuelle réinjection d’Ig anti-D dans le cas de la
prévention de l’immunisation Rh materno-fœtale.
Principe méthodologique Technique cytologique. Frottis sanguin coloré. Élution acide des hémoglobines
non fœtales. L’HbF résiste à l’élution acide et peut être colorée par de l’éry-
throsine.

Type de test Mesure semi-quantitative.
CIQ Des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine. Des contrôles
internes positifs et négatifs peuvent être utilisés : sang adulte masculin sans
anomalie de l’hémogramme et sang fœtal.
EEQ Pas d’EEQ national. EEQ européen (UK NEQAs).
Valeurs de référence/Interprétation et Peu sensible mais doit permettre de repérer les cas rares de passage massif
performances d’hématies fœtales (< 1 % des femmes RHD- d’après la BSH) afin d’éviter
l’immunisation.
Causes d’erreur, limites du test Les principales causes d’erreur sont la présence d’hématies maternelles conte-
nant de l’HbF (thalassémie, PHHF) ou la présence d’hématies fœtales dégradées
provenant d’un passage fœto-maternel ancien, rendant la lecture difficile
au microscope, voire impossible. Un contrôle en cytométrie en flux est alors
souhaitable. Cette technique cytologique comporte une part de subjectivité. Il
est important de disposer de contrôles internes réguliers encadrant la technique.
Fiche 3.5
Résistance globulaire osmotique
Code NABM 1112
Signification biologique du paramètre courbe vers la droite). Le diagnostic de SH repose

La résistance globulaire osmotique teste in vitro désormais sur des tests plus sensibles et plus
la fragilité des globules rouges en les plaçant dans spécifiques comme le test à l’éosine maléimide ou
des solutions salines de concentrations progres- 5’ eosine maléimide (EMA) en cytométrie en flux,
sivement décroissantes. complété, si nécessaire, d’une ektacytométrie.
La résistance globulaire est diminuée (décalage Ce test n’est donc pas indiqué en première inten-
de la courbe vers la droite) dans les formes tion pour le diagnostic d’une SH. Il peut être
acquises de sphérocytose (anémie hémolytique utile pour une orientation diagnostique de SH
auto-immune notamment) et dans la sphéro- ou dans de rares formes d’associations complexes,
cytose héréditaire (SH, maladie de Minkowski SH plus thalassémie, par exemple.
Chauffard). Ce test peu sensible et peu spécifique est amené
La résistance globulaire est augmentée (décalage à disparaître avec le développement d’autres
de la courbe vers la gauche) dans les thalas- méthodes plus facilement standardisables.
sémies, la drépanocytose, l’hémoglobinose C. Le
test peut être sensibilisé par une incubation des Place dans la hiérarchie d’un
globules rouges à + 37 °C pendant 24 h. bilan d’exploration
Synonyme : test de sensibilité globulaire à l’hypo- Ce test n’est pas indiqué en première intention
tonie. pour le diagnostic de la SH en raison de sa
faible spécificité et sensibilité. Il est désormais
Objectifs de l’analyse et principales remplacé par des analyses plus sensibles. Il peut
indications de prescription être utilisé en examen de deuxième intention à
Ce test a été utilisé historiquement pour le diag- réserver à des patients présentant des pathologies
nostic de thalassémie (déviation de courbe vers la complexes ou très rares de la membrane éry-
gauche), puis pour celui de SH (déviation de la throcytaire.
Nature du prélèvement Sang total sur héparine (2 tubes pour la résistance après 24 h d’incubation).
Recommandations pour la Sang non hémolysé, non centrifugé.
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 3 h.
Principe méthodologique Il s’agit d’une technique biochimique. Le test est effectué sur un culot globulaire lavé. Une
gamme de solutions d’osmolarité décroissante est établie à partir d’une solution isotonique.
Le sang du patient (et en parallèle d’un témoin) est mis au contact et la densité optique est
mesurée après centrifugation afin d’évaluer le pourcentage d’hémolyse pour chaque tube de la
gamme. Une courbe d’hémolyse peut être tracée. Les valeurs du patient sont comparées aux
valeurs cibles établies sur une population contrôle ainsi qu’à celle du témoin.

Type de test Méthode qualitative : déviation à droite → résistance diminuée ou à gauche → résistance
augmentée.
CIQ Pas de CIQ commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle.
EEQ Contrôles interlaboratoires.
Valeurs de référence/Inter- La résistance globulaire est diminuée dans la maladie de Minkowski-Chauffard (SH), l’elliptocytose
prétation et performances héréditaire, les anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI).
La résistance est augmentée dans les syndromes thalassémiques, la drépanocytose, la xérocytose
héréditaire (stomatocytose déshydratée).
La sensibilité du test a été estimée à 68 % sur sang frais et 81 % sur sang incubé pour
le diagnostic de SH.
Causes d’erreur, limites du test Une transfusion récente, les déficits enzymatiques (G6PD, pyruvate kinase), les hémoglobines
instables et la présence de taux d’HbF élevés peuvent modifier la sensibilité aux solutions
hypotoniques. L’association de pathologies (par exemple SH plus thalassémie) peut normaliser
le test.
La sensibilité du test est faible pour la SH. Ce test ne doit pas être utilisé en première intention
pour cette indication, d’autres tests (pink test, test à l’EMA en cytométrie en flux) permettant un
diagnostic plus fiable.
Le test garde un intérêt pour mettre en évidence une augmentation de la résistance globulaire
dans certaines pathologies rares (xérocytose) ou des associations complexes.
Fiche 3.6
Mise en évidence d’anomalies du cytosquelette du
globule rouge en cytométrie en flux (test à l’EMA)
Code RIHN E149
Signification biologique du paramètre nouveau-né. Dans ces pathologies, la perte de sur-

La sphérocytose héréditaire (SH) est une patholo- face de la membrane du GR conduit à la formation de
gie constitutionnelle de la membrane du globule sphérocytes, avec des mécanismes différents. Dans
rouge (GR) faisant partie des anémies hémo la SH, le test EMA est positif si > 21 % alors qu’il
lytiques (AH) corpusculaires. Elle est due à des est négatif si < 16 %5 dans les AHAI. Ce seuil
mutations dans une des protéines de la mem- (cut-off) reste discuté selon les équipes.
brane du GR, impliquées dans les connexions
verticales au sein du complexe protéique ankyrine Place dans la hiérarchie d’un
du cytosquelette. La déstabilisation de la mem- bilan d’exploration
brane des GR entraîne une perte de surface, sous Le test EMA est un test de première intention
forme de gouttelettes lipidiques, responsable de dans le diagnostic étiologique d’une AH, devant
la formation de sphérocytes (GR sphériques sans des signes cliniques d’hémolyse chronique (ictère,
halo central, hyperdenses et de petite taille). Ceci splénomégalie), confirmée par l’hémogramme :
entraîne une réduction des sites de fixation du anémie de sévérité variable, microcytaire si taux
5’ eosine maléimide (EMA) qui se fixe sur une élevé de sphérocytes, normo ou hyperchrome
lysine de la protéine Band 3, majoritaire à la (CCMH > 36 g/dL car perte de surface à
membrane du GR. Dans la SH, la cytométrie en contenu érythrocytaire identique) régénérative
flux objective cette perte de fluorescence après (petits réticulocytes > 150.109/L). S’y associent
marquage à l’EMA des GR. des signes biochimiques d’hémolyse : bilirubine
libre ou indirecte élevée, haptoglobine effondrée
Objectifs de l’analyse et principales (interprétable après 1 an de vie) et LDH élevée.
indications de prescription Un test limite (16-21 % ou 11-21 % selon les
Le test EMA est prescrit dans le bilan d’une AH, publications) impose une ektacytométrie. Un test
pour le diagnostic de SH et le diagnostic dif- de Coombs érythrocytaire est systématiquement
férentiel SH/anémie hémolytique auto-immune associé au test EMA dans le bilan diagnostique
(AHAI)/incompatibilité ABO (incABO) du étiologique d’une AH pour le diagnostic différen-
tiel SH/AHAI/incABO.
Nature du prélèvement Sang veineux sur EDTA (minimum 500 microlitres). À réception, choisir 3 à 6 prélèvements
témoins appariés en âge, avec indices érythrocytaires normaux, conservés dans les mêmes
conditions que le prélèvement du patient.
Recommandations pour la Avant toute transfusion au diagnostic ou 3 mois après la dernière transfusion. Associer un frottis
qualité du prélèvement sanguin fait sur place.
Acheminement Envoi à + 4 °C, tube non en contact direct avec la glace ou la source de froid.
Mode de conservation Délai maximum de 7 jours entre le prélèvement et le test, à + 4 °C.
Principe méthodologique Cytométrie en flux après marquage des hématies à l’EMA.
Type de méthode Cytométrie en flux, interprétation par un spécialiste.
CIQ Non.
EEQ Non commercialisé.

Valeurs de référence/Inter- Pour le diagnostic de SH : sensibilité 97,4 % ; spécificité 93,4 %.
prétation et performances
Causes d’erreur, limites du Faux positifs : pyropoïkilocytose, ovalocytose mélanésienne (SAO), dysérythropoïèse congénitale de
test type II, cryohydrocytose.
Faux négatifs : transfusion récente, SH associée à une autre pathologie du GR.
Fiche 3.7
Recherche des pathologies constitutionnelles
de la membrane du globule rouge en ektacytométrie
Code RIHN E027
trans). Les stomatocytoses sont des PCME très
hétérogènes caractérisées par une fuite catio-
Signification biologique du paramètre nique. Il en résulte un contenu cationique anor-
mal et des altérations du volume et de la chromie
Les pathologies constitutionnelles de la mem-
érythrocytaire.
brane érythrocytaire (PCME) sont un groupe
Les PCME sont phénotypiquement très hétéro-
hétérogène de pathologies constitutionnelles qui
gènes, asymptomatiques à sévères, de révélation
se caractérisent par une anémie hémolytique
in utero parfois par un hydrops fetalis. Les formes
corpusculaire se manifestant cliniquement par
asymptomatiques doivent être également diag-
les signes classiques de l’anémie (pâleur, asthé-
nostiquées, notamment les stomatocytoses, en
nie, dyspnée d’effort, tachycardie avec souffle
raison de la surcharge en fer qui conditionne
systolique anorganique) associés aux signes de
le pronostic. La technique de référence pour le
l’hémolyse chronique (ictère, splénomégalie).
diagnostic de ces pathologies est l’ektacytométrie.
Ceci se traduit par une anémie régénérative
L’ektacytomètre est un viscosimètre qui mesure
(compte réticulocytaire > 150.109/L) avec un
la déformabilité des globules rouges dilués dans
volume des hématies et une chromie variables
une solution visqueuse de PVP, soumis à des
selon les PCME. Des mutations dans des gènes
forces de cisaillement définies et à un gradient
de protéines de la membrane érythrocytaire ou
osmolaire. La courbe ektacytométrique obtenue
dans des transporteurs membranaires sont res-
permet d’individualiser 3 points :
ponsables de ces pathologies. Les complexes
• le point Omin qui correspond à l’osmolarité
protéiques ankyrine et 4,1 R sont majeurs au
à laquelle 50 % des GR sont lysés dans le test de
sein de la membrane du globule rouge. Ils
résistance osmotique et représente le rapport sur-
permettent un ancrage des protéines au sein de la
face/volume ;
bicouche phospholipidique en lien avec le cytos-
• l’index de déformabilité maximale (DImax) ;
quelette de spectrine. Le complexe ankyrine est
• le point O’ ou hyper, osmolarité à la moitié de
impliqué dans les connexions protéiques verti-
la DImax qui reflète l’état d’hydratation des GR.
cales de la membrane érythrocytaire alors que le
La courbe ektacytométrique doit toujours s’inter-
complexe 4.1R est impliqué dans les connexions
préter avec les indices érythrocytaires, réticu-
protéiques horizontales. Une mutation dans une
locytaires, l’analyse des graphes des automates
des protéines du complexe ankyrine est res-
de NFS, l’examen microscopique d’un frottis
ponsable d’une sphérocytose héréditaire (SH).
sanguin, le test EMA, le bilan d’hémolyse et les
La perte de cohésion de la membrane et la
autres bilans d’une anémie hémolytique (élec-
formation de vésicules lipidiques entraînent une
trophorèse de l’hémoglobine, mesure des activi-
perte de surface et la formation de sphérocytes.
tés G6PD/PK, test de Coombs).
Une mutation dans le complexe 4.1R, est res-
Dans les cas difficiles de PCME sans diagnostic éta-
ponsable d’une elliptocytose héréditaire avec
bli par l’ektacytométrie, chez les patients polytrans-
une stabilité membranaire diminuée conduisant
fusés sans réalisation possible des tests fonctionnels
à une fragmentation devenant majeure dans la
ou dans les associations de pathologies érythrocy-
forme sévère de l’elliptocytose ou pyropoïkilo-
taires, un bilan moléculaire peut être associé (Next
cytose (association d’une mutation du gène de
Generation Sequencing [NGS] ciblé).
la spectrine au polymorphisme alpha Lely en
L’électrophorèse des protéines de la membrane et des stomatocytoses deshydratées (xérocytose)

érythrocytaire reste surtout utile dans le diagnos- ou hyperhydratées.
tic différentiel d’une SH avec une CDAII (Conge- L’ektacytométrie est la technique de référence
nital Dyserythropoietic Anemia type 2, faux positif pour ces diagnostics.
de la courbe ektacytométrique pour le diagnostic
de SH). Dans ce cas, on observe un pincement Place dans la hiérarchie d’un
de la protéine band 3. Elle est en revanche de bilan d’exploration
sensibilité plus faible que le NGS ciblé et difficile
Elle dépend de la disponibilité sur le site d’un
d’interprétation compte tenu du nombre impor-
ektacytomètre car cet examen spécialisé est réalisé
tant de réticulocytes qui surestiment la quantité
dans des laboratoires de référence. Elle est le plus
des protéines de la membrane et peut masquer le
souvent faite en deuxième intention après les
défaut protéique.
tests de routine, le test EMA et lorsque les autres
examens à visée diagnostique réalisés dans le cadre
d’une anémie hémolytique sont négatifs. Elle
indications de prescription est réalisée en bilan initial dans un site spécialisé
L’ektacytométrie est prescrite dans le cadre géné- avec l’ensemble du bilan diagnostique des PCME
ral du bilan d’une anémie hémolytique. Elle est incluant maintenant des tests moléculaires.
utilisée dans le diagnostic des PCME, en parti- Ces derniers sont réalisés en seconde intention
culier de la sphérocytose héréditaire, de l’ellipto- et selon les résultats des tests fonctionnels de
cytose héréditaire non sévère et sévère (HPP ou la NFS/réticulocytes/morphologie des GR/test
pyropoïkilocytose), de l’ovalocytose mélanésienne EMA et ektacytométrie.
Nature du prélèvement Sang veineux sur EDTA (minimum 500 microlitres). À réception, choisir un témoin apparié en âge,
avec indices érythrocytaires normaux, conservé dans les mêmes conditions que le prélèvement du
patient.
Recommandations pour la Avant toute transfusion au diagnostic ou 3 mois après la dernière transfusion. Associer un frottis
qualité du prélèvement sanguin fait sur place.
Acheminement Envoi rapide à + 4 °C, tube non en contact direct avec la glace ou la source de froid.
Mode de conservation Délai maximum de 48 h maximum entre le prélèvement et la réalisation de l’examen.
Principe méthodologique Mesure de la déformabilité des hématies en gradient osmolaire et soumises à des forces de
cisaillements définies.
Type de méthode Méthode automatisée, interprétation par un spécialiste.
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- Examen de référence.
Causes d’erreur, limites Faux positifs : CDAII, Anémie Hémolytique auto-immune, incompatibilité ABO, qui miment la courbe
du test ektacytométrique d’une sphérocytose héréditaire.
Faux négatifs : ektacytométrie réalisée après une transfusion récente, association d’une pathologie
de la membrane à une autre pathologie du globule rouge qui peut fausser l’aspect caractéristique de
la courbe pour une PCME donnée.
Fiche 3.8
Facteur de croissance : dosage de l’erythropoïétine
sérique ou plasmatique
Code NABM 0763
Signification biologique du paramètre Dans l’anémie associée à l’insuffisance rénale, le

L’érythropoïétine (EPO) est une cytokine qui taux d’EPO est plus bas qu’attendu en fonction
stimule la formation et la croissance des globules de l’hématocrite.
rouges (GR). Elle est principalement produite • La seconde indication est le diagnostic dif-
par le rein. Elle est sécrétée en cas de baisse de férentiel des polyglobulies. Un taux bas est un
la concentration du sang artériel en oxygène, de critère de diagnostic de polyglobulie de Vaquez.
diminution des GR ou par une augmentation Un taux élevé dans un contexte de polyglobulie
des besoins en oxygène, sa synthèse rénale étant permet d’affirmer l’existence d’une polyglobulie
directement et inversement régulée par la tension secondaire. Certaines tumeurs secrètent de l’EPO
intra-artérielle rénale en oxygène. L’EPO est le entraînant une polyglobulie secondaire et, dans ce
facteur primaire d’induction de l’érythropoïèse par cas, on peut utiliser le dosage d’EPO comme un
l’hypoxie, car la production de l’EPO par le rein marqueur tumoral, afin de suivre l’efficacité du
est régulée par l’apport en oxygène. traitement.
Le dosage de l’EPO sérique participe au diagnos-
tic étiologique d’anémie ou d’érythrocytose (voir Place dans la hiérarchie d’un
ci-dessous). bilan d’exploration
L’administration d’EPO recombinante est un Dans les anémies chroniques, le dosage d’EPO
traitement destiné à augmenter le nombre d’éry- est recommandé en cas d’insuffisance rénale afin
throcytes. Le dosage d’EPO est utilisé pour établir d’adapter la posologie à la sécrétion d’EPO.
un pronostic et prédire l’efficacité du traitement Ainsi, dans les syndromes myélodysplasiques, un
chez les individus anémiés. dosage d’EPO endogène supérieur à 500 mUI/
mL est un argument pour ne pas utiliser d’EPO
Objectifs de l’analyse et principales dans le traitement. A contrario, un taux inférieur
indications de prescription à 500 mUI/mL est un argument en faveur d’une
La concentration sérique en EPO peut être déter- bonne réponse au traitement par EPO.
minée dans différentes situations cliniques. Dans l’anémie de l’insuffisance rénale, le taux
• La première indication est d’évaluer les capaci- résiduel d’EPO permet d’orienter sur la nécessité
tés de production d’EPO chez les sujets atteints d’une substitution en EPO.
d’insuffisance rénale chronique ou de déterminer Le dosage de l’EPO est indispensable en première
si la production d’EPO est adaptée à la sévérité intention devant une suspicion de polyglobulie :
d’une anémie. L’aplasie médullaire, l’anémie un taux abaissé ou normal signe la très forte
hémolytique et l’anémie par carence martiale probabilité d’une maladie de Vaquez. A contrario,
entraînent une augmentation de l’EPO sérique un taux d’EPO augmenté est un argument fort
proportionnelle à la profondeur de l’anémie. pour un diagnostic de polyglobulie secondaire.
Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou EDTA : à vérifier auprès du laboratoire exécutant.
Recommandations pour la qualité du L’indication précise de l’horaire est utile. Il est recommandé de faire le recueil de
prélèvement l’échantillon entre 7 h 30 et 12 h en raison des variations diurnes. Il existe en effet une
variation circadienne du taux d’EPO avec des taux circulants plus bas entre 4 h et 12 h
par rapport à la période de 16 h à 24 h.
Contraintes d’acheminement Température ambiante si transport rapide, sinon, isolement du plasma ou du sérum
réfrigéré à + 4 °C ou congelé à – 20 °C (à vérifier auprès du laboratoire exécutant).
Mode de conservation Réfrigération pendant 2-3 jours, congélation au-delà. La stabilité à – 15 °C est de
12 mois. Éviter les congélations et décongélations répétées. Aliquoter les échantillons
avant de les congeler. Éviter les échantillons hémolysés ou lipidiques. Conditions
à vérifier auprès du laboratoire exécutant.
Principe méthodologique Immunodosage de type sandwich manuel ou automatisé sur automate dédié.
Type de méthode Méthode manuelle (ELISA) ou automatisée.
CIQ CIQ du fournisseur de réactifs, d’un fournisseur de contrôles, pool de sérums.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation et La sensibilité du dosage d’EPO pour le diagnostic de polyglobulie primitive (Vaquez)
performances est de l’ordre de 80 % (plus faible que la sensibilité de la mutation JAK2 V617F qui est
supérieure à 95 %). Un taux d’EPO élevé est retrouvé dans environ un cas sur deux de
polyglobulies secondaires.
Causes d’erreur, limites du test Les anticorps utilisés dans les dosages d’EPO reconnaissent les EPO de synthèse. Pour
mesurer le taux d’EPO endogène, il faut s’abstenir de faire cette mesure dans les deux
semaines suivant la dernière administration. De même, les transfusions ou les saignées
modifient les taux d’EPO.
Bibliographie du chapitre 3 FICHE 3.6 – Mise en évidence d’anomalies du

cytosquelette du globule rouge en cytométrie en
FICHE 3.1 – Recherche d’anomalies flux (test à l’EMA).
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Chapitre 4
Exploration des anomalies du
métabolisme du fer et hémolyse

Fiche 4.1
Ferritine
Code NABM 1213, non cumulable avec 1833
Signification biologique du paramètre fonction du contexte, du bilan inflammatoire et

La ferritine est considérée comme le meilleur de la valeur du CSTf. Dans les formes classiques
marqueur des réserves globales de fer dans l’orga- d’hémochromatoses génétiques HFE évoquées
nisme. Les études de corrélation ont montré un devant une hyperferritinémie avec élévation du
lien étroit entre ces deux paramètres, puisque CSTf ainsi que dans les surcharges post-trans-
1 µg/L de ferritine correspond à environ 9 mg fusionnelles, la valeur de la ferritine sérique reste
de réserve de fer dans l’organisme. La ferritine un bon reflet global de la surcharge tissulaire et
sérique est un reflet global de la ferritine tis- permet de guider le traitement déplétif.
sulaire qui correspond à la mise en réserve de fer
rapidement mobilisable en cas de besoin. Une Objectifs de l’analyse et principales
diminution de la ferritine sérique est le meilleur indications de prescription
moyen et le seul examen de première intention à La mesure de la ferritine est utilisée pour évaluer
prescrire dans le diagnostic de carence en fer dans les réserves en fer de l’organisme. Sa principale
la population générale selon la Haute autorité de indication est le diagnostic biologique d’une
santé (rapport HAS 2011). Si la baisse de la fer- carence martiale et la vérification de l’efficacité
ritine n’a pas d’autre signification que la carence du traitement après supplémentation. Elle est
martiale, avec anémie ou non, l’interprétation également prescrite dans le diagnostic des sur-
d’une hyperferritinémie est plus complexe. En charges en fer, qu’elles soient génétiques ou
effet, la ferritine est une protéine de la phase acquises, et dans la surveillance du traitement
aiguë de l’inflammation, et s’élève également dans déplétif.
les cytolyses hépatiques, l’alcoolisme chronique,
l’hémolyse, les surcharges métaboliques et au
cours de pathologies macrophagiques aiguës (syn-
drome d’activation macrophagique, SAM,) ou bilan d’exploration
métaboliques (maladie de Gaucher). Ainsi, en cas La ferritine est l’examen de première intention
d’inflammation ou de pathologies chroniques, dans le diagnostic de la carence martiale où son
une carence martiale peut être présente alors que dosage est suffisant dans la grande majorité des
la ferritine est normale ou haute. La mesure des cas, sauf s’il existe un syndrome inflammatoire
autres paramètres du bilan martial afin de disposer ou une autre cause intercurrente associée. C’est
du coefficient de saturation de la transferrine également un examen de première intention (en
(CSTf) prend alors toute sa place. combinaison avec le CSTf) dans le diagnostic
Dans le diagnostic d’une surcharge en fer, une d’une surcharge en fer et dans la surveillance du
hyperferritinémie doit toujours s’interpréter en traitement déplétif de ces pathologies.
Chapitre 4. Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse 61
Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou héparinate de lithium.

Recommandations pour la qualité du Acheminement rapide.
prélèvement
Mode de conservation Température ambiante ou + 4 °C. Sérum congelé à – 20 °C.
Principe méthodologique Il existe plusieurs trousses de dosage de la ferritine reposant sur une immuno-
détection par des anticorps spécifiques. La technique de révélation peut être
de la néphélémétrie, de la turbidimétrie ou une méthode optique dans un ELISA
sandwich ou de compétition. Les techniques isotopiques initialement développées
ne sont plus réalisées. Il est possible d’utiliser la spectrométrie de masse.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation et Les valeurs sont plus élevées chez l’homme que chez la femme mais varient
performances selon les trousses et les laboratoires. On peut considérer comme « normales » les
fourchettes 18 à 270 µg/L chez l’homme, et 18 à 160 µg/L chez la femme. Il faut
souligner néanmoins l’absence de consensus sur l’interprétation de ce dosage
chez la femme enceinte et chez l’enfant (rapport HAS 2011). La valeur seuil en
deçà de laquelle on définit une carence martiale absolue n’est pas consensuelle.
Selon les publications, le seuil est de 12 ou 15 µg/L en l’absence de facteur
intercurrent. Dans des situations pathologiques complexes comme en anes-
thésie-réanimation, en néphrologie ou en cancérologie, les seuils sont différents,
habituellement de 30 ou 100 µg/L chez l’adulte. De plus, les seuils utilisés pour
le diagnostic des carences martiales absolues ou fonctionnelles au cours des
pathologies inflammatoires chroniques sont également différents (cf. ci-dessous).
En ce qui concerne les surcharges martiales, la HAS a défini des valeurs seuil
de 200 et de 300 µg/L respectivement chez l’homme et la femme pour décider
d’une prise en charge par saignées thérapeutiques d’une hémochromatose
(Recommandations HAS 2005). Ces seuils de prise en charge clinique peuvent
également varier selon les pathologies, notamment dans les surcharges d’origine
transfusionnelle.
Causes d’erreur, limites du test L’interprétation du dosage doit tenir compte du fait que le taux de ferritine est
dépendant de nombreux facteurs et notamment de l’inflammation. Dans cette
situation, la valeur de la ferritine ne reflète pas la quantité de fer « fonctionnel »
disponible pour l’érythropoïèse. L’utilisation du Coefficient de Saturation de la
Transferrine (nécessitant de doser conjointement fer sérique et transferrine), qui
reflète la quantité de fer circulant et donc accessible à l’érythroblaste, est alors
utile dans ces situations, ou en cas de suspicion forte de carence alors que la
ferritine est normale (rapport HAS 2011). Ainsi, les valeurs seuils habituelles de
ferritine ne sont pas adaptées aux pathologies chroniques inflammatoires. Un
groupe de travail international propose dans l’insuffisance cardiaque chronique, les
pathologies inflammatoires digestives et l’insuffisance rénale chronique, les seuils
de 100 µg/L pour la ferritine et/ou de 20 % pour le CSTf pour définir une carence
martiale dans cette population de patients.
Fiche 4.2
Fer sérique et coefficient de saturation
de la transferrine
(Ces analyses ne peuvent et ne doivent pas être découplées.)
Code NABM 2002
Signification biologique du paramètre des surcharges secondaires, post-transfusionnelles

La mesure concomitante des taux de fer sérique et ou au cours des dysérythropoïèses, ainsi qu’au
de transferrine (transporteur plasmatique du fer) cours des hépatopathies cytolytiques (par baisse
permet de calculer le coefficient de saturation de de synthèse de la transferrine par le foie et libé-
la transferrine (CSTf). Le dosage du fer sérique ration du fer cytoplasmique). Une augmentation
du CSTf au-delà de 70 % traduit l’apparition dans
seul, sans celui de la transferrine et du CSTf, n’a
la circulation de fer libre non lié à la transferrine
donc aucun intérêt en pratique, comme cela est
le NTBI (Non-Transferrin Bound Iron), source à
souligné dans le rapport HAS 2011.
terme de lésions tissulaires oxydatives à l’origine
• Baisse du CSTf : elle traduit une diminution du
des défaillances d’organes observées au cours des
fer circulant disponible pour la synthèse de l’hémo-
hémochromatoses.
globine au cours de l’érythropoïèse. Elle reflète
donc soit une carence absolue (sa détermination
est alors utile lorsque la ferritine n’est pas diminuée
du fait d’un syndrome inflammatoire associé, par
exemple), soit une carence « fonctionnelle » où Le dosage du CSTf est utilisé pour :
le fer est présent dans l’organisme mais insuf- • l’identification des surcharges martiales : c’est le
fisamment disponible pour l’érythropoïèse. Ces test biologique le plus sensible dans le diagnostic
carences fonctionnelles reflètent une inadéqua- des hémochromatoses de type 1 ;
tion entre la quantité totale de fer présente dans • l’identification d’une carence martiale vraie ou
l’organisme et l’utilisation insuffisante de ce fer par fonctionnelle lorsque la ferritine est peu contribu-
l’érythropoïèse et peuvent se rencontrer dans deux tive, notamment dans en cas de pathologie inflam-
situations. La première correspond à la séques- matoire associée (en particulier dans l’exploration
tration du fer dans les macrophages, typiquement des ACD, Anemia of Chronic Disease, anémies
observée dans les anémies inflammatoires au cours inflammatoires en français).
desquelles la production d’hepcidine empêche la
Place dans la hiérarchie
sortie cellulaire et le recyclage du fer, en particulier
dans ces cellules phagocytaires. La seconde situa- d’un bilan d’exploration
tion correspond à une augmentation des besoins C’est un dosage de première intention dans le
en fer pour l’érythropoïèse que les réserves ne diagnostic d’une hyperferritinémie.
peuvent assurer. Il s’agit typiquement des patients Ce dosage peut être prescrit en seconde intention
insuffisants rénaux chroniques traités par érythro- dans le diagnostic d’une carence martiale, seule-
poïétine (EPO) chez lesquels la consommation de ment dans les cas où la ferritine est difficile à
fer pour l’érythropoïèse est accrue. interpréter (du fait d’une pathologie inflamma-
• Augmentation du CSTf : elle est observée toire associée ou d’une insuffisance rénale chro-
au cours de la majorité des hémochromatoses nique, par exemple) ou en cas de forte suspicion
génétiques (hors mutation de la ferroportine) et de carence martiale malgré une ferritine normale.

Recommandations pour la qualité Acheminement rapide.
du prélèvement
Principe méthodologique Le fer sérique est dosé par colorimétrie après dissociation de sa liaison avec la transferrine.
Cette dernière est dosée par des techniques immunologiques en turbidimétrie ou néphélémé-
trie à l’aide d’anticorps spécifiques. La capacité totale de fixation du fer par la transferrine
(CTF) est calculée par la formule « transferrine (g/L) × 25 » et le coefficient de saturation de
la transferrine par la formule « Fer sérique (µmol/L)/CTF (µmol/L) ».
Type de méthode Méthodes automatisées.
Type de test Mesures quantitatives.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation Les valeurs de référence peuvent être variables selon les trousses de dosage et les laboratoires.
et performances À titre indicatif, le taux de fer sérique se situe entre 10 et 40 µmol/L (facteur de conversion :
µmol/L = µg/L × 0,018) et les valeurs de référence de la transferrine entre 1,6 et 4 g/L.
Les valeurs normales du CSTf sont entre 20 et 40 %.
Causes d’erreur, limites du test Le fer sérique subit de grande variation nycthémérale intra-individuelle et doit être dosé à
jeun le matin, à distance de toute prise d’alcool. Le dosage du fer sérique ne doit jamais être
prescrit seul ou associé à la ferritine, mais toujours associé au dosage de la transferrine,
permettant ainsi le calcul du CSTf.
Fiche 4.3
Récepteur soluble de la transferrine
Code NABM 1822 non cumulable avec 1213
Signification biologique du paramètre Son élévation traduit une érythropoïèse accrue,

Le récepteur soluble de la transferrine (RSTf) est qu’elle soit régénérative ou inefficace, ainsi
libéré par clivage protéolytique de la forme mem- qu’une augmentation des besoins en fer pour
branaire et son dosage est un reflet de l’activité l’érythropoïèse : le dosage est donc élevé dans les
érythropoïétique globale dans la moelle osseuse. carences martiales vraies ou fonctionnelles.
La libération du RSTf est proportionnelle à son
expression à la surface des érythroblastes, qui est Objectifs de l’analyse et principales
elle-même dépendante de la production érythro- indications de prescription
blastique et des besoins en fer de l’érythropoïèse. Le dosage du RSTf est indiqué en dernière ligne
La carence martiale se traduit donc par une pour étayer un diagnostic de carence martiale
augmentation du RSTf. Le taux plasmatique de lorsque les autres paramètres d’évaluation du
récepteur soluble est indépendant de l’inflamma- statut martial peuvent être pris en défaut : inflam-
tion aiguë ou chronique, contrairement à celui de mation, maladie hépatique.
la ferritine. Le dosage du RSTf (voire des index
RsTf/log ferritine ou RsTf/ferritine, qui seraient Place dans la hiérarchie d’un
plus sensibles) a donc été proposé pour rechercher bilan d’exploration
une carence en fer quand les autres paramètres
classiques du bilan martial peuvent être pris en Cette prescription hautement spécialisée doit être
défaut, au cours des inflammations (ferritine nor- limitée à quelques cas complexes et doit être
male ou augmentée) ou des maladies hépatiques. placée dans l’algorithme d’exploration après tous
les autres marqueurs du statut martial.

Recommandations pour la qualité Acheminement rapide.
du prélèvement
Principe méthodologique Le récepteur de la transferrine, sous sa forme tronquée soluble, est dosé par des méthodes
immunologiques : turbidimétrie, néphélémétrie ou ELISA.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Interprétation Les valeurs de référence peuvent varier selon les trousses mais se situent entre 0,76 et
et performances 1,76 mg/L.
Causes d’erreur, limites du test La ferritine est un marqueur plus précoce que le RSTf pour reconnaître une carence martiale
dans la population générale.
Le dosage du RSTf n’a pas d’indication en pratique courante, comme le rappelle le rapport
de la HAS en 2011.
Ce test manque de spécificité, les valeurs étant augmentées dans les stimulations
érythroblastiques, les régénérations médullaires et dans les érythropoïèses inefficaces telles
que dans les thalassémies.
Fiche 4.4
Haptoglobine
Code NABM 1813
Signification biologique du paramètre Il existe une anhaptoglobinémie (phénotype HP0)

L’haptoglobine est une protéine produite par ou une hypohaptoglobinémie constitutives, ren-
le foie dont le rôle principal est la chélation de contrées fréquemment en Afrique, surtout dans les
l’hémoglobine libre libérée après hémolyse intra- zones d’endémie palustre, mais aussi parfois asso-
vasculaire. Les complexes haptoglobine-hémo- ciées à des mutations du promoteur. Ce phénotype
globine sont phagocytés par les macrophages, est rare en Europe. Des délétions homozygotes du
principalement au niveau de la rate. L’hapto- gène codant pour l’haptoglobine ont été décrites
globine est saturée dès que l’hémolyse libère entre dans les pays du Sud-Est asiatique, et peuvent être
500 et 1 500 mg d’hémoglobine. responsables de réactions transfusionnelles graves.
Le taux d’haptoglobine est augmenté au cours
des syndromes inflammatoires. Son élévation est Objectifs de l’analyse et principales
corrélée à celle de l’orosomucoïde. indications de prescription
Il y a deux causes principales de diminution du Rechercher, en association avec le dosage des
taux d’haptoglobine : LDH, de la bilirubine totale et libre, une hémo-
• elle est classiquement indosable dans les hémo- lyse dans un tableau d’anémie régénérative.
lyses intravasculaires, mais elle est aussi diminuée
dans les hémolyses à prédominance extravas- Place dans la hiérarchie
culaire, au cours desquelles survient souvent une d’un bilan d’exploration
lyse intravasculaire des globules rouges altérés ;
• on peut observer une baisse de la production Exploration d’une anémie régénérative, en seconde
d’haptoglobine dans les insuffisances hépatocellu- intention après la NFS, la numération de réticulo-
laires. cytes et l’analyse cytologique du frottis sanguin.

Recommandations pour la Acheminement rapide.
Principe méthodologique L’haptoglobine est dosée par des tests immunologiques, immunonéphélémétrie ou immunoturbidi-
métrie, à l’aide d’anticorps spécifiques.
Valeurs de référence/Inter- Valeur de référence chez l’adulte : 0,25 à 2 g/L.
prétation et performances Le dosage de l’haptoglobine est un test de très grande sensibilité diagnostique en l’absence de
syndrome inflammatoire.
Causes d’erreur, limites Le dosage de l’haptoglobine n’est pas interprétable chez le nouveau-né, du fait de l’immaturité
du test hépatique. Le taux d’haptoglobine se stabilise entre 6 et 10 mois.
L’interprétation est difficile en cas d’hémolyse concomitante à un syndrome inflammatoire, le taux
d’haptoglobine pouvant alors être normal. Son élévation étant corrélée à celles d’autres protéines
de l’inflammation, il faut disposer des dosages de CRP et surtout d’orosomucoïde pour interpréter
le taux d’haptoglobine dans ces situations.
Fiche 4.5
Hémochromatose - Mutation p.Cys282Tyr (C2822Y)
du gène HFE
Code NABM 8000

L’hémochromatose est une maladie génétique indications de prescription
caractérisée par une absorption accrue de fer La recherche de la mutation C282Y doit être faite
au niveau des entérocytes, entraînant une accu- en première intention devant une suspicion d’hémo-
mulation de ce métal dans les organes. Les chromatose (recommandation HAS 2005). Cet exa-
signes cliniques sont tardifs, la maladie restant men est l’un des quelques tests génétiques inscrits à
asymptomatique dans la majorité des cas. Les la nomenclature des actes de biologie médicale.
atteintes liées à l’accumulation du fer concernent Cette recherche est prise en charge par l’assurance
les articulations, le cœur, le foie et le pancréas maladie dans les seules indications suivantes :
(diabète). « - cadre individuel : à la suite d’un bilan général,
La surcharge en fer expose à un risque accru au cours duquel une augmentation du coefficient
de cancer hépatique. Le génotype responsable de saturation de la transferrine est observée (CS-
de la majorité des cas est l’homozygotie pour Tf supérieur à 45 %, confirmé sur un deuxième
la mutation p. Cys2822Tyr (C282Y) du gène prélèvement) ;
HFE, localisé sur le chromosome 6. Seul un - cadre familial : chez les sujets ayant un parent
petit nombre de sujets porteurs de ce géno- au premier degré porteur de la mutation C282Y
type devient symptomatique. L’association à l’état homozygote, à l’exclusion des sujets
de la mutation C282Y au variant p.His63Asp mineurs et des mères ménopausées, ou ne désirant
(H63D) est responsable de formes moins plus avoir d’enfant ».
sévères.
Chez les patients porteurs d’une surcharge Place dans la hiérarchie d’un
martiale avérée, plusieurs autres gènes peuvent bilan d’exploration
être le siège de mutations conduisant à une
La recherche de la mutation C282Y est évoquée
hémochromatose. L’hémochromatose juvénile,
le plus souvent après la découverte d’une hyper-
rare, est due à des mutations du gène HJV
ferritinémie sur un bilan réalisé de manière sys-
codant pour l’hémojuveline, ou, plus rarement
tématique ou en présence de signes cliniques
du gène HAMP codant pour l’hepcidine. Les
évocateurs d’une surcharge martiale. Avant de
mutations des gènes du récepteur 2 de la trans-
prescrire la recherche du test génétique HFE, il
ferrine (TFR2), de BMP6 ou de la ferroportine
est indispensable d’éliminer les principales causes
(SLC40A1), sont impliquées dans des formes
acquises d’hyperferritinémie (syndrome inflamma-
génétiques d’hémochromatose. Ces dernières
toire, alcoolisme, cancer, syndrome dysmétabo-
analyses ne sont réalisées en France que dans
lique, etc.) et de réaliser un dosage du coefficient
quelques laboratoires spécialisés. Un arbre diag-
de saturation dela transferrine, à jeun, contrôlé au
nostique, validé par l’association nationale des
moins une fois. La recherche s’effectue également
praticiens de génétique moléculaire (ANPGM),
dans le cadre du dépistage familial chez les appa-
précise la démarche en cas de suspicion de l’une
rentés de premier degré d’un sujet homozygote.
de ces formes rares.

Recommandations pour Acheminement : le tube ne doit pas être ouvert.
la qualité du prélève- Toute prescription de test génétique doit être accompagnée d’une attestation de consultation du
ment prescripteur et d’un consentement écrit du patient, selon la règlementation en vigueur.
Contraintes d’achemi- Température ambiante.
nement
Principe méthodologique Le diagnostic repose sur la détection de la mutation C282Y du gène HFE. Plusieurs techniques sont
disponibles : techniques « maison » basées sur le principe de PCR-digestion (RFLP : Restriction Fragments
Length Polymorphism), kits commerciaux sous la forme de bandelettes ou de PCR quantitative…
Type de méthode Méthodes semi-automatisées.
CIQ Toute analyse doit être accompagnée de contrôles internes positifs et négatifs.
EEQ Tout laboratoire réalisant le test doit être inscrit à un contrôle de qualité externe. En l’absence de
contrôle national, il s’agit le plus souvent de contrôles européens ou anglais.
Valeurs de référence/ Le test est rendu habituellement de la manière suivante : mutation C282Y :
Interprétation et 1/ absente ;
performances 2/ présente à l’état homozygote ou hétérozygote. Le résultat doit être accompagné d’un commentaire.
Seule la présence de la mutation à l’état homozygote est associée à un terrain génétique d’hémochromatose.
Ainsi seul un petit nombre de sujets porteurs du génotype développe des signes cliniques, la plupart reste
asymptomatique. Toutefois, la découverte de ce génotype doit conduire à une évaluation d’une surcharge
en fer et à une prise en charge par saignées si nécessaire (recommandation HAS 2005).
Les sujets simples hétérozygotes C282Y ne développent pas la maladie, sauf s’il existe un autre facteur
acquis ou génétique associé. En cas d’hétérozygotie C282Y associée à une surcharge martiale, il est
possible de rechercher le variant H63D. Cette recherche n’est pas prise en charge par la sécurité sociale
et peut donc rester à la charge du patient. L’hétérozygotie composite C282Y et H63D est associée à des
surcharges martiales modérées, le plus souvent biologiques, sauf en présence de cofacteurs.
Aucun des autres génotypes (hétérozygotie ou homozygotie H63D) n’est responsable de surcharge en fer.
Si une surcharge martiale est présente chez le patient et confirmée notamment par une élévation de la
concentration hépatique en fer (CHF) à l’IRM, la recherche d’autres causes génétiques doit être envisagée
après avoir éliminé notamment toutes les causes acquises.
Causes d’erreur, limites Les principales causes d’erreur sont liées à des problèmes pré-analytiques (erreur d’identité), ou à une
du test inversion de tube lors de l’analyse (évènement très rare). Le test est habituellement robuste dans les
laboratoires spécialisés en génétique,
En l’absence de la mutation C282Y à l’état homozygote, le diagnostic d’hémochromatose HFE peut être
écarté. La démarche diagnostique doit comporter une l’élimination des causes acquises d’hyperferritinémie
et de surcharge en fer avant d’envisager la recherche de causes génétiques rares.
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Chapitre 5
Exploration des anomalies
de l’hémoglobine

Fiche 5.1
Électrophorèse de l’hémoglobine (gel polyacrylamide)
Code NABM 1113
Signification biologique du paramètre L’intitulé de cette analyse est donc amené à évoluer.
L’électrophorèse de l’hémoglobine (Hb) sur gel
de polyacrylamide est un test de dépistage d’une Objectifs de l’analyse et principales
anomalie le plus souvent constitutionnelle des indications de prescription
fractions protéiques de l’Hb (globine). Cette analyse doit permettre la mise en évidence
L’analyse doit être capable de séparer, d’identifier d’anomalies :
et de quantifier les fractions normales (HbA, • quantitatives : évaluations du pourcentage des
HbA2 et HbF) et les variants fréquents (HbS, fractions mineures (HbA2 et HbF) et d’éven-
HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb. tuelles fractions anormales ;
La technique d’électrophorèse devrait être main- • qualitative : présence de fractions anormales
tenant remplacée par une autre méthode de d’Hb (variants).
screening de première intention comme la chro- Indications : diagnostic d’une thalassémie (beta,
matographie liquide haute performance (High alpha), dépistage de variants de l’Hb.
Performance Liquid Chromatograpy, HPLC) ou
l’électrophorèse capillaire, plus sensibles et plus Place dans la hiérarchie
spécifiques. d’un bilan d’exploration
Certains laboratoires utilisent une ou deux
méthodes de screening, certains variants pouvant Test de dépistage à réaliser en première
ne pas être décelés par l’une ou l’autre méthode. intention dans le bilan diagnostique d’une
hémoglobinopathie.

Recommandations pour la qualité Sang non hémolysé, non centrifugé.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 24 h, à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de
fractions fragiles, Hb instables, etc.).
Principe méthodologique Plusieurs techniques permettent de séparer les fractions d’Hb selon leur charge électrique et
leur migration : HPLC, électrophorèse capillaire (automatisables), électrophorèse en gel (de
moins en moins utilisée).
Type de méthode Méthodes automatisées (HPLC et EPC : automates dédiés disponibles sur le marché).
Type de test Méthode quantitative : évaluation du pourcentage des fractions présentes, normales et anormales.
Méthode qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être
impérativement confirmée par une ou deux autres techniques, y compris pour l’HbS.
CIQ Pour chaque méthode, des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine.
EEQ Un EEQ national (Probioqual) et existence d’autres EEQ européens.
Valeurs de référence/ Test peu performant isolément, qui doit être associé à une (pour le dépistage) ou plusieurs
Interprétation et performances autres techniques (pour l’identification d’un variant de l’Hb).
Causes d’erreur, limites du test Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent
interférer avec leur quantification, fausser leur dosage ou ne pas être détectés. C’est la raison
pour laquelle l’utilisation d’au moins deux méthodes de screening est souvent recommandée.
Si un variant est dépisté, l’utilisation d’au moins 3 techniques est recommandée pour son
identification.
Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine 71
Fiche 5.2
Électrophorèse de l’hémoglobine (citrate agar)
Code NABM 1114

L’électrophorèse de l’hémoglobine (Hb) en indications de prescription
citrate agar est un test de caractérisation d’une Cette analyse doit permettre la mise en évidence
anomalie, le plus souvent constitutionnelle, des d’Hb migrant différemment de l’HbA à pH acide,
fractions protéiques de l’Hb (globine). notamment, HbS, HbC, Oarab. L’HbE co-migre
L’analyse permet d’identifier les fractions nor- avec l’HbA à pH acide, mais co-migre avec ou
males (HbA, et HbF) et certains variants fréquents migre à proximité de l’HbA2 en chromatographie
(HbS, HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb dont la liquide haute performance (HPLC) et électro-
migration est caractéristique. Analyse complé- phorèse capillaire respectivement.
mentaire de l’étude de l’Hb (électrophorèse de Indications : technique contributive au diagnostic
l’Hb) : ce test n’est habituellement pas réalisé de d’un variant de l’hémoglobine.
manière isolée mais il est associé à d’autres tests.
L’analyse correspond alors au code NABM 1120 Place dans la hiérarchie d’un
(3 méthodes au minimum). bilan d’exploration
Les variants de l’hémoglobine ont une migration
différente selon leur charge électrique et peuvent Test à réaliser en seconde intention dans le bilan
être séparés différemment et identifiés lorsqu’ils diagnostique d’une hémoglobinopathie en asso-
migrent à différents pH (alcalin pour le dépistage, ciation à d’autres techniques d’identification. Un
acide pour la caractérisation). panel de méthodes ainsi que les données de l’hémo-
Synonyme : électrophorèse à pH acide. gramme et la numération des réticulocytes sont
souvent nécessaires à la caractérisation ou à l’orien-
tation diagnostique d’un variant de l’hémoglobine.

Recommandations pour Sang non hémolysé, non centrifugé.
la qualité du prélèvement
Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 24 h à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de
fractions fragiles (Hb instables, etc.).
Principe méthodologique Électrophorèse d’un hémolysat de globules rouges dans un gel d’électrophorèse avec un
tampon acide.
Type de Méthode Méthodes manuelles ou semi-automatisées (automates).
Type de test Mesure qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être
impérativement confirmée par l’utilisation de plusieurs techniques, y compris pour l’HbS.
CIQ Pour chaque méthode des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine.
EEQ Un EEQ national (Probioqual) et d’autres EEQ européens sont disponibles pour l’identification de
l’HbS. Pour les autres variants, contrôles interlaboratoires.
Valeurs de référence/Inter- Test peu performant isolément, qui doit être associé à plusieurs autres techniques pour
prétation et performances l’identification d’un variant de l’Hb.
Causes d’erreur, limites du test Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent
interférer avec leur identification ou ne sont pas détectés par la méthode. C’est la raison pour
laquelle l’utilisation de plusieurs méthodes est recommandée.
Fiche 5.3
Test de solubilité de l’hémoglobine (Itano, falciformation)
Code NABM 1115

Le test d’Itano est un test biochimique permet- indications de prescription
tant la mise en évidence d’HbS présente dans un Ce test permet le diagnostic d’un syndrome
échantillon sanguin. C’est un test de solubilité de drépanocytaire majeur en situation d’urgence,
l’hémoglobine (Hb), il repose sur la précipitation lorsqu’une étude de l’hémoglobine et un dosage
de l’HbS désoxygénée. d’HbS sont impossibles (techniques longues). Le
Le test de falciformation (fiche 3.3) peut être test peut être également utilisé comme troisième
une alternative au test d’Itano. Les deux analyses technique dans le cadre de l’identification ou de
sont rassemblées sous le même code NABM. l’élimination de la présence d’HbS.
Les résultats doivent toujours être confrontés à
l’hémogramme et à un frottis de sang frais coloré Place dans la hiérarchie d’un
au MGG. bilan d’exploration
Examen de première intention en urgence per-
mettant de confirmer la présence d’HbS.

Recommandations pour la qualité Sang non hémolysé, non centrifugé.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Le prélèvement doit être acheminé rapidement ou, à défaut, peut être conservé à + 4 °C
pendant une semaine au maximum.
Principe méthodologique Technique biochimique. L’HbS précipite en milieu réducteur (dithionite de sodium) à
forte concentration saline. La turbidité de la solution est proportionnelle à la quantité
d’HbS présente dans l’échantillon.
CIQ Pas de CIQ commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle normal (sujet
non drépanocytaire) et si possible un contrôle positif (sujet drépanocytaire majeur connu).
EEQ Contrôle interlaboratoires.
Valeurs de référence/Interprétation Le test permet d’identifier la présence d’HbS, mais de rares autres variants de l’Hb
et performances précipitent également.
De fausses réactions négatives sont observées avec des hémolysats trop dilués, ayant
une concentration d’HbS égale ou inférieure à 20 % ou en présence d’un pourcentage
important de méthémoglobine.
Le test ne permet pas d’apprécier le taux d’HbS et ne différencie pas les sujets
hétérozygotes des homozygotes.
Causes d’erreur, limites du test Le test peut être faussement négatif en cas de transfusion récente, chez les nouveau-
nés et les bébés de moins de 6 mois qui peuvent avoir des taux d’HbS très faibles, chez
les sujets ayant des taux d’HbF élevés ou chez les sujets très anémiques (Hb < 7 g/dL).
D’autres variants, qui entraînent une falciformation, peuvent également donner un
test d’Itano positif (HbC Harlem, HbS Travis, HbC Ziguinchor). Il est donc rappelé que
l’identification précise d’un variant de l’Hb nécessite la mise en œuvre d’au moins trois
techniques de principe différent.
Fiche 5.4
Test à l’isopropanol (Hb instable)
Code NABM 1115
Signification biologique du paramètre aiguë. Il doit être prescrit en association avec une
Il existe de nombreux variants des protéines de étude complète de l’hémoglobine (recherche de
la globine de l’hémoglobine (Hb) dont certains variant, code NABM 1120) et éventuellement une
présentent une instabilité in vivo et in vitro. Cette recherche de corps de Heinz (précipitation intra-
instabilité a pour conséquence une hémolyse érythrocytaire de l’hémoglobine instable) qui est
chronique et des crises hémolytiques aiguës. habituellement positive dans cette situation.
Le test à l’isopropanol est un test biochimique qui
a pour objet de mettre en évidence une hémo- Place dans la hiérarchie d’un
globine instable dans un échantillon sanguin. bilan d’exploration
Synonymes : test de stabilité de l’hémoglobine, Examen de seconde intention permettant de
recherche d’hémoglobine instable. confirmer la présence d’un variant instable de
l’hémoglobine.
Objectifs de l’analyse et principales Il peut aussi être utilisé en situation d’urgence
indications de prescription lorsqu’un tel variant est suspecté. C’est toutefois
Ce test recherche une hémoglobine instable dans un test peu disponible qui n’est réalisé que dans
le bilan étiologique d’une hémolyse chronique ou des laboratoires spécialisés.
Nature du prélèvement Sang total sur EDTA, citrate ou héparine.

Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 2 h.
Principe méthodologique Technique biochimique. En présence d’une solution contenant de l’isopropanol, les hémo-
globines normales (et les variants stables) restent solubles jusqu’au temps 50 min, alors que
les hémoglobines instables précipitent. Si l’hémoglobine à tester est instable, la solution devient
trouble dès la 5e minute, et le précipité flocule à la 20e minute.
Type de test Mesure qualitative. Toutefois, la rapidité avec laquelle le précipité se forme permet d’apprécier
le degré d’instabilité du variant.
CIQ Pas de CIQ commercial, il est indispensable de tester en parallèle un témoin normal.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- Le test permet de mettre en évidence la présence de variants instables, mais certains variants
prétation et performances de l’Hb faiblement instables peuvent ne pas être mis en évidence.
Causes d’erreur, limites du test Une transfusion récente peut entraîner un faux négatif. Certaines hémoglobines très instables
peuvent avoir précipité juste après le prélèvement ou durant le transport et ne pourront pas être
mises en évidence.
L’HbS et l’HbF ainsi que l’HbC commencent à précipiter à partir de 30 min.
La concentration d’hémoglobine doit être rigoureusement déterminée.
La méthémoglobine en quantité appréciable peut donner des réactions faussement positives
ainsi que les stromas érythrocytaires.
Fiche 5.5
Recherche d’une anomalie de l’hémoglobine
(3 techniques au minimum)
Code NABM 1120
Signification biologique du paramètre • qualitatives : présence et caractérisation de frac-

Ensemble de tests destinés à dépister et caracté- tions anormales d’Hb (variants).
riser une fraction anormale des protéines de la Indications : diagnostic d’une thalassémie
globine de l’hémoglobine (Hb). bêta (variants à effet thalassémiants) ou alpha
L’analyse doit être capable de séparer, d’identifier (présence d’Hb Barts ou d’HbH), dépistage et
et de quantifier les fractions normales (HbA, caractérisation de fractions anormales (variants de
HbA2 et HbF) et les variants fréquents (HbS, l’hémoglobine).
HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb.
Objectifs de l’analyse et principales bilan d’exploration
indications de prescription Test à réaliser en seconde intention après iso-
Cette analyse doit permettre la mise en évidence lement d’une fraction anormale par un test de
d’anomalies : dépistage (électrophorèse de l’Hb) ou en pre-
• quantitatives : évaluation du pourcentage des mière intention si une hémoglobinopathie est
fractions mineures : HbA2 et HbF et d’éven- suspectée cliniquement ou dans le cadre d’une
tuelles fractions anormales ; enquête familiale.
Nature du prélèvement Sang total sur EDTA ou ACD (acide citrique-dextrose).

Contraintes d’acheminement Durée d’acheminement < 24 h, à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de
fractions fragiles (Hb instables, etc.).
Principe méthodologique Plusieurs techniques disponibles permettent de séparer les fractions d’Hb selon leur charge
électrique et leur migration : chromatographie liquide haute pression (HPLC), électrophorèse
capillaire, électrophorèse à pH acide, isofocalisation électrique, séparation des chaînes de
globine, test d’Itano (HbS).
Au moins 3 méthodes, dont une d’électrophorèse, doivent être utilisées.
Type de méthode Certaines méthodes automatisées (HPLC et EPC : automates dédiés disponibles sur le marché)
et semi-automatisées ou manuelles (isofocalisation électrique, électrophorèse à pH acide, etc.)
sont utilisables.
Type de test Mesure quantitative : évaluation du pourcentage des fractions présentes, normales et
anormales.
Mesure qualitative : permet de préciser la nature des variants fréquents et peut orienter sur la
nature des variants plus rares (variant de type alpha ou bêta, instabilité).
CIQ Pour chaque méthode des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine.
EEQ Un EEQ national (Probioqual) et d’autres EEQ européens sont disponibles.


Nature du prélèvement Sang total sur EDTA ou ACD (acide citrique-dextrose).
Valeurs de référence/Inter- Les anomalies des chaînes de globine sont associées à des pathologies spécifiques. La
prétation et performances recommandation d’utiliser trois tests différents témoigne des sensibilités variables de ces
techniques.
Causes d’erreur, limites du test Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent inter-
férer avec leur quantification, induire une confusion avec un autre variant, fausser leur dosage
ou ne pas être détectés. C’est la raison pour laquelle l’utilisation d’au moins deux méthodes de
screening est recommandée.
Si un variant est dépisté, l’utilisation d’autres techniques est nécessaire pour son identification.
Fiche 5.6
Exploration de l’affinité de l’hémoglobine (oxymétrie :
mesure de la p50)
Code RIHN E156
Signification biologique du paramètre 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) qui, dans ce

La mesure de l’affinité de l’hémoglobine pour cas, résulte d’une anomalie de la DPG mutase.
l’oxygène peut s’effectuer soit par le tracé complet Il est fortement recommandé de prescrire conco-
de la courbe de Barcroft, soit par obtention de mitamment une étude de l’hémoglobine par au
la p50 calculée par un automate de gaz du sang moins trois techniques (code NABM 1120) afin
sur un prélèvement veineux. La p50 correspond de rechercher un éventuel variant hyperaffin de
à la pression partielle en oxygène (exprimée en l’hémoglobine. Cette analyse phénotypique doit
KPa ou en mmHg) pour laquelle la molécule être complétée par une étude des gènes de glo-
d’hémoglobine est saturée à 50 % en oxygène bine (alpha et/ou bêta) et de la DPG mutase si
(2 molécules d’oxygène fixées sur les 4 possibles). l’identification d’un variant par l’étude de l’hémo-
Une courbe de Barcroft décalée à gauche ou globine n’est pas concluante ou est négative. Ceci
une p50 basse sont le reflet d’une hyperaffi- permet également de ne pas omettre l’identifi-
nité du sang pour l’oxygène et de son mauvais cation d’un variant hyperaffin non séparé par les
relargage tissulaire, entraînant une polyglobulie techniques phénotypiques (dans environ 10 % des
réactionnelle. À l’inverse, une courbe de Barcroft cas). Une p50 diminuée avec un bilan de l’hémo-
décalée à droite ou une p50 élevée témoignent globine normal oriente alors fortement vers un
d’une hypo-affinité du sang pour l’oxygène, ce déficit en 2,3-DPG.
qui favorise son relargage tissulaire mais peut
en revanche gêner l’oxygénation correcte des Place dans la hiérarchie d’un bilan
molécules d’hémoglobine au niveau pulmonaire. d’exploration
Examen de seconde intention dans l’explora-
Objectifs de l’analyse et principales tion d’une polyglobulie, après élimination d’une
indications de prescription fausse polyglobulie (hémoconcentration), d’une
Cette analyse est le plus souvent prescrite dans polyglobulie secondaire à une hypoxie tissulaire
un bilan de polyglobulie vraie caractérisée par (tabac, BPCO, shunts, apnées du sommeil, intoxi-
une augmentation de la masse sanguine. Dans cation chronique au CO ou à des produits méthé-
ce contexte, une hyperaffinité du sang pour moglobinisants), liée à une sécrétion inappropriée
l’oxygène témoigne de la présence d’un variant d’EPO, ou primitive (maladie de Vaquez et autres
de l’hémoglobine hyperaffin ou d’un déficit en néoplasies myéloprolifératives).
Nature du prélèvement Sang total sur EDTA pour Hemox-Analyzer, seringue gaz du sang veineux pour la p50.
Recommandations pour la qualité Prélèvement non hémolysé. Conditions d’oxygénation normales pour le sujet.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Analyse à faire dans les 4 h suivant le prélèvement.
Mode de conservation Température ambiante ou + 4 °C (recommandé).
Principe méthodologique Tracé complet de la courbe de Barcroft sur automate Hemox-Analyzer (réservé aux
laboratoires spécialisés ou de recherche) OU obtention de la p50 calculée.
Type de méthode Méthode automatisée de gazométrie sanguine pour obtention de la p50 calculée à partir de
la pO2, de la SaO2 et de la concentration totale en oxygène.


Nature du prélèvement Sang total sur EDTA pour Hemox-Analyzer, seringue gaz du sang veineux pour la p50.
Type de test Mesure quantitative puisque l’interprétation est faite sur la valeur de la p50.
CIQ CIQ des automates de gazométrie sanguine.
EEQ EEQ des automates de gazométrie sanguine.
Valeurs de référence/Interprétation VPP de 100 % mais VPN non évaluable.
et performances
Causes d’erreur, limites du test Un variant alpha de l’hémoglobine à l’état hétérozygote peut ne modifier que très faiblement
la p50. L’estimation de la p50 peut être faussée sur gaz du sang artériel.
Fiche 5.7
Recherche des anomalies de l’hémoglobine sur carton
de Guthrie dans le cadre du dépistage néonatal
Code RIHN E143

Ce test est réalisé pour le dépistage néonatal de la indications de prescription
drépanocytose. Cette analyse doit permettre la mise en évidence
L’analyse doit être capable d’identifier les frac- d’anomalies :
tions d’hémoglobine (Hb) F, d’HbA et d’HbS. • qualitatives : présence de fractions anormales,
L’analyse doit être faite par une technique de d’HbS ;
séparation des différentes fractions d’hémoglo- • quantitatives : évaluation du pourcentage des
bine. Plusieurs techniques sont disponibles : chro- fractions HbA, HbF et HbS.
matographie liquide haute performance (CHLP), Indications : diagnostic d’un syndrome drépa-
électrophorèse capillaire (EC) ou spectrométrie nocytaire majeur (SS, SC ou S-beta-thalassémies).
de masse (SM). Si une anomalie est détectée, au
moins deux techniques doivent être réalisées. Place dans la hiérarchie d’un
Test de dépistage à réaliser si les parents sont à
risque d’être porteurs d’une hémoglobine S, en
fonction de l’origine géographique.
Nature du prélèvement Sang total capillaire prélevé au talon du nouveau-né au 3e jour de vie.
Contraintes d’acheminement Envoi le jour même dans une enveloppe papier (plastique à proscrire).
Principe méthodologique Toutes méthodes de séparation des protéines : chromatographie, électrophorèse capillaire,
spectrométrie de masse.
Type de méthode Méthodes automatisées : HPLC, SM et EC : automates dédiés disponibles sur le marché.
Type de test Mesure qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être
impérativement confirmée par une ou deux autres techniques (y compris pour l’HbS). Évaluation
semi-quantitative du pourcentage des fractions présentes normales et anormales.
CIQ CIQ fournisseurs.
EEQ UKNEQAS.
Valeurs de référence/Inter- Bonnes sensibilité et spécificité.
Causes d’erreur, limites du test Prématurité, transfusion.
Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF), ce qui peut
interférer avec leur quantification, ou empêcher leur détection. C’est la raison pour laquelle
l’utilisation d’au moins deux méthodes de screening est recommandée.
Si un variant est dépisté, l’utilisation d’autres techniques est indiquée pour son identification.
Bibliographie du chapitre 5 characterization of hemoglobinopathies. Ann Biol

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FICHE 5.4 – Test à l’isopropanol (Hb instable)
Chapitre 6
Tests globaux et facteurs
de coagulation

84 Hémostase et coagulation
Fiche 6.1
Temps de Quick (taux de prothrombine/INR) en l’absence
de traitement par antivitamine K
NABM 0126
Signification biologique du paramètre • suivi biologique des traitements par antivi-

Le temps de Quick (TQ) est le temps de coagula- tamine K (résultat en INR) (voir Synopsis I :
tion, mesuré à + 37 °C, d’un plasma citraté pauvre stratégie diagnostique devant un allongement du
en plaquettes (PPP), après addition de thrombo- TQ, p. 108 (Figure 6.1) ;
plastine calcique. C’est un test chronométrique • diagnostic et suivi d’une hépatopathie, d’une
semi-global qui permet d’explorer les déficits hypovitaminose K ;
en facteurs de la voie du facteur tissulaire, aussi • diagnostic et suivi d’une coagulopathie de
appelée voie extrinsèque de la coagulation, impli- consommation : coagulation intravasculaire dis-
quant les facteurs VII, X, V, II et le fibrinogène. séminée.
La thromboplastine, d’origine humaine (recom-
binante ou placentaire) ou animale (lapin), mime Place dans la hiérarchie d’un
l’activation de la coagulation par le facteur tis- bilan d’exploration
sulaire en présence d’un excès de phospholipides. Le TQ étant le seul test global explorant le fac-
teur VII, la mesure du TQ associée à celle du temps
Objectifs de l’analyse et principales de céphaline avec activateur (TCA) permet l’explo-
indications de prescription ration de l’ensemble des facteurs de la coagulation,
à l’exception du facteur XIII. Le TQ fait ainsi
Objectifs : dépistage d’un déficit en un ou plu-
partie du bilan d’hémostase de première intention.
sieurs facteurs (II, V, VII, X ou en fibrinogène).
Selon la NABM, un TQ allongé peut être exploré à
Le déficit peut être lié à un défaut de synthèse
l’initiative du biologiste lors de la première visite ou
et/ou à une consommation excessive, et/ou à un
en cas de discordance franche avec les antériorités,
déficit constitutionnel, ou exceptionnellement à
en ajoutant sur le même prélèvement la mesure de
la présence d’un anticorps (inhibiteur, antiphos-
la concentration du fibrinogène et du taux de trois
pholipides).
facteurs parmi les suivants : II, V, VII, X ou VII + X.
Indications :
L’allongement du TQ, isolé ou associé à un allon-
• exploration d’un syndrome hémorragique (voir
gement du TCA, lié au déficit en un ou plusieurs
Synopsis IV : orientation clinique devant un syn-
facteurs, oriente vers différents diagnostics (cf. arbres
drome hémorragique, p. 108 (Figure 7.1) ;
décisionnels). Un TQ raccourci peut être expliqué
• évaluation du risque hémorragique dans un
par une hypercoagulabilité dans un contexte inflam-
contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan
matoire ou un problème pré-analytique.
biologique est indiqué ;
Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M
[3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également
possible.
Recommandations pour la Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Renseigner impérativement tout
qualité du prélèvement traitement anticoagulant en cours ou récemment arrêté.
Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de l’INR après le prélèvement doivent respecter les
recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total et plasma : recommandé à
température ambiante jusqu’à 24 h, acceptable jusqu’à 4 h à température réfrigérée ou jusqu’à 2 h
entre + 25 ° et + 30 °C.
Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation 85
Principe méthodologique Test chronométrique réalisé en un temps. La thromboplastine calcique est ajoutée au PPP
pré-incubé à + 37 °C. Le facteur tissulaire se lie au facteur VIIa qui active les facteurs X en Xa
et IX en IXa. Le complexe prothrombinase active la prothrombine en thrombine qui transforme
le fibrinogène en caillot de fibrine. La détection du caillot est, selon les systèmes, soit électro-
mécanique, soit photométrique. Le TQ est exprimé en secondes. Les Anglo-Saxons l’expriment en
ratio TQ patient/TQ témoin (moyenne géométrique des TQ d’au moins 20 sujets sains). En France, il
est converti en pourcentage d’activité (taux de prothrombine-TP) à partir d’une droite d’étalonnage
(Thivolle). Il peut être rendu en INR (International Normalized Ratio), égal au rapport TQ patient/TQ
témoin élevé à la puissance ISI (index de sensibilité international de la thromboplastine).
Type de mesure Mesure quantitative.
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoire possible (CIL).
EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux.
Valeurs de référence/Inter- Un TP normal chez les adultes sains est compris entre 70 et 120 %. Il est peu informatif chez le
prétation et performances nouveau-né (préférer la mesure des facteurs). Normes maximales acceptables (95e percentiles)
recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité du TP ( %) (GFHT 2015) :
TP < 43 % ; CV < 7,9 % / TP > 43 % ; CV < 5,6 %
Causes d’erreur, limites du Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Le TQ/
test INR est sensible à des concentrations d’héparine non fractionnée > 1,0 UI/mL et de bas poids
moléculaire > 1,5 UI anti-Xa/mL. Le TQ ne permet pas d’évaluer l’effet des anticoagulants oraux
directs (AOD). Des interférences en cas de fibrinogène élevé sont également observées avec
certains réactifs.
Synopsis I
Stratégie diagnostique devant un allongement du TQ
Figure 6.1. Stratégie diagnostique devant un allongement du TQ.

Fiche 6.2
Temps de céphaline avec activateur (TCA)
NABM 1127 et 1128
Signification biologique du paramètre • évaluation du risque hémorragique dans un

Le temps de céphaline avec activateur (TCA) est contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan
le temps de coagulation, mesuré à + 37 °C, d’un biologique est indiqué ;
plasma pauvre en plaquettes (PPP) citraté en pré- • suivi d’un traitement par HNF à dose curative
sence d’un excès de phospholipides (céphaline) en l’absence d’activité anti-Xa disponible.
et d’un activateur de la voie des facteurs contacts
après ajout d’ions calcium. C’est un test semi- Place dans la hiérarchie d’un
global chronométrique permettant de dépister les bilan d’exploration
déficits en facteurs de la voie commune (fibrino- • Dans l’exploration d’un syndrome hémorra-
gène, II, V, X) et de la voie des facteurs contacts gique, réaliser en première intention : hémo-
(ou voie endogène ; facteurs VIII, IX, XI, XII, gramme, TP, TCA, mesure du fibrinogène
prékallikréine, kininogènes de haut poids molé- fonctionnel. En cas de syndrome hémorragique
culaire). Les différents réactifs disponibles varient avéré, la mesure de l’activité coagulante des fac-
en termes de nature et de concentration des phos- teurs VIII, IX et XI, ainsi que l’activité et l’anti-
pholipides (céphaline d’origine animale, végétale, gène du facteur Willebrand peuvent être réalisés
phospholipides synthétiques, etc.) et d’activateur d’emblée.
(silice, acide ellagique, célite, kaolin [TCK], etc.) • Lorsqu’un bilan pré-opératoire est justifié,
ce qui conduit à une sensibilité variable aux comme chez l’enfant n’ayant pas acquis la marche
déficits en facteurs et aux anticoagulants circulants (cf. recommandation de la SFAR 2012) en plus
(ACC), quelle que soit leur nature (antiphospho- de l’hémogramme, un TCA est le plus souvent
lipides, anti-facteurs, héparines, anticoagulants prescrit en première intention en association avec
oraux directs, etc.). un TP. Dans ces indications, privilégier un réactif
sensible aux déficits en facteurs VIII, IX et XI,
Objectifs de l’analyse et principales comme par exemple, le Kaolin (TCK).
indications de prescription • Pour le suivi d’un traitement par HNF à dose
Objectifs : curative, le TCA mesuré à l’aide d’un réactif
• dépistage d’un déficit en un ou plusieurs facteurs adapté peut être utilisé lorsque l’activité anti-Xa
de la coagulation lié à un déficit constitutionnel, n’est pas disponible.
un défaut de synthèse et/ou une consommation • L’allongement du TCA doit être interprété en
excessive en facteur(s), ou à un anticorps dirigé fonction des résultats d’examens effectués paral-
contre un facteur (inhibiteur). S’agissant d’un lèlement (TP, fibrinogène), ainsi que du contexte
test semi-global, l’augmentation d’un des fac- clinique et thérapeutique.
teurs peut se traduire par un raccourcissement du • En cas d’allongement du TCA associé à une dimi-
TCA ; nution du TP, en l’absence de traitement anticoagu-
• surveillance de l’héparinothérapie par héparine lant, l’exploration est habituellement poursuivie par
non fractionnée (HNF) en l’absence d’activité la mesure de l’activité coagulante des facteurs II, V,
anti-Xa disponible. VII et X et du fibrinogène. Un ACC de type lupique
Indications : de titre élevé peut aussi, outre l’allongement du
• exploration d’un syndrome hémorragique (voir TCA, entraîner une diminution du TP.
(voir Synopsis IV : orientation clinique devant un • Devant un allongement inexpliqué et isolé du
syndrome hémorragique, p. 114 (Figure 7.1)) ; TCA, le biologiste peut réaliser une épreuve de
correction du TCA, mesurer l’activité coagulante
des facteurs VIII, IX, XI, voire rechercher un • La correction du TCA malade après addition
inhibiteur spécifique anti-facteur VIII, IX ou XI, de plasma témoin, (IAC < 15) est en faveur
si le contexte clinique et biologique est évocateur. d’un déficit en facteur ; l’absence de correction
L’épreuve de correction du TCA par addition de (IAC > 15) est en faveur de la présence d’un
plasma normal dit « plasma témoin » au plasma du ACC lupique ou d’un inhibiteur anti-facteur.
patient dit « plasma malade » permet d’orienter le Le résultat de l’épreuve de correction du TCA
diagnostic soit vers un déficit en facteur, soit vers la ne permet pas d’exclure un déficit en facteur de
présence d’un ACC. Il consiste à mesurer le TCA la voie endogène. Ainsi, quel que soit le résultat
du malade (M), du témoin (T) et du mélange à de l’IAC, il est recommandé de doser les taux
volume égal (M + T), puis à calculer l’indice d’anti- de facteurs VIII, IX et XI si le contexte clinique
coagulant circulant (correspondant à l’ancienne le justifie. La confirmation d’un ACC lupique
dénomination Indice de Rosner) (IAC) : ne se justifie que dans un contexte clinique de
maladie auto-immune ou de maladie throm-
= [TCA (M + T) − TCA(T)] × 100 / TCA (M) boembolique.
[3,8 %]) ou CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole).
Recommandations pour la Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation du TCA après le prélèvement doivent respecter les
recommandations pré-analytiques du GFHT 2017.
Dans le cas d’un TCA (sans HNF) :
- en sang total sur tube citraté : à température ambiante jusqu’à 4 h si mesure des facteurs de la
voie endogène et jusqu’à 6 h sans mesure des facteurs de la voie endogène ;
- en PPP sur tube citraté, si centrifugation dans les 2 heures, jusqu’à 4 h à température ambiante
si mesure des facteurs de la voie endogène ; jusqu’à 8 h à température ambiante et toléré jusqu’à
8 h à température réfrigérée sans mesure des facteurs de la voie endogène.
Dans le cas d’un TCA (avec HNF) :
- en sang total sur tube citraté : jusqu’à 2 heures, à température ambiante ;
- en PPP sur tube citraté : jusqu’à 4 h si centrifugation dans l’heure, plasma décanté ou non,
conservation à température réfrigérée (+ 2 à + 8 °C) ou ambiante ;
- en sang total ou plasma sur tube CTAD : jusqu’à 6 h à température ambiante.
Principe méthodologique Test chronométrique réalisé en deux temps : le PPP est pré-incubé à + 37 °C en présence d’un
excès de phospholipides (céphaline) et d’activateur, la coagulation est ensuite déclenchée par
l’addition d’ions calcium. La détection du caillot est, selon les systèmes, soit électro-mécanique,
soit photométrique. Le « TCA malade » exprimé en secondes est rapporté à un « TCA témoin »
défini pour chaque lot de réactif permettant de calculer un ratio (malade/témoin).
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL).
Valeurs de référence/Inter- - Les intervalles de référence du TCA ratio (malade/témoin) varient en fonction des systèmes de
prétation et performances mesure (le plus souvent 0,80 à 1,19 chez l’adulte ; le TCA ratio est plus élevé à la naissance et
diminue avec l’âge).
- Le choix du réactif du TCA par le biologiste doit tenir compte de l’indication et du contexte
clinique. Les renseignements cliniques et les traitements anticoagulants (nom, posologie et
heures d’administration), indispensables pour l’interprétation du TCA, doivent être obligatoirement
mentionnés sur la prescription. Un traitement par héparine, antagoniste de la vitamine K ou
anticoagulant oral direct peut allonger le TCA.
- Le TCA peut être allongé dans des situations n’exposant pas à un risque hémorragique : déficit
en facteur de la phase contact (facteur XII, kininogènes de haut poids moléculaire et prékalli-
créine), présence d’un anticoagulant circulant phospholipo-dépendant, interférence in vitro de la
CRP avec certains réactifs de TCA.
- La surveillance d’un traitement par HNF par le TCA présente des inconvénients majeurs, car le
TCA n’est pas spécifique de l’héparine et peut être modifié dans de nombreux contextes cliniques
(hémodilution, déficit en facteurs, traitement par AVK, présence d’un anticoagulant lupique, et/ou
augmentation du taux de facteur VIII dans les syndromes inflammatoires, taux de CRP élevés, etc.).
Le risque est de conduire à des ajustements posologiques erronés. Le Groupe français d’étude
sur l’hémostase et la thrombose (GFHT) préconise d’effectuer le suivi des traitements par HNF en
mesurant l’activité anti-Xa.
- Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation
de reproductibilité du TCA en ratio (GFHT 2014) : ratio < 1,1 ; CV < 4,1 % / ratio > 1,1 ; CV < 5,3 %.
Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin : ponction
veineuse difficile, non-respect de la nature ou du volume de l’anticoagulant, délai trop long
avant la réalisation du test, prélèvement hémolysé, initiation in vitro de la coagulation ou
présence d’héparine souillant le prélèvement, traitement anticoagulant non signalé. Un deuxième
prélèvement est alors recommandé.
Synopsis II
Conduite à tenir devant un TCA allongé
Figure 6.2. . Conduite à tenir devant un TCA allongé.

M : malade ; T : témoin ; AVK : antivitamine K ; AOD : anticoagulants oraux directs.
Synopsis III
Démarche diagnostique devant un allongement isolé du TCA
Figure 6.3. . Démarche diagnostique devant un allongement isolé du TCA.

D’après Calmette et al., EMC Traité de Médecine Akos, 2017.
Fiche 6.3
Dosage du fibrinogène fonctionnel (facteur I)
NABM 0174
Signification biologique du paramètre hypofibrinogénémie, dysfibrinogénémie) et l’iden-

Synthétisé et libéré dans le plasma par les hépa- tification moléculaire.
tocytes, le fibrinogène (Fg) peut être transformé, Indications : évaluation d’une anomalie de syn-
lors de l’activation de la coagulation, en un réseau thèse (dysfonction hépatique, traitement par L-
de fibrine englobant les cellules circulantes. De la asparaginase), d’une réaction inflammatoire, d’une
sorte, il permet la structuration du caillot sanguin. hémodilution (pertes sanguines importantes,
Sa fixation aux plaquettes (comme à d’autres cel- échanges plasmatiques, etc.), bilan pré-opératoire
lules) est une autre composante de sa fonction si celui-ci est indiqué (cf. recommandation de
hémostatique. Sa concentration peut diminuer en la SFAR 2012), recherche d’une consommation
cas de dysfonction hépatique, d’hémodilution, de intravasculaire (disséminée ou localisée), d’une
consommation, d’activation de la fibrinolyse, de fibrinolyse primitive (par libération d’enzymes
processus protéolytiques pathologiques, et s’élever protéolytiques au cours d’affections pancréa-
en cas de réaction inflammatoire. Un certain nom- tiques, de certains néoplasmes, d’envenimations).
bre de variants constitutionnels ont été recensés, En cas de résultat pathologique, le suivi peut être
quantitatifs et/ou qualitatifs, dont les expressions indiqué, après substitution à visée corrective, ou
cliniques sont variables (syndromes hémorragiques, comme marqueur de sévérité et d’évolution.
thromboses artérielles, thromboses veineuses, amy-
lose, absence de symptomatologie). Place dans la hiérarchie d’un
La mesure fonctionnelle du fibrinogène est habi-
tuellement un examen de première intention en
Objectifs : recherche d’une anomalie du fibrino- cas d’hémorragie, de maladie thromboembolique,
gène dans le cadre d’un syndrome hémorragique, de dysfonction hépatique, de recherche d’un syn-
d’un bilan préopératoire lorsque le bilan biologique drome inflammatoire, d’une consommation ou
est indiqué, d’une maladie thromboembolique d’une fibrinolyse, de traitement par L-asparagi-
veineuse, d’une pathologie susceptible d’affecter nase. Elle peut être effectuée en seconde intention
sa synthèse ou sa consommation. Il a été aussi en cas d’anomalie d’un test global de la coagula-
décrit comme marqueur de l’athérosclérose. Les tion comme un allongement du temps de Quick
variants constitutionnels sont rares mais justifient et/ou du temps de céphaline avec activateur
une caractérisation précise dont dépendra la prise (TCA) non lié à un anticoagulant.
en charge, variable selon le type (afibrinogénémie,
[3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible.
Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations
du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation du dosage du fibrinogène après le prélèvement doivent
respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total et plasma, stabilité
jusqu’à 24 h à température ambiante ; en plasma jusqu’à 24 h entre + 4 et + 25 °C ; en plasma
congelé (<– 20 °C) jusqu’à 24 mois.
Principe méthodologique La mesure habituelle est chronométrique par méthode de Clauss, le temps de formation du caillot obtenu
avec une concentration importante de thrombine étant corrélé à la quantité de fibrinogène coagulant. La
détection peut être mécanique ou optique. Dans ce dernier cas, la mesure peut être également dérivée de
la courbe de formation du caillot du temps de Quick (amplitude maximale), à la condition que ce temps
soit normal. Une mesure immunologique peut compléter la mesure chronométrique afin de caractériser
un déficit. Une évaluation sur sang total est possible par thromboélastographie.
Valeurs de référence/Inter- Les résultats sont exprimés en g/L. Concentrations plasmatiques dès la naissance 1,5 à 3,5 g/L,
prétation et performances pouvant augmenter avec l’âge et varier selon l’origine ethnique. Un déficit inattendu doit être
confirmé sur un second prélèvement. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les
coefficients de variation (CV) de reproductibilité du Fg (GFHT 2015) : CV < 7,6 % quelle que soit
la concentration.
Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin ; présence
de PDF, d’héparine (au-delà de 2 UI/mL), d’argatroban, de bivalirudine, de dabigatran (selon
le réactif employé). En cas de détection optique : lipémie et autres interférents à la lecture de
l’opacité du caillot. L’existence d’un syndrome inflammatoire peut masquer un déficit modéré.
Fiche 6.4
Dosage de l’activité coagulante du facteur II
(prothrombine)
Code NABM 1014
Signification biologique du paramètre mission autosomale récessive est exceptionnel

Le facteur II (FII) ou prothrombine est une (prévalence des formes homozygotes estimée à
protéine vitamine K dépendante, appartenant au 1/2 000 000), caractérisé par des hémorragies
complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est cutanéo-muqueuses d’autant plus sévères que le
synthétisé par le foie et a une masse moléculaire taux de FII est bas.
de 72 kDa. Sa demi-vie plasmatique est de 50 à Indications : devant un allongement du temps
120 h. Il intervient dans la voie commune de la de Quick et du temps de céphaline avec activateur
coagulation. La prothrombine est activée par le (TCA) lors de l’exploration d’un syndrome hémor-
complexe prothrombinase (facteur Xa, facteur Va, ragique (voir Synopsis I (Figure 6.1) : stratégie diag-
ions calcium et phospholipides) en thrombine nostique devant un allongement du TQ, Synopsis
(FIIa). La thrombine transforme le fibrinogène en II (Figure 6.2) : conduite à tenir devant un TCA
fibrine, amplifie sa propre formation et active les allongé et Synopsis IV (Figure 7.1) : orientation cli-
plaquettes et le système inhibiteur de la coagula- nique devant un syndrome hémorragique), de l’éva-
tion de la protéine C. luation du risque hémorragique dans un contexte de
bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est
indiqué, du diagnostic et du suivi d’une hépatopa-
Objectifs de l’analyse et
thie, d’une hypovitaminose K, du diagnostic et suivi
principales indications
d’une coagulopathie de consommation.
Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou
constitutionnel en FII. Les déficits acquis sont Place dans la hiérarchie d’un
le plus souvent des déficits combinés de plusieurs bilan d’exploration
facteurs de la coagulation rencontrés dans les
hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellu- Il s’agit d’un test de seconde intention indiqué
laires et les coagulopathies de consommation. Les devant un allongement associé du temps de Quick
déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps anti- et du TCA. La mesure de l’antigène par méthode
facteur II ou associés à un anticoagulant circulant immunologique est indiquée pour typer un déficit
lupique ou à une infection virale sont plus rares. isolé en FII (quantitatif ou qualitatif), en labora-
Le déficit constitutionnel sévère en FII de trans- toire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible
mais n’est pas nécessaire pour le diagnostic.
possible.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation
du prélèvement pour la mesure du FII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité :
- en sang total d’au moins 24 h à température ambiante ;
- en plasma inférieure à 4 h à température ambiante ;
- en plasma congelé inférieure à 12 mois.
Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume égal
du plasma malade dilué au 1/10 le plus souvent et d’un plasma réactif déficitaire en FII. Une droite
d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec activité du FII proche
de 100 %) mélangées au plasma réactif déficitaire en FII. Le temps mesuré est transformé en pourcen-
tage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage.
Valeurs de référence/Inter- Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %).
prétation et performances Taux plasmatique à la naissance > 25 %, chez l’enfant à partir de 3 mois et chez l’adulte :
60-140 %.
Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième
prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis.
Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation
de reproductibilité du FII (GFHT 2015) : FII < 90 % ; CV < 7,5 % / FII > 90 % ; CV < 6,3 %.
Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Les
résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants
oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FII et entraîner une sous-estimation du
taux de FII, variable suivant l’AOD et sa concentration.
Fiche 6.5
Dosage de l’activité coagulante du facteur V
(proaccélérine)
Code NABM 1015
Signification biologique du paramètre à un auto-anticorps anti-facteur V sont plus

Le facteur V plasmatique (FV) est une glyco- rares. Le déficit constitutionnel sévère en FV
protéine essentielle à la génération de thrombine de transmission autosomale récessive est très
et à la coagulation. Il est synthétisé par le foie rare (prévalence des formes homozygotes
et activé par la thrombine. Il existe un pool 1/106), caractérisé par des hémorragies
plaquettaire de facteur V (environ 20 % du cutanéo-muqueuses d’autant plus sévères que le
pool plasmatique). Sa masse moléculaire est taux de FV est bas. À noter l’existence de déficits
d’environ 330 KDa et sa demi-vie plasmatique constitutionnels combinés des facteurs V et VIII
de 12 à 36 h. Il intervient dans la voie commune (prévalence 1/105 à 1/106).
de la coagulation. Le facteur Va forme un Indications : devant un allongement du temps
complexe équimoléculaire avec le facteur Xa en de Quick et du temps de céphaline avec activa-
présence d’ions calcium et de phospholipides. teur (TCA) lors de l’exploration d’un syndrome
Ce complexe « prothrombinase » transforme hémorragique (voir Synopsis IV : orienta-
la prothrombine en thrombine. La thrombine tion clinique devant un syndrome hémorra-
transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie gique, p. 114 (Figure 7.1)), de l’évaluation
sa propre formation, active les plaquettes et du risque hémorragique dans un contexte de
le système inhibiteur de la coagulation de la bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique
protéine C. Le facteur Va est inactivé par la est indiqué, du diagnostic et du suivi d’une
protéine C activée, en présence de protéine S, hépatopathie, d’une hypovitaminose K, du
d’ions calcium et de phospholipides. diagnostic et du suivi d’une coagulopathie de
consommation.
indications de prescription Place dans la hiérarchie d’un
Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou bilan d’exploration
constitutionnel en FV. Les déficits acquis Il s’agit d’un examen de seconde intention indi-
sont le plus souvent des déficits combinés de qué devant un allongement associé du temps de
plusieurs facteurs de la coagulation, rencontrés Quick et du TCA. La mesure de l’antigène par
dans les hypovitaminoses K, les insuffisances méthode immunologique est indiquée pour typer
hépatocellulaires et les coagulopathies de un déficit isolé en FV (quantitatif ou qualitatif),
consommation. Les déficits acquis isolés liés en laboratoire spécialisé.
possible.
du prélèvement pour la mesure du FV. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité :
- en sang total de 8 h à température ambiante ;
- en plasma congelé d’au moins 24 mois.
Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume
égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FV. Une droite d’éta-
lonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FV
proche de 100 %) mélangées au plasma réactif déficitaire en FV. Le temps mesuré est transformé
en pourcentage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage.
prétation et performances Taux plasmatique chez le nouveau-né > 40 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %.
Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième
prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis. L’analyse moléculaire est possible mais
n’est pas nécessaire pour le diagnostic. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les
coefficients de variation de reproductibilité du FV (GFHT 2015) : FV < 90 % ; CV < 8,3 % / FV
> 90 % ; CV < 7,2 %.
Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Les
résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants
oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FV et entraîner une sous-estimation du
taux de FV, variable suivant l’AOD et sa concentration.
Fiche 6.6
Dosage de l’activité coagulante du facteur VII
(proconvertine)
Code NABM 1016
Signification biologique du paramètre déficit constitutionnel en FVII est le moins rare

Le facteur VII (FVII) ou proconvertine est une parmi les déficits en protéines de la coagulation
protéine vitamine K dépendante, appartenant au (prévalence estimée à 1/300 000), il est de
complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est transmission autosomique récessive. Les manifes-
synthétisé par le foie et a une masse moléculaire tations hémorragiques sont variables et ne sont
de 50 KDa. Sa demi-vie est brève (4 à 6 h). Le pas corrélées aux taux résiduels d’activité du FVII.
facteur VII est présent dans la circulation à l’état Généralement, seuls les taux de FVII coagu-
de traces, sous sa forme activée et forme un lant < 30 % peuvent être symptomatiques.
complexe avec le facteur tissulaire (FT). Il possède Indication : devant un allongement du temps
un rôle essentiel dans l’initiation de la coagulation de Quick lors de l’exploration d’un syndrome
in vivo. Le complexe FT/FVIIa, en activant le hémorragique (voir Synopsis IV : orientation
facteur X et le facteur IX, participe à la généra- clinique devant un syndrome hémorragique,
tion de thrombine (FIIa). La thrombine trans- p. 114 (Figure 7.1), de l’évaluation du risque
forme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre hémorragique dans un contexte de bilan pré-
formation et active les plaquettes et le système opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué,
inhibiteur de la coagulation de la protéine C. du diagnostic et suivi d’une hépatopathie, d’une
hypovitaminose K, du diagnostic et suivi d’une
coagulopathie de consommation.
Objectifs de l’analyse et
Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou consti Place dans la hiérarchie d’un
tutionnel en FVII. Les déficits acquis sont le bilan d’exploration
plus souvent des déficits combinés de plusieurs Il s’agit d’un examen de seconde intention indi-
facteurs de la coagulation rencontrés dans les qué devant un allongement du temps de Quick.
hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocel- La mesure de l’antigène par méthode immuno-
lulaires et les coagulopathies de consommation. logique est indiquée pour typer un déficit isolé
Du fait de sa demi-vie très courte, le FVII est le en FVII (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire
premier à diminuer. Les déficits acquis isolés liés spécialisé. En cas de déficit congénital, l’analyse
à un auto-anticorps anti-FVII sont plus rares. Le du gène du FVII peut être demandée.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la conservation du prélèvement
pour la mesure du FVII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité :
- en plasma congelé de 6 mois.
égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FVII. Il existe aussi
des réactifs composés d’un mélange de protéines de la coagulation excluant le FVII. L’utilisation
de réactif déficient en facteur VII et X permet une mesure combinée du couple VII + X. Une droite
d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec une activité
du FVII proche de 100 %) mélangées au réactif déficitaire en FVII. Le temps mesuré est transformé
en % d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage.
prétation et performances Taux plasmatique à la naissance > 30 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diag-
nostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement
et après avoir éliminé un déficit acquis. Le taux de FVII n’est pas toujours corrélé à la sévérité du
syndrome hémorragique.
Normes acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibilité du FVII
(GFHT 2015) : FVII < 97 % ; CV < 8,9 % / FVII > 97 % ; CV < 7,6 %.
Causes d’erreur, limites Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagu-
lants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FVII et entraîner une sous-estimation
du taux de FVII, variable suivant l’AOD et sa concentration.
Fiche 6.7
Dosage de l’activité coagulante du facteur X (facteur
Stuart)
Code NABM 1017
Signification biologique du paramètre FX ou lors d’amylose sont plus rares. Le déficit

Le facteur X (FX) ou facteur Stuart est une constitutionnel en FX est très rare (prévalence
protéine vitamine K dépendante, appartenant au des formes homozygotes estimée à 1/500 000),
complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est il est de transmission autosomique récessive. Les
synthétisé par le foie et a une masse moléculaire manifestations hémorragiques sont d’autant plus
de 59 kDa. Sa demi-vie plasmatique est de 36 sévères que le taux de FX est bas.
à 48 h. Le FX intervient dans la voie commune Indications : devant un allongement du
de la coagulation. Il est activé en facteur Xa par temps de Quick et du temps de céphaline
le complexe facteur tissulaire/FVIIa et par le avec activateur (TCA) lors de l’exploration
complexe tenase (facteur VIIIa/IXa), en présence d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis
de phospholipides et d’ions calcium. Le facteur Xa IV : orientation clinique devant un syndrome
forme avec le facteur Va le complexe prothrombi- hémorragique, p. 114 (Figure 7.1), de l’évalua-
nase qui catalyse la conversion de la prothrombine tion du risque hémorragique dans un contexte
en thrombine (FIIa). La thrombine transforme de bilan pré-opératoire lorsque le bilan bio-
le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre for- logique est indiqué, du diagnostic et du suivi
mation et active les plaquettes et le système d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K,
inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Le du diagnostic et du suivi d’une coagulopathie
facteur Xa est neutralisé par le TFPI (Tissue Factor de consommation.
Plasma Inhibitor) et l’antithrombine.
Objectifs de l’analyse et bilan d’exploration
Examen de seconde intention indiqué devant
Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou un allongement associé du temps de Quick et
constitutionnel en FX. Les déficits acquis sont le du TCA. La mesure de l’antigène par méthode
plus souvent des déficits combinés de plusieurs immunologique est indiquée pour typer un déficit
facteurs de la coagulation, rencontrés dans les isolé en FX (quantitatif ou qualitatif), en labora-
hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellu- toire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible
laires et les coagulopathies de consommation. Les mais n’est pas nécessaire au diagnostic.
déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps anti-
possible.
du prélèvement pour la mesure du FX. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité :
- en plasma inférieure à 4 h température ambiante ;
égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FX. À noter qu’il
existe aussi des réactifs composés d’un mélange de protéines de la coagulation excluant le FX.
L’utilisation de réactif déficient en facteur VII et X permet une mesure combinée du couple VII + X.
Une droite d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec
une activité du FX proche de 100 %) mélangées au réactif déficitaire en FX. Le temps mesuré est
transformé en pourcentage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage.
prétation et performances Taux plasmatique à la naissance >20 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diag-
nostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement et
après avoir éliminé un déficit acquis.
Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibi-
lité du FX (GFHT 2015) : FX < 90 % ; CV < 8 % / FX > 90 % ; CV < 7 %.
Causes d’erreur, limites Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagu-
lants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FX et entraîner une sous-estimation
du taux de FX, variable suivant l’AOD et sa concentration.
Fiche 6.8
Dosage de l’activité coagulante du facteur VIII
(anti-hémophilique A)
Code NABM 0178
Signification biologique du paramètre FVIII. Le déficit constitutionnel (hémophilie A)

Le facteur VIII (FVIII) ou anti-hémophilique A est de transmission récessive liée à l’X (prévalence
est une glycoprotéine plasmatique essentielle à la 1/5 000 garçons).
génération de thrombine et à la coagulation. Il Indications : en cas d’allongement isolé du temps
est synthétisé principalement par le foie et il est de céphaline avec activateur (TCA) et/ou de
également présent dans de nombreux tissus. Sa survenue de manifestations hémorragiques non
masse moléculaire est voisine de 300 KDa et sa expliquées car, selon les réactifs utilisés, des défi-
demi-vie plasmatique de 12 heures. Il circule dans cits modérés en FVIII peuvent ne pas allonger
le plasma sous une forme liée au facteur Wille- significativement le TCA. La mesure du FVIII:C
brand qui le protège de la dégradation. Le FVIII est également utile dans le suivi du traitement des
est un cofacteur enzymatique de la coagulation. Il patients hémophiles A ou atteints d’une maladie
joue un rôle majeur dans la cascade de la coagu- de Willebrand recevant des concentrés de FVIII
lation puisqu’après activation par la thrombine, ou de la desmopressine. Le taux minimal de
il s’associe au facteur IXa en présence de phos- FVIII:C pour assurer une hémostase normale est
pholipides et contribue à l’activation du facteur X de l’ordre de 30 %.
en facteur X activé, capable de transformer la
prothrombine en thrombine, enzyme clé de la Place dans la hiérarchie d’un
coagulation. La thrombine transforme le fibri- bilan d’exploration
nogène en fibrine, amplifie sa propre formation, La mesure de l’activité coagulante du FVIII
active les plaquettes et le système inhibiteur de la réalisée par une technique chronométrique est un
coagulation de la protéine C. Le facteur VIIIa est examen de première intention chez les patients
inactivé par la protéine C activée, en présence de symptomatiques (manifestations hémorragiques)
protéine S, d’ions calcium et de phospholipides. ou de seconde intention devant un allongement
isolé du TCA. En cas de déficit constitutionnel,
une mesure par technique chromogénique ou
immunologique du FVIII (FVIII:Ag, RIHN 140
indications de prescription code E081) et une analyse du gène en biologie
Objectifs : dépistage d’un déficit constitutionnel moléculaire (chromosome X) devront être réa-
ou acquis en FVIII. Le déficit en FVIII:C per- lisées dans un laboratoire spécialisé. La mesure
met d’évoquer une hémophilie A constitution- chromogénique pourrait être à l’avenir la méthode
nelle ou acquise, une maladie de Willebrand ou optimale pour surveiller les patients substitués par
exceptionnellement un déficit combiné en FV et les concentrés de FVIII à demi-vie prolongée.
possible.
du prélèvement pour la mesure du FVIII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014)
indique une stabilité :
- en plasma de 8 h à température ambiante ;
Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du plasma
du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FVIII. Le temps mesuré est transformé en
pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence (cali-
brant avec une activité du FVIII proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FVIII.
Valeurs de référence/Inter- Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la
prétation et performances naissance augmenté (> 80 %) quel que soit le groupe sanguin. Les valeurs de l’adulte, atteintes vers
l’âge de 1 mois, sont comprises entre 50 et 150 %. Compte tenu de sa liaison au facteur Willebrand,
dont le taux est dépendant du groupe sanguin, les sujets du groupe sanguin O ont des taux de FVIII
physiologiquement plus bas. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de
variation de reproductibilité du FVIII (GFHT 2015) : CV < 9,5 %, quel que soit le taux de FVIII.
Causes d’erreur, limites Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC) de type lupique. Pour s’en affranchir, il
est recommandé :
- d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible aux ACC lupiques ;
- de tester le plasma sur au moins 2 dilutions (au minimum : 1/10 et 1/20).
En cas d’ACC lupique, le taux se normalise avec les dilutions les plus élevées.
Fiche 6.9
Dosage de l’activité coagulante du facteur IX
(anti-hémophilique B)
Code NABM 0179
Signification biologique du paramètre Indications : en cas d’allongement isolé du temps de

Le facteur IX (FIX) ou anti-hémophilique B est céphaline avec activateur (TCA) et/ou de survenue
une glycoprotéine plasmatique de synthèse hépa- de manifestations hémorragiques non expliquées,
tique vitamine K dépendante. Sa masse molé- car, selon les réactifs utilisés, des déficits modérés
culaire est voisine de 60 KDa et sa demi-vie en FIX peuvent ne pas allonger significativement le
plasmatique de 20 à 24 heures. Le FIX, zymogène TCA. La mesure du FIX:C est également utile dans
du facteur IX activé (sérine protéase), joue un le suivi du traitement des patients hémophiles B. Le
rôle majeur dans la cascade de la coagulation : taux minimal de FIX:C pour assurer une hémostase
après activation, il contribue à l’activation du normale est de l’ordre de 30 %.
facteur X en facteur X activé, qui transforme la
prothrombine en thrombine, enzyme clé de la Place dans la hiérarchie d’un
coagulation. La thrombine transforme le fibrino- bilan d’exploration
gène en fibrine, amplifie sa propre formation et La mesure du FIX:C par technique chronomé-
active les plaquettes et le système inhibiteur de la trique est un examen de première intention
coagulation de la protéine C. chez les patients avec des manifestations hémor-
ragiques, ou de seconde intention devant un
Objectifs de l’analyse et principales allongement isolé du TCA. Devant une diminu
indications de prescription tion du FIX:C, une origine acquise du déficit
Objectifs : dépistage d’un déficit constitutionnel doit toujours être éliminée. En cas de déficit
ou acquis en FIX. Les déficits acquis sont le constitutionnel, une mesure immunologique du
plus souvent des déficits combinés de plusieurs FIX (FIX:Ag, NABM 1028) et une analyse du
facteurs de la coagulation rencontrés dans les gène en biologie moléculaire (chromosome X)
hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellu- devront être réalisées dans un laboratoire spécia-
laires et les coagulopathies de consommation. Les lisé. Les mesures par technique chromogénique
déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps anti- ou amidolytique sont actuellement réservées
facteur IX sont rares. Le déficit constitutionnel aux dosages du FIX dans les concentrés de
(hémophilie B) est de transmission récessive liée à FIX. Cette méthode pourrait être à l’avenir la
l’X (prévalence 1/30 000 garçons). méthode optimale pour surveiller les patients
substitués par les concentrés de FIX à demi-vie
prolongée.
possible.
du prélèvement pour la mesure du FIX. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité :
Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du
plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FIX. Le temps mesuré est transformé
en pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence
(calibrant avec activité du FIX proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FIX.
prétation et performances Taux plasmatique à la naissance > 20 %, entre 3 et 6 mois > 40 %, entre 6 mois et 15 ans
> 50 %, 60-140 % chez l’adulte. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les
coefficients de variation (CV) de reproductibilité du FIX (GFHT 2015) : FIX < 102 % ;
CV < 10,1 % / FIX > 102 % ; CV < 7,5 %.
Causes d’erreur, limites Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC) de type lupique. Pour s’en affranchir, il
est recommandé :
- d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible à la présence d’un ACC lupique ;
En cas d’ACC lupique, le taux se normalise avec les dilutions les plus élevées.
Fiche 6.10
Dosage de l’activité coagulante du facteur XI (facteur
Rosenthal)
Code NABM 0180
Signification biologique du paramètre souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs

Le FXI est une proenzyme qui circule sous une de la coagulation rencontrés dans les insuffisances
forme dimérique inactive. Sa forme activée (FXIa) hépatocellulaires et les coagulopathies de consom-
est une sérine protéase qui intervient essentiellement mation. Les déficits acquis isolés liés à un auto-
dans l’amplification de la voie endogène de la coagu- anticorps anti-facteur XI sont rares. Le déficit
lation sanguine, ainsi que, de façon indirecte, dans la constitutionnel en FXI est principalement de trans-
fibrinolyse via l’activation du TAFI (Thrombin Acti- mission autosomale récessive (prévalence 1/106).
vatable Fibrinolysis Inhibitor). Le FXI est synthétisé Indication : en cas d’allongement isolé du temps
par les hépatocytes et vraisemblablement les mégaca- de céphaline avec activateur (TCA) et/ou de
ryocytes. Il circule à une concentration plasmatique survenue de manifestations hémorragiques non
comprise entre 3 et 7 µg/mL avec une demi-vie expliquées, car, selon les réactifs utilisés, des
comprise entre 40 et 80 heures. Sa stabilisation en déficits modérés en FXI peuvent ne pas allonger
circulation est assurée par le kininogène de haut significativement le TCA.
poids moléculaire. Le déficit en FXI est un déficit
rare qui expose à un risque hémorragique modéré, Place dans la hiérarchie d’un
souvent de type provoqué, cutanéo-muqueux ou bilan d’exploration
relatif aux tissus à forte activité fibrinolytique (sphère
La mesure de l’activité coagulante du FXI réalisée
ORL, tractus urogénital, muqueuse digestive). Les
par une technique chronométrique est un examen
accidents hémorragiques sont observés essentielle-
de première intention chez les patients sympto-
ment dans les situations chirurgicales ou post-trau-
matiques (manifestations hémorragiques), ou de
matiques. Le taux plasmatique de FXI est faiblement
seconde intention devant un allongement isolé
corrélé au phénotype hémorragique.
du TCA. La mesure de l’antigène par méthode
immunologique est indiquée pour typer un déficit
Objectifs de l’analyse et principales isolé en FXI (quantitatif ou qualitatif), en labora-
indications de prescription toire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible
Objectif : dépistage d’un déficit constitutionnel mais n’est pas nécessaire pour le diagnostic de
ou acquis en FXI. Les déficits acquis sont le plus déficit en FXI.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la conservation du prélèvement
pour la mesure de l’activité du FXI. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indiquait
une stabilité :
plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FXI. Le temps mesuré est transformé
en pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence
(calibrant avec activité du FXI proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FXI.
Intervalle de référence/inter- Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/dL (1 UI/ml = 100 %). Les valeurs de référence du
prétation/Performances FXI sont comprises entre 60 et 140 %. Un déficit en FXI est considéré comme sévère pour les
taux < 20 % ; il est généralement observé chez des patients porteurs de mutations homozygotes
ou hétérozygotes composites du gène du FXI (F11). Il est considéré comme modéré pour les taux
compris entre 20 et 50 %. La très grande majorité des déficits est de type quantitatif ; de rares
cas de déficits qualitatifs ont été décrits. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les
coefficients de variation (CV) de reproductibilité du FXI (GFHT 2015) : FXI < 97 % ; CV < 9,7 % /
FXI > 97 % ; CV < 8 %.
Causes d’erreur, limites Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC). Pour s’en affranchir, il est recommandé :
En présence d’ACC, les dilutions successives permettent une levée de l’interférence.
Fiche 6.11
Dosage de l’activité coagulante du facteur XII (facteur
Hageman)
Code NABM 0181
Signification biologique du paramètre ni à un risque hémorragique accru. Ces déficits

Le FXII est une proenzyme qui circule sous allongent cependant les tests de coagulation de
forme monomérique inactive. Essentiellement type TCA. L’implication de la voie du contact
synthétisé par les hépatocytes, le FXII circule à et en particulier du FXII, dans certains phéno-
une concentration plasmatique comprise entre mènes thrombotiques, est par contre suggérée
30 et 35 µg/mL (0,37 µM) avec une demi- par différentes études.
vie comprise entre 50 et 70 heures. Sa forme
activée (FXIIa) est une sérine protéase qui
active d’une part le FXI de l’hémostase et
d’autre part la prékallicréine (PK), proenzyme L’objectif de la mesure de l’activité du FXII est
impliquée dans l’inflammation, via la synthèse d’exclure ou de confirmer un déficit en FXII.
de bradykinine. Le FXI et la PK sont stabilisés Ce test peut être indiqué en cas d’allongement
sur les surfaces cellulaires par le kininogène de isolé significatif du temps de céphaline avec acti-
haut poids moléculaire (KHPM). Physiologi- vateur (TCA).
quement, le FXII peut être activé par l’héparine Selon les réactifs utilisés, des déficits modérés en
dérivée des mastocytes, le collagène, les acides FXII peuvent ne pas allonger significativement
nucléiques (ADN, ARN), les polyphosphates le TCA.
et les agrégats de protéines comme la protéine
bêta-amyloïde. Le FXII est également activé Place dans la hiérarchie d’un
par la liaison (ou « contact ») avec des surfaces bilan d’exploration
chargées négativement. Inversement, l’inhibi-
La mesure de l’activité coagulante du FXII réalisé
teur physiologique principal du FXII est la C1
par une technique chronométrique est un examen
estérase (C1inh). Les déficits en protéines de
de seconde intention en cas d’un allongement
la « phase contact » (FXII, PK et KHPM) ne
isolé du TCA.
sont pas associés à un syndrome hémorragique,
possible.
du prélèvement pour la mesure de l’activité du FXII. La synthèse de la littérature de Mauge et al.
(2014) indique une stabilité :
plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FXII. Le temps mesuré est transformé
en pourcentage d’activité via une courbe de calibration établie à partir d’un plasma de référence
(calibrant avec une activité du FXII proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FXII.
Intervalle de référence/inter- Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/dL (1 UI/ml = 100 %).
prétation/Performances Les valeurs usuelles du FXII sont comprises entre 60 et 140 %.
Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation (CV) de
reproductibilité du FXII (GFHT 2015) : FXII < 100 % ; CV < 12,3 % / FXII > 100 % ; CV < 7,9 %.
Causes d’erreur, limites Interférence possible avec les anticoagulants circulants (ACC). Pour s’en affranchir, il est
recommandé :
En présence d’ACC, les dilutions successives permettent une levée de l’interférence.
Fiche 6.12
Le thromboélastogramme (TEG®/ROTEM®)
Code RIHN E148
Signification biologique du paramètre désormais compatible avec un usage délocalisé. La
Le terme thromboélastogramme est ancien, et décrit connaissance rapide de l’hémostase du patient (esti-
le changement de viscosité sanguine lié à la polyméri- mation de la concentration de fibrinogène, présence
sation de la fibrine au cours de la coagulation. Par le ou non d’héparine dans le prélèvement, temps de
biais du TEG® (Haemonetics) et du ROTEM® (Tem formation du caillot fibrinoplaquettaire, détection
International GmbH / Werfen) le principe de cette d’une fibrinolyse) permet d’orienter rapidement la
mesure a été réactualisé. L’utilisation d’activateurs et prise en charge transfusionnelle (plasma frais congelé,
d’inhibiteurs spécifiques, associée à un outil informa- concentrés plaquettaires, concentrés en fibrinogène)
tique performant, permet de réduire les temps d’ana- en cas de profil anormal, dans un contexte d’urgence
lyse et d’augmenter la spécificité des tests. Avec des et dans un souci d’épargne sanguine.
réactifs appropriés, il est possible d’explorer chacune Place dans la hiérarchie d’un
des étapes de l’hémostase : hémostase primaire (pla- bilan d’exploration
quettes), coagulation et fibrinolyse, mais seuls sont
L’utilisation du TEG®/ROTEM® peut être dis-
identifiés les troubles majeurs de l’hémostase pouvant
cutée en première intention, dans certaines situations
faire discuter un support transfusionnel.
hémorragiques, en particulier en fin de chirurgie
Objectifs de l’analyse et principales cardiaque, au cours de l’hémorragie du post-partum,
indications de prescription chez le polytraumatisé. L’installation de ces automates
Compte tenu d’un délai de résultats réduit (moins de dans les services cliniques (au plus près du patient)
15 minutes), ce test apparaît adapté à la gestion de doit se faire sous la responsabilité du biologiste et
l’urgence. La dernière génération de ces automates doit être associée à des arbres décisionnels permettant
qui ne nécessite plus aucune étape de pipetage, est de guider la prise en charge transfusionnelle.
Nature du prélèvement Sang total citraté 0,105 M, 0,109 M (3,2 %), 0,129 M (3,8 %) ou natif (rapid TEG®).
Recommandations pour la Absence de recommandations spécifiques.
Contraintes d’acheminement Aucune en mode délocalisé. Au laboratoire, l’utilisation du pneumatique doit être validée par le
laboratoire.
Mode de conservation À température ambiante.
Principe méthodologique Mesure viscoélastique. La mesure de la formation du caillot fibrino-plaquettaire et d’une éventuelle
fibrinolyse est transformée en signal graphique (thromboélastogramme).
Type de mesure Mesure semi-quantitative.
CIQ CIQ commerciaux.
EEQ Oui (NEQAS, www.ukneqas.org.uk).
Valeurs de référence/Inter- Deux générations d’automates sont actuellement disponibles. Les automates de première
prétation et performances génération (TEG® 5000, ROTEM® delta) nécessitent des étapes de pipetage complexes et ne
semblent pas adaptés à un usage au lit du patient. La simplification extrême des automates de
deuxième génération (TEG®6S, ROTEM® sigma) pourrait en faire de véritables automates d’hémos-
tase délocalisée permettant l’étude de l’hémostase sur sang total au lit du patient. Toutefois, les
valeurs de référence doivent être établies pour chaque génération d’appareil.
Causes d’erreur, limites Résultats à interpréter en fonction du contexte clinique. Il convient de valider des arbres
décisionnels propres à chaque dispositif, dans chacune des situations cliniques, avec des seuils
d’intervention validés lors d’études cliniques (études en cours).
Bibliographie du chapitre 6 FICHE 6.7 – Dosage de l’activité coagulante du

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Chapitre 7
Examens complémentaires
pour l’exploration d’un syndrome
hémorragique

Synopsis IV
Orientation clinique devant un syndrome hémorragique
Figure 7.1. Orientation clinique devant un syndrome hémorragique.

* Molliex S et al, Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 31 (2012) 752–763.

Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 115
Fiche 7.1
Dosage fonctionnel du facteur Willebrand par mesure
de l’activité cofacteur de la ristocétine (ou autre méthode
évaluant la liaison à la glycoprotéine Ib plaquettaire)
NABM 0192
Signification biologique du paramètre référence qui permet de mesurer l’activité du VWF

Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine in vitro. Elle consiste à évaluer la liaison du
multimérique plasmatique, d’origine endothéliale VWF plasmatique au récepteur plaquettaire GPIb
ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des pla- en présence de ristocétine. Le test de référence
quettes au sous-endothélium et au collagène en nécessite l’utilisation de plaquettes et de ris-
se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), tocétine. Par ailleurs, il existe trois méthodes de
ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. dosage fonctionnel du VWF répertoriées à la
In vivo, le VWF se lie aux plaquettes après activa- nomenclature internationale qui évaluent égale-
tion par les forces de cisaillement élevées, dans la ment la liaison du VWF plasmatique à la GPIb:
microcirculation, par exemple. En effet, ces der- VWF:Ab, VWF:GPIbR et VWF:GPIbM.
nières induisent un changement conformationnel Indications: dépistage ou exploration de la VWD,
du VWF (étirement) qui expose ses sites de liai- quel que soit son mécanisme (déficit quantitatif
son. In vitro, l’activation du VWF peut nécessiter et/ou qualitatif) ou son étiologie (constitution-
l’utilisation d’agents non physiologiques comme nelle ou acquise).
la ristocétine.
La maladie de Willebrand (VWD pour von Place dans la hiérarchie d’un
Willebrand disease) est la plus fréquente des bilan d’exploration
pathologies hémorragiques constitutionnelles. Une mesure du VWF:RCo (ou l’emploi d’une
Elle résulte d’un défaut héréditaire de la concen- autre méthode évaluant la liaison du VWF à la
tration, de la structure ou de la fonction du VWF. GPIb) est indiquée en première intention pour
Selon la nature quantitative ou qualitative du défi- dépister une VWD. La mesure de cette activité
cit, la classification de la VWD comprend 3 types : est indissociable de la mesure du taux antigénique
• le type 1 déficit quantitatif partiel ; du VWF (VWF:Ag) et de l’activité coagulante
• le type 2 déficit qualitatif ; du facteur FVIII de la coagulation. Elle permet
• le type 3 déficit quasi-total. également le calcul du ratio VWF:RCo/VWF:Ag
orientant vers le type de maladie de Willebrand.
Objectifs de l’analyse et principales Un ratio VWF:RCo/VWF:Ag > 0,6 – 0,7 oriente
indications de prescription a priori vers une VWD de type 1. Un ratio
Objectif : la mesure de l’activité cofacteur ris- VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6 – 0,7 oriente a priori
tocétine (VWF:RCo) constitue l’examen de vers une VWD de type 2 A, 2 B ou 2 M.
possible.
Recommandations pour Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017.
Contraintes Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du
d’acheminement GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du
prélèvement pour la mesure de VWF :RCo. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma
doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température
<– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique - Le VWF:RCo est un test d’agglutination qui nécessite l’utilisation de plaquettes lyophilisées et de
ristocétine.
- Le VWF:Ab est une méthode immunoturbidimétrique utilisant des billes de latex recouvertes d’un
anticorps monoclonal anti-VWF reconnaissant sur le domaine A1 un épitope fonctionnel pour la
liaison à la GPIb. Cette méthode s’affranchit du recours aux plaquettes ou à la ristocétine.
- Le VWF:GPIbR mesure l’interaction du VWF avec un fragment recombinant de GPIb capturé sur
des billes par un anticorps monoclonal. Il existe deux variantes qui diffèrent selon le mode de lecture
par turbidimétrie ou chimiluminescence. Cette méthode s’affranchit de l’utilisation de plaquettes
mais nécessite l’emploi de ristocétine.
- Le VWF:GPIbM mesure l’interaction du VWF avec un fragment recombinant de GPIb muté
(présence de deux mutations « gain de fonction ») permettant une liaison spontanée du VWF à la
GPIb sans ristocétine. La lecture est effectuée par turbidimétrie.
Type de méthode VWF:RCo : agglutination sur lame (méthode manuelle), en agrégométrie (méthode semi-automati-
sée.).
Les autres méthodes VWF:RCo, VWF:Ab, VWF:GPIbR, VWF:GPIbM sont automatisées avec une lecture
par immunoturbidimétrie ou par chimiluminescence.
Type de mesure VWF:RCo : agglutination sur lame, méthode semi-quantitative.
Les autres méthodes VWF:RCo, VWF:Ab, VWF:GPIbR, VWF:GPIbM sont quantitatives.
Valeurs de référence/ Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL) = Taux plasmatique à la nais-
Interprétation et sance > 80 %, large distribution des valeurs normales à l’âge adulte : 50-200 %. Les facteurs
performances modulant le taux de VWF sont : l’âge, la grossesse, le cycle menstruel, le phénoype ABO, le syndrome
inflammatoire, le stress, l’origine ethnique, ainsi que les variations de gènes VWF ou d’autres gènes
régulateurs.
Les méthodes diffèrent par :
- leur sensibilité aux taux bas de VWF. Limite de quantification : VWF:GPIbM (4 UI/dL), VWF:GPIbR
(< 1 % en chimiluminescence et 3,5 % en immunoturbidimétrie), VWF :Ab (6 à 8 %), VWF:RCo sur
lame (2 %), VWF en agrégométrie (10 %), VWF :RCo automatisé (de 3 à 10 % selon l’adaptation) ;
- leur reproductibilité (CV inter-séries) : > 15 % pour le VWF :RCo en agrégométrie ; < 5 % pour
le VWF :GPIbR et VWF:GPIbM ; < 10 % pour le VWF:Ab, de 2 à 15 % pour le VWF:RCo automatisé
selon l’adaptation.
Il faut donc privilégier les méthodes automatisées au test sur lame de reproductibilité médiocre.
Causes d’erreur, limites - Cet examen doit être réalisé à distance d’une grossesse ou d’un syndrome inflammatoire,
conditions associées à une augmentation physiologique des taux de VWF.
- Les résultats doivent être interprétés en fonction du contexte clinique, du groupe sanguin ABO et
des taux de VWF:Ag et FVIII.
- Certains polymorphismes diminuant la liaison de la ristocétine au VWF : risque de faux positif
commun à l’ensemble des tests ristocétine-dépendants.
- Interférence du facteur rhumatoïde pour les méthodes immunoturbidimétriques.

Fiche 7.2
Dosage immunologique du facteur Willebrand (VWF:Ag)
NABM : 1013
Signification biologique du paramètre concentration de la protéine en circulation. Il est

Le facteur Willebrand (VWF) est une glyco- indiqué dans le dépistage ou l’exploration de la
protéine multimérique synthétisée par les cel- maladie de Willebrand (VWD), quel que soit son
lules endothéliales et les mégacaryocytes. Il joue mécanisme (déficit quantitatif. et/ou qualitatif)
un rôle essentiel dans l’hémostase primaire en ou son étiologie (constitutionnelle ou acquise).
assurant l’adhésion des plaquettes au sous-endo-
thélium et l’agrégation des plaquettes entre elles ; Place dans la hiérarchie d’un
par ailleurs, il transporte et stabilise le facteur VIII bilan d’exploration
(FVIII) et détermine ainsi le taux plasmatique de Examen de première intention pour le diagnos-
ce dernier. Des taux diminués de VWF favorisent tic d’une VWD, indissociable de la mesure de
un syndrome hémorragique mais des taux élevés l’activité du VWF et du FVIII, ainsi que du
peuvent être associés à un risque augmenté de calcul des ratios FVIII/VWF:Ag et VWF activité/
thrombose artérielle ou veineuse. Le VWF inter- VWF:Ag. En effet, si la mesure isolée du VWF:Ag
vient aussi dans d’autres processus pathologiques peut permettre de détecter les VWD de type 3
comme l’angiogenèse, la prolifération cellulaire, (si la méthode choisie a une sensibilité aux taux
l’inflammation et l’apoptose. < 1 UI/dL) et la majorité des VWD type 1, un
taux normal n’exclut pas une VWD, en particulier
Objectifs de l’analyse et principales de type 2.
Cet examen consiste à mesurer l’antigène du
facteur Willebrand (VWF:Ag) et reflète ainsi la
Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable
0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est
également possible.
Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommanda-
tions du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conserva-
tion du prélèvement pour la mesure du VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention
du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma
congelé (température <– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique Les différentes méthodes immunologiques varient par la nature de l’anticorps dirigé
contre le VWF et/ou le mode de lecture : immunoenzymatique (ELISA, colorimétrique),
immunofluorimétrique (ELFA, fluorescence), immuno-turbidimétrique (LIA, optique) ou en
immunochimiluminescence (CHIM). Le plasma à tester est mis en contact avec un support
(microcupules pour ELISA et ELFA, billes de latex pour LIA, billes magnétiques pour CHIM)
recouvert d’anticorps anti-VWF polyclonal (LIA, ELISA) ou monoclonal (ELFA, CHIM). La quantité
de VWF fixée est mesurée par turbidimétrie (LIA) ou après ajout d’un conjugué anti-VWF couplé
à la peroxydase (ELISA), à un fluorochrome (ELFA) ou à l’isoluminol (CHIM).
Type de méthode Méthode automatisée (LIA, ELFA ou CHIM) ou manuelle : ELISA.

Valeurs de référence/ Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL). Taux plasmatique à la nais-
Interprétation et performances sance > 80 %, large distribution des valeurs normales à l’âge adulte : 50-200 %. Les facteurs
modulant le taux de VWF sont : l’âge, la grossesse, le cycle menstruel, le phénoype ABO, le
syndrome inflammatoire, le stress, l’origine ethnique et les variations de gènes VWF ou d’autres
gènes régulateurs. La connaissance du contexte clinique est indispensable pour l’interprétation.
Causes d’erreur, limites Les méthodes se distinguent par :
- leur sensibilité aux faibles taux de VWF : CHIM et ELISA < 1 %, ELFA 1-5 %, LIA 4-6 %,
donc par leur capacité à différencier une VWD type 3 d’une VWD type 1 sévère (ELISA et
CHIM) ;
- leur adaptation à une mesure unitaire dans un contexte d’urgence : LIA, ELFA et CHIM ;
- l’interférence du facteur rhumatoïde avec une surestimation possible du taux avec la
méthode LIA.

Fiche 7.3
Temps d’occlusion plaquettaire - Platelet Function
Analyzer (PFA)
Code RIHN E112
Signification biologique du paramètre type TAVI, authentification d’une VWD acquise

Le temps d’occlusion plaquettaire est un test après implantation d’une assistance circulatoire
d’exploration globale de l’hémostase primaire, chez l’insuffisant cardiaque). Sa sensibilité est
simulant le processus d’adhésion et d’agrégation médiocre dans le dépistage des thrombopathies
plaquettaire après lésion vasculaire, dans un sys- modérées et la mesure de l’efficacité biologique
tème reproduisant in vitro les conditions de flux des traitements antiplaquettaires.
de la microcirculation sanguine.
Objectifs de l’analyse et principales d’un bilan d’exploration
indications de prescription Test d’orientation simple et rapide pouvant être
Dépistant l’ensemble des anomalies de l’hémos- réalisé avant des investigations plus approfondies
tase primaire dues à une maladie de Willebrand des pathologies de l’hémostase primaire, tout
(VWD), à un défaut des plaquettes ou à la prise particulièrement dans la maladie de Willebrand
d’inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire, il n’est constitutionnelle ou acquise, mais aussi les throm-
donc pas spécifique d’une pathologie. Il présente bopathies sévères telles que la thrombasthénie de
une excellente sensibilité aux anomalies constitu- Glanzmann ou le syndrome de Bernard-Soulier,
tionnelles du facteur Willebrand (VWF) et a un le monitoring des traitements par desmopres-
intérêt en pathologie acquise du VWF comme sine. Il peut être normal dans les thrombopathies
marqueur de flux (appréciation de la correction modérées et lors des traitements antiagrégants par
des anomalies de flux dans le suivi des implan- aspirine, thienopyridines ou apparentés. Inverse-
tations percutanées de bioprothèse aortique de ment, il peut s’allonger de façon non spécifique.
Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). Prélève-
ment sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué.
Recommandations pour la qualité Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C. L’utilisation
d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de
conservation du prélèvement pour cet examen. L’industriel indique une stabilité du sang
total d’au maximum 4 h à température ambiante. Pas de conservation possible.
Principe méthodologique Test réalisé sur un analyseur (PFA-100® ou INNOVANCE® PFA-200, Siemens) à l’aide
de cartouches intégrées. Le sang citraté est déposé dans le réservoir. L’échantillon est
aspiré à travers un capillaire exposant les plaquettes à une membrane operculée recou-
verte d’agonistes de l’adhésion et de l’agrégation plaquettaire ; le temps de formation du
thrombus plaquettaire au niveau de l’orifice définit le temps d’occlusion (TO). Trois types
de cartouches sont commercialisées : collagène/épinéphrine (Coll/EPI), collagène/ADP
(Coll/ADP) et Innovance PFA P2Y. Le TO maximum mesuré est de 300 sec.
CIQ Non. Il est préconisé de constituer un groupe de donneurs contrôle.

EEQ Non.
Valeurs de référence/Interprétation Résultat exprimé en secondes. Des valeurs de référence établies sur sang citraté 0,129
et performances ou 0,109 M (environ 12 % plus courts) sont proposées par l’industriel, mais il est
recommandé à chaque laboratoire de déterminer son intervalle de référence. Le TO est
influencé par la numération et/ou la fonction des plaquettes, le taux et/ou la fonction du
VWF, et l’hématocrite. Un TO normal permet d’exclure une VWD ou une thrombopathie
sévère.
Causes d’erreur, limites Le résultat doit être interprété au regard de l’hémogramme : les valeurs de référence
sont établies pour des valeurs d’hématocrite supérieures à 35 % et de numération
plaquettaire supérieures à 150 × 109/L. Pour des valeurs d’hématocrite ou de numéra-
tions plaquettaires plus basses, l’allongement des TO peut être au moins partiellement
expliqué par l’anémie ou la thrombopénie. De nombreux médicaments influencent le TO.
L’aspirine peut allonger le TO de la cartouche Coll/EPI ; la desmopressine raccourcit le
TO des cartouches Coll/EPI et Coll/ADP.

Fiche 7.4
Dosage fonctionnel du facteur Willebrand par mesure
de la fixation au collagène (liaison VWF-collagène)
Code RIHN E046
Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et

Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine principales indications
multimérique plasmatique, d’origine endothéliale Une diminution de la liaison du VWF au colla-
ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des pla- gène peut être observée :
quettes au sous-endothélium et au collagène en • en cas de diminution des multimères de haut
se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), poids moléculaire d’origine constitutionnelle
ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. (variants 2A et 2B) ou acquise (gammapathies
La maladie de Willebrand (VWD) est la plus monoclonales, cardiopathies avec anomalies de
fréquente des pathologies hémorragiques consti- flux) ;
tutionnelles. Elle résulte d’un défaut héréditaire • en cas d’anomalies des sites de liaison aux
de la concentration, de la structure ou de la collagènes dans les domaines A1 et A3 du VWF.
fonction du VWF. Selon la nature quantitative ou Une étude de la liaison du VWF au collagène est
qualitative du déficit, la classification de la VWD donc utile au typage de la maladie de Willebrand
comprend 3 types : constitutionnelle et au diagnostic des syndromes
• le type 1 (déficit quantitatif partiel) ; de Willebrand acquis. Elle revêt une importance
• le type 2 (déficit qualitatif) ; particulière pour le diagnostic des variants 2 M
• le type 3 (déficit quasi total). « type collagène » où le VWF:Ag et le VWF:Act
Le type 2 comprend 4 sous-types : 2A, 2B, 2M sont peu ou pas diminués et l’étude du profil
et 2N. multimérique normale.
Il existe également de rares formes acquises de
maladie de Willebrand (ou syndrome de Wille- Place dans la hiérarchie d’un
brand acquis) secondaires le plus souvent à une bilan d’exploration
gammapathie monoclonale ou à une cardiopathie
L’étude de la liaison du VWF au collagène est
à l’origine d’anomalies de flux.
un test de seconde intention permettant le sous-
typage 2M de la VWD.
0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole)
est également possible.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les
recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandation concernant les conditions de conser-
vation du prélèvement pour cet examen. La centrifugation du sang total pour l’obtention
congelé (température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique Méthode ELISA avec lecture colorimétrique à 450 nM. Les échantillons plasmatiques
ajustés en fonction du taux de VWF:Ag sont incubés dans des plaques de microtitration
sensibilisées par du collagène (le plus souvent cheval, type I + III). Après lavage, le VWF
fixé est révélé grâce à un anticorps marqué à la peroxydase. L’intensité du signal coloré est
proportionnelle à la concentration de VWF lié au collagène.
Type de méthode Méthode manuelle ELISA (commerciale ou maison).
EEQ Oui, commerciaux (ECAT).
Valeurs de référence/Interprétation Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL). Les performances
et performances diagnostiques (sensibilité) varient selon les techniques utilisées (type de collagène variable
pour le coating des plaques).
Causes d’erreur, limites du test Certaines techniques peuvent manquer de sensibilité. Le résultat doit de préférence être
confronté à l’étude du profil multimérique.

Fiche 7.5
Agrégation plaquettaire induite par la ristocétine (RIPA)
Code LC E132
Signification biologique du paramètre Objectifs : recherche d’une agrégation para-

Cet examen évalue l’agrégation d’un plasma riche doxale pour de faibles concentrations de ris-
en plaquettes (PRP) en présence de ristocétine. tocétine ≤ 0,7 mg/mL.
La ristocétine est un antibiotique glycopeptidique Indications : diagnostic ou exclusion de la mala-
qui, in vitro, se lie au facteur Willebrand (VWF) die de Willebrand (VWD) de type 2B (hyperaffi-
et à son récepteur la glycoprotéine Ib (GPIb) nité du VWF pour la GPIb) et du pseudo-VWD
plaquettaire, induisant une agrégation Wille- (hyperaffinité de la GPIb pour le VWF).
brand dépendante. Une concentration minimale
de 1 mg/mL de ristocétine est nécessaire pour Place dans la hiérarchie
induire l’agrégation d’un PRP normal. d’un bilan d’exploration
Lors du diagnostic de VWD, le test RIPA doit
Objectifs de l’analyse et principales être réalisé d’emblée lors du prélèvement de
indications de prescription contrôle afin de ne pas méconnaître certaines
Le test RIPA consiste à évaluer la sensibilité du formes de VWD 2B qui peuvent se présenter sans
facteur Willebrand à la GPIb plaquettaire en pré- anomalie des dosages du VWF:Ag, du VWF:RCo
sence de différentes concentrations de ristocétine. et du FVIII, et aussi sans thrombopénie.
Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M ([3,8 %]) permettant
la préparation du PRP. Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole)
contre-indiqué.
Recommandations pour Se référer à la fiche 7.11 « Agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes ».
Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement pos-
sible. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire.
Mode de conservation La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conservation possible.
Principe méthodologique Technique en agrégométrie optique mesurant la variation de transmission lumineuse d’un PRP sou-
mis à une agitation mécanique, à + 37 °C, en présence de différentes concentrations de ristocétine
(fortes concentrations entre 1,2 et 1,5 mg/mL, faibles concentrations entre 0,5-0,6 mg/mL). Il
est judicieux de recourir à des concentrations progressivement décroissantes pour déterminer la
concentration la plus faible induisant une agrégation et optimiser l’interprétation du test. L’amplitude
d’agrégation du PRP en présence de ristocétine dépend de sa concentration en VWF.
Le diagnostic différentiel entre VWD 2B et pseudo-VWD fait appel à des RIPA croisées entre PRP
patient/PPP (plasma pauvre en plaquettes) témoin et PRP témoin/PPP patient.
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage d’agrégation maximale et de vélocité (pente de la courbe).
Interprétation Test peu sensible aux déficits quantitatifs modérés en VWF où la RIPA est souvent normale. RIPA
et performances positive à faible concentration (≤ 0,7 mg/mL) dans la VWD 2B et la pseudo-VWD.
Causes d’erreur, limites Thrombopénie sévère/Macro-plaquettes.
Présence de globules rouges dans le PRP : intensité d’agrégation diminuée, résultats ininterprétables.
Variabilité des lots de ristocétine : nécessité de contrôles internes à chaque laboratoire pour
déterminer la concentration seuil de réponse.
Fiche 7.6
Mesure de la capacité de liaison du facteur Willebrand
au FVIII (VWF:FVIIIB)
Code LC E047

Le variant 2N de la maladie de Willebrand (VWD indications de prescription
Normandie) est caractérisé par une diminution Ce test évalue la fonction du VWF dans la stabi-
de l’affinité du facteur Willebrand pour le fac- lisation et le transport du FVIII. La mesure de ce
teur VIII. Sa transmission est récessive. Son phé- paramètre est cruciale pour différencier la VWD de
notype biologique associe une diminution de type 2N d’une hémophilie A mineure ou modérée
l’activité coagulante du FVIII (FVIII:C) et un (ou avec un statut de conductrice d’hémophilie A)
rapport FVIII:C/VWF:Ag < 0,6. Le diagnostic avec un impact direct sur la prise en charge clinique,
biologique est réalisé grâce à un test mesu- les choix thérapeutiques et le conseil génétique.
rant la capacité de liaison du VWF au FVIII
(VWF:FVIIIB). Un VWF:FVIIIB nul ou très Place dans la hiérarchie d’un
diminué permet de porter le diagnostic de VWD bilan d’exploration
de type 2N. Si le VWF:FVIIIB n’est que modé-
Test de deuxième intention utile pour l’orienta-
rément diminué ou normal, le déficit en FVIII ne
tion du diagnostic et des choix thérapeutiques
pourra pas être attribué à un VWD de type 2N et
chez les patients présentant une discordance
il faudra rechercher une autre étiologie, notam-
FVIII:C/VWF:Ag < 0,6 quel que soit le taux
ment une hémophilie A constitutionnelle (sujet
de VWF:Ag.
hémophile ou femme conductrice) ou acquise.
prélèvement pour la mesure de VWF:FVIIIB. La centrifugation du sang total pour l’obtention
du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé
(température <– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique Méthode ELISA avec lecture colorimétrique à 450 nM. Les échantillons plasmatiques ajustés à 5 %
(technique maison) ou à 10 % (kit commercial) de VWF:Ag sont incubés dans des plaques de microti-
tration sensibilisées avec un anticorps de lapin anti-VWF humain. Après élimination du FVIII endogène,
une quantité constante de FVIIII recombinant (rFVIII) est déposée. Le rFVIII lié est ensuite quantifié grâce
à un anticorps de souris anti-FVIII humain marqué à la peroxydase. L’intensité du signal coloré est
proportionnelle à la concentration de FVIII lié. Le pourcentage de fixation est défini dans la méthode
maison par le rapport des pentes de fixation du plasma testé par rapport à un plasma de référence et
dans la technique commerciale par lecture directe sur la courbe de calibration.
Type de mesure Mesure quantitative mais interprétation qualitative.
Liaison normale (pourcentage de fixation > 80 %) : exclusion VWD 2N.
Liaison nulle ou très diminuée (pourcentage de fixation < 20 %) : VWD 2N.
Liaison modérément diminuée (pourcentage de fixation entre 35 et 65 %) : Hétérozygote 2N.
CIQ Contrôle normal (kit commercial), plasma « hétérozygote » ou 2 N (technique maison).

EEQ Non.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage de fixation.
Interprétation 100 % de sensibilité et de spécificité pour le diagnostic de VWD 2N.
et performances
Causes d’erreur, limites Le test doit être réalisé sur un plasma contenant plus de 5 % (technique maison) et 15 % (kit
commercial) de VWF:Ag. La présence d’anticorps anti-lapin chez certains sujets peut conduire à des
résultats erronés.
Fiche 7.7
Mesure de la capacité de liaison du facteur Willebrand
à la GPIb (liaison VWF-GPIb)
Code RIHN E131

Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine indications de prescription
multimérique plasmatique, d’origine endothéliale Objectifs : cet examen consiste à mesurer la liaison
ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des pla- du VWF à un fragment recombinant de GPIbα en
quettes au sous-endothélium et au collagène en présence de concentrations croissantes de ristocétine.
se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), Il permet ainsi de mettre en évidence une affinité
ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. anormalement élevée du VWF pour la GPIbα.
La maladie de Willebrand (VWD pour von Wille- Indications :
brand disease) est la plus fréquente des pathologies • Diagnostic de la VWD de type 2B.
hémorragiques constitutionnelles. Elle résulte • Diagnostic différentiel entre la VWD de
d’un défaut héréditaire de la concentration, de type 2B et le pseudo-Willebrand plaquettaire,
la structure ou de la fonction du VWF. Selon la thrombopathie due à une mutation « gain de
nature quantitative ou qualitative du déficit, la fonction » sur le gène codant pour la GPIbα.
classification de la VWD comprend 3 types : le
type 1 (déficit quantitatif partiel), le type 2 (déficit Place dans la hiérarchie d’un
qualitatif) et le type 3 (déficit quasi total). bilan d’exploration
La VWD de type 2B résulte de mutations du gène
Le test de liaison VWF-GPIb est un examen de
VWF qui augmentent anormalement l’affinité du
deuxième intention dans l’exploration d’une VWD,
VWF pour la GPIb. Ceci se traduit par une liaison
utile au diagnostic de VWD de type 2B. Il constitue
paradoxale du VWF à la GPIb en présence de faibles
dans cette indication une alternative à la RIPA
concentrations de ristocétine (≤ 0,8 mg/mL).
(agrégation plaquettaire induite par la ristocétine)
qui nécessite d’être réalisé sur un plasma riche en
plaquettes, immédiatement après le prélèvement.
du prélèvement pour la mesure de VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention du
plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé
(température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique Méthode ELISA basée sur l’utilisation d’un fragment recombinant de GPIbα immunofixé auquel
est ajouté l’échantillon à tester (plasma pauvre en plaquettes), pré-incubé avec un immunocon-
jugué anti-VWF et différentes dilutions de ristocétine. La présence d’une liaison paradoxale du
VWF à la GPIb aux faibles concentrations de ristocétine permet de poser le diagnostic de VWD
de type 2B.


CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Performances observées dans une série monocentrique : vrais positifs : 28/31 plasmas 2B
Interprétation et performances testés ; faux négatifs : 3/31 plasmas 2B testés (Caron 2006).
Causes d’erreur, limites Risque de faux négatif pour certains variants 2 B associés à une perte des formes multimériques
les plus fonctionnelles (intérêt de renouveler le test avec le VWF d’un lysat plaquettaire, qui
permet une détection plus sensible de ces variants 2B).
Fiche 7.8
Facteur Willebrand, analyse des multimères
Code RIHN E044
Signification biologique du paramètre ce qui est le cas dans le type 2M. L’électrophorèse

La maladie de Willebrand (VWD pour von Wille- des multimères permet de faire la différence. Une
brand disease) est la maladie hémorragique la plus diminution des HMW (plus ou moins importante
fréquente, due à une anomalie quantitative et/ou en fonction du type d’anomalie génétique) est
qualitative du facteur Von Willebrand (VWF). Le mise en évidence dans les types 2A et le plus
VWF est un peptide multimèrique synthétisé dans souvent dans les types 2B alors que le profil
les cellules endothéliales et les mégacaryocytes : multimérique est normal dans le type 2M. La
formation de dimères dans le réticulum endo- particularité du profil multimérique (renforce-
plasmique puis multimérisation dans l’appareil de ment des fragments de protéolyse, assemblage
Golgi. Les multimères sont ensuite libérés direc- des multimères de plus forte masse entraînant une
tement ou stockés dans les corps de Weibel-Palade trainée [smear] sur l’électrophorèse, etc.) permet
ou les granules alpha-plaquettaires. Lors d’une également de subdiviser les VWD de type 2A en
brèche vasculaire, le VWF permet l’adhésion des 2A (IIA), 2A (IIE).
plaquettes au sous-endothélium grâce à des sites de De plus, cette analyse permet de mettre en évi-
liaison à la GPIb plaquettaire et au collagène. Ce dence la perte des multimères de très haut poids
sont les multimères de plus haut poids moléculaire moléculaire, retrouvée dans le syndrome de Wille-
(HMW) qui portent l’activité biologique du VWF. brand acquis lié aux anomalies de flux.

Les anomalies de liaison du VWF à la GPIb Cette analyse de la répartition des multimères du
plaquettaire peuvent être dues à une diminution VWF est un test de seconde intention permettant
des HMW, ce qui est le cas dans la VWD de le sous-typage de la VWD chez un patient présen-
type 2A et certains types 2B, ou à une diminution tant des FVIII:C, VWF:Ag et VWF:Act diminués
de l’affinité du VWF pour la GPIb plaquettaire, et/ou un ratio VWF:Act/VWF:Ag < 0,7.
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conserva-
tion du prélèvement pour la mesure de VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention
congelé (température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001).
Principe méthodologique Électrophorèse en gel d’agarose-SDS (1,4 à 2 %).
En milieu non réducteur, les différents multimères sont séparés par électrophorèse (environ
18 h) en fonction de leur masse moléculaire puis révélés par un anticorps anti-VWF marqué
à la phosphatase alcaline. La lecture au densitomètre permet de quantifier les différentes
formes : bas PM (≤ 5 mers), PM intermédiaire (6-10 mers), haut PM (> 10 mers), voire très
haut PM (> 15 mers si gel sensible).

Type de méthode Méthode manuelle ou semi-automatisée.

Type de mesure Mesure semi-quantitative.
CIQ Plasma de référence titré en VWF:Ag intégré dans chaque série.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Inter- Le gel d’agarose à 1,42 % permet d’observer toutes les formes multimériques ainsi que la
prétation et performances structure en triplet de l’unité multimérique.
D’autres concentrations de gel 2,3-3 % (haute résolution) ou 0,6-1,2 % (faible résolution)
permettent respectivement de détailler la structure de l’unité multimérique ou de mettre en
évidence des formes supranormales.
Causes d’erreur, limites Technique longue, complexe, limitée à très petit nombre de laboratoires spécialisés, nécessitant
un personnel technique expérimenté.
Fiche 7.9
Propeptide du facteur Willebrand
Code RIHN E130

Le propeptide du facteur Willebrand (VWFpp) indications de prescription
agit comme protéine chaperonne du VWF, glyco- Associé au dosage du VWF antigène (VWF:Ag),
protéine multimérique synthétisée par les cellules celui du VWFpp permet le calcul du rapport
endothéliales et les mégacaryocytes. Après sécré- VWFpp/VWF:Ag dont l’augmentation est pro-
tion dans le plasma, VWF et VWFpp circulent portionnelle au raccourcissement de la demi-vie
indépendamment l’un de l’autre avec des demi- du VWF mature. La mesure de ce paramètre est
vies respectives d’environ 12 h et 2 h. Le VWFpp donc un élément d’appréciation de la synthèse et
est donc le reflet de la synthèse du VWF. En de la clairance du VWF mature dans certains types
association à la mesure du VWF, le VWFpp est de VWD constitutionnelle ou acquise, avec un
utile pour identifier une clairance accélérée du impact direct sur les choix thérapeutiques.
VWF mature dans la maladie de Willebrand,
constitutionnelle (VWD sous-type Vicenza ou Place dans la hiérarchie d’un bilan
1C) ou acquise (syndrome de VWD acquis d’exploration
[AVWS]) associée à une gammapathie mono-
Test de seconde intention utile pour l’orientation
clonale de type IgG. C’est également un biomar-
des choix thérapeutiques chez les patients présen-
queur permettant de distinguer une activation
tant une clairance augmentée du VWF mature,
endothéliale aiguë ou chronique dans diverses
comme les VWD de type 1C (desmopressine
pathologies vasculaires.
inefficace) et les AVWS associés à une IgG mono-
clonale (efficacité démontrée des IgIV).
Mode de conservation Se référer au dosage immunologique du facteur Willebrand (antigène).
Principe méthodologique Méthode ELISA sandwich avec lecture colorimétrique. Seuls les anticorps sont commercialisés.
Le plasma à tester est mis en contact d’une microplaque recouverte d’un anticorps monoclonal
antiVWFpp. Après lavage, un conjugué anti VWFpp couplé à la peroxydase est ajouté. L’intensité
du signal coloré est proportionnelle à la concentration en VWFpp.
CIQ Pas ce CIQ commerciaux.
EEQ Non.
Performances du test Les résultats sont exprimés en UI/dL.
Sensibilité d’un test ELISA, <1 UI/dL.
On considère qu’un rapport VWFpp:VWF supérieur à 4 permet d’identifier les patients VWD de type 1C
(avec clairance augmentée du VWF) mais le seuil définissant un phénotype avec clairance accélérée
reste à définir précisément en pathologie acquise.
Causes d’erreur, limites Le test n’étant pas commercialisé sous la forme d’une trousse prête à l’emploi, il doit faire l’objet d’un
du test développement et d’une validation de méthode par le laboratoire avec la préparation propre de CIQ.
Les sujets de groupe sanguin O ont des taux de VWF:Ag plus bas que les sujets non-O et un rapport
VWFpp/VWF:Ag légèrement plus élevé.

Fiche 7.10
Facteur Willebrand, activité inhibitrice (anti-facteur
Willebrand)
Code RIHN E043

Le syndrome de Willebrand acquis (AVWS) est indications de prescription
une entité rare, d’étiologie multifactotrielle, La recherche d’une activité inhibitrice du VWF,
souvent associée à une pathologie sous-jacente par des tests de neutralisation ou par la détection
(contexte auto-immun, syndrome lymphoproli- d’anticorps anti-VWF, est indiquée pour le diag-
fératif ou myéloprolifératif, anomalies de flux nostic du AVWS (hors anomalies de flux) et pour
sanguin). Dans la plupart des cas, la synthèse la recherche d’une allo-immunisation chez un
du facteur Willebrand (VWF) dans les mégaca- patient atteint de VWD de type 3.
ryocytes et cellules endothéliales, ainsi que sa
Place dans la hiérarchie d’un bilan
sécrétion sont normales. L’antigène (VWF:Ag)
ou l’activité (VWF:Act) du VWF diminué dans d’exploration
le AVWS peut être la conséquence de différents La recherche d’un anticorps anti-VWF ou celle
mécanismes : d’une activité inhibitrice par un test de neutra-
• la présence d’un anticorps spécifique dirigé lisation sont des examens de seconde intention.
contre le VWF ou d’un anticorps non spécifique Ils permettent, en association avec la mesure du
formant des complexes avec le VWF et accélérant taux de propeptide du VWF, de confirmer le
ainsi sa clairance ; caractère acquis du déficit en VWF. Ce diagnostic
• l’adsorption du VWF à la surface des cellules peut être évoqué chez un patient présentant des
malignes ; taux de FVIII, VWF:Ag et VWF:Act diminués
• la perte des multimères de haut poids molé- en association avec un syndrome hémorragique
culaire due à une anomalie de flux ou à une d’apparition récente, sans antécédents familiaux.
protéolyse accrue. Le diagnostic différentiel entre un AVWS et
Par ailleurs, les patients atteints de maladie de une VWD congénitale est indispensable, car il
Willebrand (VWD) de type 3 peuvent potentielle- conditionne la prise en charge thérapeutique. Cet
ment développer des allo-anticorps dirigés contre examen fait par ailleurs partie du bilan de suivi
le VWF, en cas de traitement substitutif. des patients atteints de VWD de type 3 ayant été
exposés à des concentrés de VWF.
Recommandations pour Pas de recommandations spécifiques disponibles ; le même prélèvement étant le plus souvent utilisé
la qualité du prélèvement pour la mesure du facteur Willebrand, suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour cet examen.
Mode de conservation Cf. recommandation pour la qualité du prélèvement.
Principe méthodologique - ELISA (recherche d’anticorps anti-VWF) : VWF plasmatique ou recombinant fixé sur plaque,
incubation avec le plasma du patient et révélation par un anticorps anti-IgG humaine couplé à la
peroxydase.
- Tests de neutralisation : incubation (le plus souvent 2 h) à + 37 °C d’un mélange du plasma à
tester avec un plasma normal, puis mesure de l’activité résiduelle VWF:Act (activité cofacteur de la
ristocétine ou collagène binding) ou VWF:Ag. L’interprétation est faite par analogie avec la méthode
Bethesda.
La définition des seuils de positivité doit être établie pour chaque laboratoire dans son système d’analyse.
Type de méthode Méthode manuelle pour l’ELISA (VWF plasmatique ou recombinant).

Méthode manuelle/automatisée pour les tests de neutralisation selon le mode de révélation.
Type de mesure Mesure qualitative (ELISA) ou semi-quantitative (inhibition).
CIQ Plasma contenant un anti-VWF.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ En l’absence de standardisation, chaque laboratoire établit ses propres performances.
Interprétation
et performances
Causes d’erreur, limites - ELISA avec VWF plasmatique : les recherches positives ne sont pas interprétables chez les
patients de groupe O, du fait de la présence d’anticorps anti-A et anti-B (interférence analytique avec
les antigènes du groupe ABO présents sur le VWF d’origine plasmatique).
- Tests de neutralisation : peu sensibles car ils mettent en évidence uniquement les anticorps de
type neutralisants. Les tests de mélange utilisant le VWF:RCo ne détectent que les anticorps qui
interfèrent avec la liaison à la GPIb. L’association de 2 techniques (VWF:CB et VWF:RCo) permet de
sensibiliser la technique.

Fiche 7.11
Agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes
(PRP)
Code NABM 1011
Signification biologique du paramètre plaquettaire ou thrombopathie, d’origine

Les plaquettes sanguines sont des cellules circu- constitutionnelle ou acquise. Elle est également
lantes anucléées dont la fonction essentielle est indiquée dans certaines formes de maladie de
d’assurer le colmatage des brèches vasculaires et Willebrand (type 2b) qui se manifestent par une
l’arrêt du saignement. Une anomalie quantitative affinité exagérée du facteur Willebrand pour son
ou qualitative des plaquettes expose le patient à récepteur plaquettaire la GPIb, responsable d’une
un risque de saignement. L’étude de l’agrégation agrégation plaquettaire en réponse à de faibles
plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP) doses de ristocétine. L’étude de la réponse aux
permet une étude fonctionnelle des plaquettes agents antiplaquettaires (anti-P2Y12, aspirine),
sanguines in vitro. Cette fiche ne concerne pas bien que non recommandée en routine, peut être
l’utilisation de l’agrégation plaquettaire pour utile dans certaines situations pour dépister une
le diagnostic d’une thrombopénie induite par résistance au traitement ou un défaut d’obser-
l’héparine. vance.

L’agrégation plaquettaire est la conséquence de L’exploration plaquettaire n’est qu’exception-
l’activation des plaquettes induite in vitro par nellement réalisée en urgence. Elle s’inscrit le plus
différents agonistes et met en jeu différentes voies souvent dans un contexte d’exploration spéciali-
de signalisation qui varient en fonction du type et sée en bilan de première intention si le contexte
de la dose de l’agoniste utilisé. L’objectif de cet clinique est en faveur d’une thrombopathie ou
examen est de dépister une anomalie de réponse en bilan de deuxième intention devant un syn-
plaquettaire à un ou plusieurs agonistes pour drome hémorragique inexpliqué pour lequel les
confirmer ou non l’existence d’une dysfonction causes les plus fréquentes de saignement ont été
plaquettaire et orienter le diagnostic étiologique. écartées (anomalie de la coagulation et maladie
Elle est indiquée devant un syndrome hémorra- de Willebrand).
gique inexpliqué afin de dépister une dysfonction
Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105, 0,109 M (3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %).
Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué.
Recommandations pour la qualité Le sang doit être prélevé après une période de repos pour atténuer l’effet de l’exercice
du prélèvement physique et à distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une absorption de caféine (2 h).
Le prélèvement à jeun est conseillé, mais reste possible après une collation très légère et
dépourvue de matières grasses.
Le prélèvement doit être effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale dans des
tubes plastiques ou en verre siliconé après avoir éliminé les premiers mL de sang (tube de purge).
Toute prise médicamenteuse doit être identifiée pour éviter les biais d’interprétation des
résultats (en particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, antiplaquettaires, etc.). Selon
l’indication de l’exploration plaquettaire et l’état clinique du patient, les médicaments connus
pour inhiber les fonctions plaquettaires devront avoir été arrêtés 10 jours avant l’exploration.
Le non-respect de ces conditions est acceptable si la recherche porte sur l’identification d’un
défaut très sévère comme une maladie de Glanzmann.
Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus
rapidement possible. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire.
Mode de conservation La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conserva-
tion possible.
Principe méthodologique Le test est réalisé en PRP préparé par centrifugation du sang citraté 10 min à 200 g entre
+ 18 et + 22 °C, sans frein, ou par sédimentation en cas de plaquettes géantes. La numération
plaquettaire du PRP ne doit pas être ajustée par du plasma autologue pauvre en plaquettes
jusqu’à 600 × 109/L. En cas de thrombopénie, les résultats seront interprétés avec prudence.
Le principe du test est basé sur une mesure photométrique de l’éclaircissement du PRP
secondaire au phénomène d’agrégation initié par un agoniste (adénosine diphosphate (ADP),
acide arachidonique, épinéphrine, collagène, peptide d’activation libéré par la thrombine
[TRAP], etc.). Le défaut peut concerner la réponse plaquettaire induite par un seul agoniste
mais, dans la plupart des cas, l’orientation diagnostique devra intégrer et interpréter des
défauts de réponse à plusieurs agonistes en raison de la mise en jeu de voies de signalisation
communes à plusieurs agonistes et de l’existence de voies d’amplification (ADP, Thromboxane
A2 [TXA2]) d’importance variable selon l’agoniste testé.
Type de méthode Méthode essentiellement manuelle. Commercialisation récente d’une méthode automatisée.
Type de mesure Mesure à la fois qualitative et quantitative.
CIQ Pas de CIQ disponible. Les résultats sont interprétés au regard de valeurs de référence éta-
blies par les laboratoires pour le couple réactifs/appareil utilisé.
EEQ Un guide d’interprétation est proposé par l’ECAT en coopération avec NASCOLA (www.ecat.nl).
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage maximal d’agrégation et en vélocité. Pour certains
Interprétation et performances d’agonistes, le temps de latence est également à considérer.
L’agrégation plaquettaire sur PRP relève d’une pratique spécialisée et doit être limitée à des
centres « expérimentés ». À titre indicatif, la reproductibilité intra-série (n = 21) pour les
5 agonistes usuels et pour un couple réactif agoniste défini se situe entre 3,8 et 6,6 %.
Des profils types d’agrégation plaquettaire ont été établis pour les défauts plaquettaires
sévères (maladie de Glanzmann, maladie de Bernard et Soulier, déficit en kindline 3, déficit
en CalDAG-GEFI, déficit en récepteurs d’activation en particulier à l’ADP, au collagène, au
thromboxane A2). La persistance des anomalies dans le temps est un critère important à
prendre en compte.
Causes d’erreur, limites du test Les prélèvements très hémolysés ou lipémiques avec une numération plaquettaire insuffisante
dans le PRP (< 150 × 109G/L excepté si la recherche porte sur des défauts très sévères)
modifient l’interprétation des résultats. Les résultats doivent également être interprétés en
fonction du traitement pris par le patient.

Fiche 7.12
Quantification des glycoprotéines plaquettaires par
cytométrie en flux (GPIb, GPIIbIIIa) et mise en évidence
des marqueurs d’activation
Code RIHN E099
Signification biologique du paramètre sont estimés, après incubation des plaquettes avec
Les plaquettes sanguines sont des cellules circu- de la mépacrine (normalement captée par les
lantes anucléées dont la fonction essentielle est plaquettes et présentant une forte affinité pour
d’assurer le colmatage des brèches vasculaires et l’ATP et l’ADP) et mesure de leur fluorescence à
l’arrêt du saignement. Une anomalie quantitative l’état basal et après stimulation. Ainsi la CMF est
ou qualitative des plaquettes expose à un risque de d’une aide appréciable pour le diagnostic de nom-
saignement. Certaines anomalies qualitatives cor- breuses pathologies plaquettaires dont les déficits
respondent à des déficits en protéines de surface en glycoprotéines de surface (GPIb : maladie de
ou intracellulaires ou à des défauts de signalisation Bernard et Soulier ; GPIIbIIIa : thrombasthénie
dont le diagnostic bénéficie des performances de de Glanzmann ; GPVI : défaut de réponse au
la cytométrie en flux (CMF). collagène) ou granulaires (absence de CD62P :
syndrome des plaquettes grises ; absence de
CD63, test à la mépacrine anormal : déficit en
granules denses) ou un défaut de signalisation
(profils anormaux après stimulation plaquettaire).
La CMF permet l’analyse rapide d’une grande La CMF est également utilisée pour mesurer
quantité de plaquettes dans un petit volume l’état d’activation des plaquettes circulantes dans
de sang total, de plasma riche en plaquettes divers contextes (pathologies cardiovasculaires,
ou de plaquettes lavées. Cette technique, basée infectieuses, auto-immunes, etc.) généralement
généralement sur la reconnaissance d’un épitope au cours d’études cliniques.
spécifique par un anticorps couplé à un fluoro-
chrome, est utilisée pour quantifier la molé- Place dans la hiérarchie d’un
cule d’intérêt, à la surface ou à l’intérieur des bilan d’exploration
plaquettes et peut également renseigner sur les
fonctions plaquettaires. Dans ce cas, la mesure Ces analyses s’inscrivent le plus souvent dans une
s’effectue avant et après stimulation des pla- démarche diagnostique et un contexte d’explo-
quettes et la mise en œuvre d’anticorps dirigés, le ration spécialisée. Elles sont exceptionnelle-
plus souvent, contre des épitopes de conformation ment réalisées en urgence, par exemple dans un
qui n’apparaissent que lorsque la plaquette est contexte hémorragique néonatal avec forte sus-
activée, ou contre des protéines de signalisation picion de maladie de Glanzmann. Elles sont rare-
phosphorylées. L’utilisation d’annexine V permet ment prescrites en première intention, devant un
de mesurer l’exposition des phosphatidylsérines contexte clinique personnel et familial évocateur.
à la surface des plaquettes, marqueur indirect Elles sont généralement réalisées en deuxième
de leur activité procoagulante. L’utilisation de intention chez un patient pour lequel les causes
ligands fluorescents se fixant aux récepteurs acti- les plus fréquentes de saignement (anomalie de
vés est utile pour évaluer l’état d’activation des la coagulation, maladie de Willebrand) ont été
plaquettes. Le contenu des plaquettes en granules éliminées et lorsque les tests d’agrégation plaquet-
denses et leur capacité à sécréter ces granules taire suggèrent une anomalie plaquettaire.
Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). EDTA
possible si la stimulation des plaquettes n’est pas envisagée.
Recommandations pour la Sang prélevé après une période de repos et à distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une
qualité du prélèvement absorption de caféine (2 h). Prélèvement à jeun conseillé mais restant possible après une
collation très légère et dépourvue de matières grasses.
Prélèvement effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale après avoir
éliminé les premiers mL de sang. Identifier toute prise médicamenteuse pour éviter les biais
d’interprétation des résultats (en particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, antiplaquet-
taires, etc.). Selon l’indication de l’exploration plaquettaire et l’état clinique du patient, les
médicaments connus pour inhiber les fonctions plaquettaires doivent être stoppés 10 jours
avant l’exploration.
Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement
possible. Utilisation d’un pneumatique à valider par le laboratoire.
Mode de conservation Test le plus souvent réalisé rapidement après le prélèvement. Des solutions peuvent fixer le
sang (avant et après stimulation) permettant l’envoi à un laboratoire référent.
Principe méthodologique Test réalisé sur sang total ou plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation du
sang 10 min à 200 g à température ambiante, sans frein, ou par sédimentation en cas de
plaquettes géantes. Les plaquettes sont marquées par un ou plusieurs fluorochromes couplés à
des anticorps, à d’autres ligands plaquettaires ou à des molécules captées par les plaquettes,
puis analysées par CMF.
CIQ Contrôle d’alignement du cytomètre. Il n’existe pas d’échantillons sanguins stabilisés pour les
plaquettes.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Les résultats peuvent être exprimés en pourcentage de plaquettes marquées, en moyenne
Performances du test d’intensité de fluorescence ou en nombre de sites à l’aide de kits de quantification utilisant des
billes de calibration. Le laboratoire doit vérifier ses valeurs de référence. Indispensable à de
nombreux diagnostics de pathologies plaquettaires.
Causes d’erreur, limites Test qui relève d’une pratique spécialisée et qui doit être limité à des centres expérimentés. La
fiabilité des résultats est dépendante du préanalytique, du type d’échantillon, de la stimulation
appliquée, de l’affinité des anticorps utilisés et de l’expertise de l’expérimentateur. Résultats à
interpréter en fonction de l’anamnèse et du reste de l’exploration biologique.

Fiche 7.13
Temps de lyse (du caillot) des euglobulines
Code NABM 0175
Signification biologique du paramètre est donc de mettre en évidence une activité

Le caillot des euglobulines correspond à la précipi- fibrinolytique élevée, notamment dans le contexte
tation de protéines de la coagulation, notamment le clinique de la coagulation intravasculaire dissémi-
fibrinogène, le plasminogène, le t-PA et l’u-PA. La née (CIVD). Cet examen est indiqué devant tout
précipitation des protéines à pH acide (pH = 5,9) syndrome hémorragique dans lequel un excès de
élimine, au moins en partie, les inhibiteurs de fibrinolyse est évoqué. Il n’est pas indiqué dans
la fibrinolyse (α 2 anti-plasmine, PAI, etc.) que la surveillance des traitements fibrinolytiques. Il
l’on retrouve dans le surnageant. Cette absence n’est pas indiqué, car non sensible, dans la surveil-
d’inhibiteurs dans le caillot permet d’observer lance des traitements inhibiteurs de la fibrinolyse.
un temps de lyse sur une période relativement
courte. Ainsi, le temps de dissolution du caillot Place dans la hiérarchie d’un
de lyse des euglobulines est supérieur à 3 heures, bilan d’exploration
chez un sujet indemne de toute pathologie de la Le temps de lyse des euglobulines est un test
fibrinolyse. La mesure du temps de lyse du caillot simple et peu coûteux qui permet de mettre en
des euglobulines est également appelée « test de évidence les états de fibrinolyse aigus. Le test
Von Kaulla ». conserve un certain intérêt dans la mesure où les
méthodes d’exploration de la fibrinolyse sont peu
Objectifs de l’analyse et principales développées, en dehors des techniques de type
indications de prescription thromboélastogramme. La mesure du temps de
Le temps de lyse des euglobulines peut être consi- lyse des euglobulines est non requise et, en pra-
déré comme un test global de mesure de l’activité tique, inconstamment réalisée, dans le contexte
fibrinolytique d’un plasma. L’objectif de l’analyse d’une exploration de CIVD.
0,129 M [3,8 %]).
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Sang total (transport du prélèvement le plus rapidement possible) ou plasma citraté congelé
selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les
conditions de transport.
Mode de conservation Réalisation immédiate. Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la
conservation du prélèvement.
Principe méthodologique Les protéines plasmatiques d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, dilué en eau dis-
tillée, sont précipitées en présence d’acide acétique glacé (0,016 %, pH 5). Les protéines
précipitées sont dissoutes dans un tampon borate. La solution ainsi obtenue est calcifiée, ce
qui déclenche la formation du caillot. La lyse est alors observée et le temps pour obtenir la
lyse complète du caillot est mesuré.
Différentes variantes de la méthode ont été décrites : obtention du caillot en présence de
kaolin, adaptation de la technique en micropuits, méthode en plaque, ou encore lecture
spectrophotométrique du caillot.

CIQ Pas de CIQ commercialisé. Évaluation en parallèle d’un plasma normal recommandée.
EEQ Pas d’EEQ commercialisé.
Valeurs de référence/Interprétation Les performances de cet examen sont difficiles à appréhender. Le temps de lyse des
et performances euglobulines est dépendant de la concentration en fibrinogène du plasma. Par conséquent,
le test n’est pas adapté en cas d’hypofibrinogénémie. En dehors de cette situation, un
temps de lyse inférieur à 30 min témoigne d’un excès de fibrinolyse et évoque un risque
hémorragique important. Bien que quantitatif (mesure chronométrique), le test est à inter-
préter de façon qualitative.
Causes d’erreur, limites L’observation optique de la lyse est une source d’erreur et de variabilité. Le test n’est pas
adapté en cas d’hypofibrinogénémie.

Fiche 7.14
Dosage du facteur XIII (facteur de stabilisation
de la fibrine)
Code NABM 0173
Signification biologique du paramètre après chirurgie/traumatisme ou à d’autres

Le facteur XIII (FXIII) est la dernière enzyme à manifestations. Exceptionnellement, il existe des
être activée dans la cascade de la coagulation. Il déficits acquis en facteur XIII dont la symptoma-
a comme principal rôle de stabiliser la fibrine. Il tologie hémorragique est variable.
circule dans le plasma sous forme d’un hétéroté- Indications : syndrome hémorragique inexpliqué
tramère de haut poids moléculaire FXIII-A2B2 en particulier retardé, saignements du nouveau-né
inactif, zymogène d’une transglutaminase. La (hémorragie intracérébrale ou du cordon ombi-
sous-unité A, catalytique, est principalement syn- lical et/ou hémorragie prolongée à la chute du
thétisée par la moelle osseuse mais aussi par les cordon ombilical) ou défaut de cicatrisation. Le
histiocytes tissulaires. La sous-unité B, produite dosage est parfois réalisé lors de fausses couches
par le foie, assure le transport et la protection de spontanées à répétition. Enfin, il peut être prescrit
la sous-unité A dans le plasma. Lors de l’activation en suivi chez un patient substitué par des concen-
par la thrombine et le calcium, les sous-unités A trés de facteur XIII.
et B se dissocient et la sous-unité A est clivée en
forme active (A2*). Elle favorise la stabilisation Place dans la hiérarchie d’un bilan
du caillot de fibrine. Le FXIII joue également un d’exploration
rôle dans la cicatrisation des plaies, l’angiogenèse À l’exception des hémorragies intracrâniennes de
et le développement placentaire. Sa demi-vie est l’enfant où le dosage du FXIII est d’emblée indi-
longue (≈ 9 jours). qué, il s’agit d’un examen de seconde intention
dans l’exploration d’un syndrome hémorragique,
Objectifs de l’analyse et principales à effectuer après réalisation des tests d’hémostase
indications de prescription standard, normaux en cas de déficit en FXIII, et
Objectifs : mise en évidence de déficits constitu- après exclusion d’une maladie de Willebrand ou
tionnels ou acquis exposant à un risque hémor- d’une anomalie fonctionnelle plaquettaire. Dans
ragique. Les déficits constitutionnels en FXIII le cas des fausses couches à répétition, ce dosage
sont classés en 3 groupes : déficit en FXIII-A de pourra être réalisé dans le cadre d’un bilan étio-
type I (quantitatif) ou II (qualitatif) et déficit en logique de seconde intention après la recherche
FXIII-B. Le déficit sévère en FXIII (taux < 1 %) de SAPL (syndrome des antiphospholipides). Un
est très rare (1/1 à 2 000 000), de transmis- déficit doit toujours être confirmé sur un second
sion autosomale récessive. Des taux de FXIII prélèvement. Le dosage antigénique est indiqué
> 5-30 % peuvent être associés à des saignements pour typer un déficit constitutionnel.
0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole)
est également possible.
du prélèvement
Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les
Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de
conservation du prélèvement pour la mesure du FXIII. Des données de la littérature
indiquent une conservation du plasma congelé à une température <– 20 °C jusqu’à
3 mois, et ≤– 70 °C jusqu’à 18 mois. La centrifugation du sang total pour l’obtention du
plasma doit se faire dans les 2 h suivant le prélèvement.
Principe méthodologique Une mesure d’activité doit être réalisée en première intention. La technique
fonctionnelle semi-quantitative de solubilité du caillot n’est plus recommandée car
trop peu sensible. Les mesures d’activité font appel à des techniques photométriques
basées sur l’étude de la libération de NH3 par le FXIIIa (mesure à 340 nm via une
réaction dépendante de la consommation de NADH ou de NADPH proportionnelle à
l’activité du FXIII) qui sont facilement automatisables, rapides bien que peu sensibles.
La technique d’incorporation d’amine marquée a une meilleure sensibilité mais est peu
robuste et difficile à mettre en œuvre. Lorsque l’activité est diminuée, la caractérisation
du déficit est complétée par un dosage antigénique : antigène FXIII-A2B2 puis, si
diminué, FXIII-A et FXIII-B. La recherche des anticorps anti-FXIII est mal standardisée et
fait appel à des techniques de type Bethesda ou Nijmegen et des dosages fonctionnels,
après chauffage du plasma à + 58 °C pendant 90 min. L’incubation secondaire doit
être d’au moins 30 min à + 37 °C.
Type de méthode Méthode automatisée. : photométrie, fluorimétrie, immunoturbidimétrie ou manuelle :
ELISA.
CIQ Commerciaux.
EEQ Oui (ECAT www.ecat.nl, UK NEQAS www.ukneqas.org.uk).
Valeurs de référence/Interprétation Taux plasmatique dès la naissance et chez l’adulte > 70 %. Limite de quantification
et performances ≈ 7 % en technique photométrique. La technique d’incorporation d’amine est sensible au
polymorphisme Val34Leu qui augmente les taux mesurés. Les techniques antigéniques
doivent préciser s’il s’agit de dosages du FXIII sous forme tétramérique (FXIII-A2-B2), ou
des sous-unités A ou B.
Causes d’erreur, limites Techniques photométriques : libération non spécifique de NH3 par décomposition de
NAD (P) H indépendante du FXIIIa. Dans ce cas, il y a une possible surestimation pour les
faibles taux (< 20 %), négligeable pour les valeurs normales. La correction de la valeur de
l’activité FXIII s’effectue par la réalisation d’un blanc plasma : blocage complet de l’activité
transglutaminase du FXIIIa par l’iodoacétamide 1 mmol/L.
Interprétation selon le contexte clinique.

Fiche 7.15
Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), activité
(dosage chromogénique et antigénique)
Code RIHN E096
Signification biologique du paramètre des plaquettes grises. À l’opposé, un taux normal

Le PAI-1 est un inhibiteur de la fibrinolyse pré- de PAI-1 dans le sérum exclut un déficit sévère en
sent dans le plasma et les plaquettes sanguines. Le granules alpha.
PAI-1 circulant est, pour 90 %, contenu dans les 3. Apprécier la sévérité du syndrome méta-
granules alpha plaquettaires. Son action principale bolique : les taux plasmatiques de PAI-1 sont
est de s’opposer à la dégradation du caillot de étroitement associés à la présence d’un syndrome
fibrine. Il est possible de quantifier l’activité et métabolique. La quantification de l’activité du
l’antigène du PAI-1. PAI-1 dans le plasma permet d’apprécier l’inten-
sité des dépôts ectopiques de graisse amenant à
faire du PAI-1 un élément de suivi du syndrome
métabolique. Dans ce contexte, le dosage de
PAI-1 activité plasmatique se révèle plus informa-
1. Dépister les patients atteints de déficit sévère tif que le dosage de PAI-1 antigène qui peut être
en PAI-1 : déficit très rare à transmission autoso- faussé par de mauvaises conditions préanalytiques.
mique récessive, plus rarement dominante, res-
ponsable de saignements parfois sévères attribués Place dans la hiérarchie d’un
à une augmentation de la fibrinolyse par défaut bilan d’exploration
d’inhibition. Dans ce contexte le dosage de l’anti-
gène est requis et montrera une absence complète Le dosage de PAI-1 s’inscrit toujours dans un
de PAI-1 dans le plasma dépourvu en plaquettes, bilan de deuxième intention après avoir exclu
dans les plaquettes et dans le sérum. les autres causes de syndrome hémorragique
2. Conforter un diagnostic de déficit en gra- constitutionnel. En diabétologie le dosage de
nules alpha plaquettaires : une réduction impor- PAI-1 activité s’inscrit dans un bilan de sévérité
tante de la concentration du PAI-1 antigène dans du syndrome métabolique en complément des
les secréta plaquettaires ou dans le sérum alors autres critères clinicobiologiques. L’exploration
que sa concentration plasmatique est normale est du PAI-1 nécessite une évaluation de son activité
un élément en faveur du diagnostic du syndrome et/ou de son antigène selon les indications.
Nature du prélèvement Pour le dosage de l’activité du PAI-1, il est recommandé d’utiliser un tube citrate acidifié de façon à
bloquer ex vivo toute interaction entre le PAI-1 et son ligand, le tissue Plasminogen Activator (t-PA). Un
prélèvement sur tube citrate est possible si la chaîne du froid est maintenue.
Le dosage du PAI-1 antigène peut s’effectuer sur plasma ou sur sérum selon les indications. Le
prélèvement du sérum ne requiert pas de conditions particulières. En revanche, le dosage du PAI-1
antigène sur plasma nécessite d’éviter toute contamination par le PAI-1 plaquettaire et donc de prélever
sur tube CTAD pour limiter l’activation plaquettaire. L’utilisation d’un tube citrate (0,105 M, 0,109 M
(3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %)) est cependant possible si les conditions préanalytiques sont respectées.
Recommandations Pour le dosage plasmatique du PAI-1 (activité ou antigène), le sang doit être prélevé après une période
pour la qualité du de repos de 20 min pour atténuer l’effet de l’exercice physique, à jeun, le matin entre 8 h et 10 h, en
prélèvement raison de l’existence d’une variation circadienne du PAI-1. Le dosage devra s’effectuer à distance d’un
épisode thrombotique ou inflammatoire aigu et en dehors de la grossesse. La ponction veineuse doit
être franche et le prélèvement doit s’effectuer avec une stase minimum. Il est conseillé d’ôter le garrot
dès le prélèvement effectué et d’éliminer les premiers mL de sang.
Si un dosage de PAI-1 activité est indiqué il est recommandé de maintenir la chaîne du froid (+ 4 °C)
dès le prélèvement car l’activité du PAI-1 diminue à la chaleur.
La préparation du plasma doit éviter toute contamination par les plaquettes, en particulier si un dosage
du PAI-1 antigène est indiqué. Il est recommandé de centrifuger le tube de sang pendant 30 min à
2 500 g et de recueillir la partie supérieure du plasma pour limiter la contamination par la couche
leucoplaquettaire.
Contraintes Acheminement du tube citraté dans la glace. Pas de contrainte pour le sérum.
d’acheminement
Mode de conservation Congélation à – 20 °C (1 mois maximum), à – 80 °C (plusieurs années).
Principe méthodologique La plupart des méthodes mesurant l’activité PAI-1 sont basées sur le principe général suivant : un
volume d’activateur du plasminogène (t-PA) est incubé à température ambiante avec un volume de
plasma qui contient l’inhibiteur à doser. S’ensuivent une acidification et une dilution pour détruire
l’activité antiplasmine et stopper l’interaction entre le t-PA et le PAI-1. L’activité du t-PA résiduel est
ensuite quantifiée sur du plasminogène apporté en excès. L’activité de la plasmine formée est alors
évaluée sur un substrat spécifique. La lecture s’effectue par comparaison à une gamme de t-PA. Plus la
quantité de plasmine formée est importante, plus la quantité de PAI-1 actif présente dans l’échantillon
de départ est faible. Un essai immunofonctionnel est également disponible. Il consiste à déposer
l’échantillon dans les puits d’une microplaque recouverts de t-PA. Le PAI-1 actif ayant lié le t-PA est
ensuite révélé par un anticorps traceur anti-PAI-1. La lecture s’effectue par comparaison à une gamme
établie à partir d’un plasma lyophilisé titré en PAI-1.
Mesure du PAI-1 antigène par méthode ELISA.
CIQ CIQ industriels.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en ng/mL ou en UI/mL. Un individu sain non obèse en dehors de tout
Performances du test épisode inflammatoire et en l’absence de grossesse présente des taux plasmatiques très faibles de
PAI-1. Ceci explique que la distribution des valeurs normales obtenues dans la population générale ne
soit pas gaussienne.
Il est conseillé à chaque laboratoire de définir ses valeurs normales chez des sujets sains non obèses
en dehors de toute inflammation aiguë et en dehors de la grossesse. Les tests disponibles ont une
bonne répétabilité et reproductibilité.
Causes d’erreur, limites L’interprétation des dosages de PAI-1 antigène plasmatique doit avant tout exclure une contamination
plaquettaire.
Un dosage de PAI-1 dans le sérum doit s’interpréter en fonction du compte plaquettaire.

Fiche 7.16
Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé
contre le facteur VIII ou le facteur IX
Codes NABM 1018 et 1019

Les anticorps anti-facteur VIII (FVIII) ou anti- indications de prescription
facteur IX (FIX), ou inhibiteurs spécifiques des La recherche d’un anti-FVIII ou anti-FIX doit être
FVIII ou FIX, sont le plus souvent des allo-anti- réalisée régulièrement chez l’hémophile substitué,
corps apparaissant chez des patients présentant un a fortiori si le patient présente des signes hémorra-
déficit constitutionnel en FVIII (hémophilie A) giques inhabituels ou persistants malgré une théra-
ou FIX (hémophilie B) et traités par substitution peutique substitutive. Les auto-anticorps doivent
en facteur manquant. Ces allo-anticorps représen- être recherchés lors de syndrome hémorragique
tent la principale complication du traitement de avec déficit acquis sévère en FVIII ou FIX. Si la
l’hémophilie. Il s’agit le plus souvent d’anticorps recherche est positive, l’anticorps devra être titré.
neutralisants qui annulent l’effet hémostatique Ce titrage a un intérêt dans le diagnostic, la prise
des facteurs injectés. Les auto-anticorps, prin- en charge et le suivi du traitement des patients qui
cipalement anti-FVIII, sont peu fréquents, et développent ces anticorps. Le titre n’est cependant
peuvent apparaître au décours d’une pathologie pas prédictif du risque hémorragique.
dysimmunitaire, infectieuse ou néoplasique, au
cours du post-partum, lors de la prise de certains Place dans la hiérarchie d’un bilan
médicaments (antibiotiques, sulfamides, phény- d’exploration
toïne, etc.), ou sans cause apparente.
La recherche d’un anti-FVIII ou anti-FIX est tou-
jours associée à un dosage de FVIII ou FIX. Les
titrages doivent être réalisés dans un laboratoire
ayant une activité en hémostase spécialisée.
possible.
Mode de conservation Cf. recommandations pour la qualité du prélèvement.
Principe méthodologique Principe dérivé de la méthode Bethesda/Nijmegen. Le plasma du malade utilisé pour la recherche ou
le titrage ne doit pas contenir le facteur contre lequel l’inhibiteur recherché est dirigé. Si le taux du
facteur concerné est > à 5 %, le plasma du malade doit être chauffé préalablement à + 58 °C pendant
30 min pour les anti-FVIII ou 90 min pour les anti-FIX. Pour la recherche, le plasma du malade est
mélangé à volume égal avec un plasma témoin (contenant 100 % du facteur déficient chez le malade
et dans un milieu tamponné). L’inhibition du facteur apporté par le plasma témoin dans le mélange est
appréciée par la mesure du facteur résiduel après incubation à + 37 °C pendant 2 h (pour l’anti-FVIII)
ou 10 min à 2 h (pour l’anti-FIX). La recherche est positive si le taux résiduel de facteur dans le
mélange est < 66 %. Dans ce cas, le titre de l’anticorps doit être déterminé et exprimé en unités
Bethesda définies par la quantité d’anticorps contenue dans un 1 mL de plasma neutralisant 50 %
de l’activité d’un plasma normal. Pour le titrage, le taux résiduel de facteur est déterminé dans les
mélanges en utilisant différentes dilutions du plasma du malade en tampon imidazole.
Type de méthode Méthode semi-automatisée.

Type de mesure Mesure qualitative pour la recherche, quantitative pour le titrage.
CIQ CIQ commerciaux disponibles.
EEQ EEQ commerciaux disponibles.
Valeurs de référence/ Résultats du titrage exprimés en unités Bethesda par mL. Seuil de positivité : 0,6 UB/mL. Les
Interprétation performances du test peuvent varier selon les réactifs utilisés. Le choix du plasma témoin est essentiel
et performances pour éviter les variations de pH du mélange « plasma du malade + plasma du témoin » au cours de
l’incubation (milieu tamponné).
Causes d’erreur, limites Manque de standardisation interlaboratoires : préconiser le suivi dans le même laboratoire. Difficultés
d’interprétation pour les anticorps présentant une cinétique d’inactivation inhabituelle.
- Faux positif : présence d’un anticoagulant circulant de type lupique.
- Faux négatif :
1) spécifique d’un facteur de la coagulation non neutralisant et accélérant la clairance plasmatique du
facteur de la coagulation contre lequel il est dirigé. Réaliser dans ce cas une recherche par technique
ELISA ;
2) recherche durant un traitement substitutif ou un traitement procoagulant par un agent bypassant
(facteur VII activé ou concentré de complexe prothrombinique activé).

Fiche 7.17
Recherche et titrage d’un anticorps spécifique
d’un facteur de la coagulation (hors facteurs VIII et IX)
Code RIHN E063
Signification biologique du paramètre en cas de découverte d’un déficit isolé en un

Un anticorps spécifique d’un facteur de la coagu- facteur de la coagulation chez un patient sans
lation est un inhibiteur acquis dirigé contre un antécédent connu et après exclusion des autres
facteur de la coagulation. Ces allo- ou auto- causes de déficit acquis (début d’insuffisance
anticorps peuvent être dirigés contre n’importe hépatique, de coagulation intravasculaire dis-
lequel des facteurs plasmatiques de la coagula- séminée, etc.) ou lorsqu’un patient avec un
tion. Selon leur cible, ils peuvent être associés à déficit constitutionnel en un facteur est traité
des complications hémorragiques d’expression par des transfusions contenant ce facteur. Dans
clinique variable, parfois sévères. Plus rarement, ce cas, la recherche d’anticorps anti-facteur sera
le patient reste asymptomatique et, exception- indiquée si le patient présente des signes hémor-
nellement, il peut présenter un risque thrombo- ragiques inhabituels ou persistants malgré une
tique. Les allo-anticorps apparaissent chez des thérapeutique substitutive. Si la recherche est
patients présentant un déficit constitutionnel positive, l’anticorps sera titré. Ce titrage a un
en un facteur de la coagulation et traités par intérêt dans le diagnostic, la prise en charge et le
des transfusions contenant le facteur manquant. suivi du traitement. Le titre n’est cependant pas
Les auto-anticorps, peu fréquents, peuvent se prédictif du risque hémorragique.
manifester au décours d’une pathologie dys-
immunitaire, infectieuse ou néoplasique, lors de Place dans la hiérarchie d’un
la prise de certains médicaments (antibiotiques, bilan d’exploration
sulfamides, phénytoïne, etc.), ou sans cause La recherche d’un anticorps spécifique d’un fac-
apparente. La plupart de ces anticorps inhibent teur de la coagulation est un examen de deuxième
l’activité coagulante du facteur contre lequel il est intention à réaliser en cas de déficit isolé en un
dirigé, et sont dits « neutralisants ». facteur de la coagulation, après exclusion des
autres causes de déficit et concertation clinico-
Objectifs de l’analyse et principales biologique. Les titrages doivent être réalisés dans
indications de prescription un laboratoire ayant une activité en hémostase
La recherche d’anticorps spécifiques dirigés spécialisée.
contre un facteur de la coagulation est indiquée
du prélèvement
Mode de conservation Cf. recommandations pour la qualité du prélèvement.
Principe méthodologique Principe dérivé de la méthode Bethesda/Nijmegen. Le plasma du malade ne doit pas contenir
le facteur contre lequel l’inhibiteur recherché est dirigé. Chauffer préalablement le plasma
à + 58 °C pendant 30 min (90 min pour les anti-XI) si le taux résiduel du facteur concerné est > à
5 % ou quelle que soit la concentration pour le fibrinogène. Pour la recherche, le plasma
du malade est mélangé à volume égal avec un plasma témoin (contenant 100 % du facteur
déficient chez le malade et dans un milieu tamponné). L’inhibition du facteur apporté par
le plasma témoin dans le mélange est appréciée par la mesure du facteur résiduel après
incubation à + 37 °C 10 min à 2 h. Si la recherche est positive, le titre de l’anticorps doit être
déterminé et exprimé en unité Bethesda définie par la quantité d’anticorps contenue dans
un 1 mL de plasma neutralisant 50 % de l’activité d’un plasma normal. Pour le titrage, le
taux résiduel de facteur est déterminé dans les mélanges en utilisant différentes dilutions du
plasma du malade en tampon imidazole.
Type de méthode Méthode semi-automatisée.
Type de mesure Mesure qualitative pour la recherche, quantitative pour le titrage.
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Le seuil de positivité peut varier selon les conditions méthodologiques. Il est conseillé de
Interprétation et performances tester en parallèle au moins un plasma frais congelé sans déficit sévère en facteur.
Causes d’erreur, limites 1) Manque de standardisation interlaboratoires : préconiser le suivi dans le même laboratoire.
2) Difficultés d’interprétation pour les anticorps présentant une cinétique d’inactivation
inhabituelle.
3) Faux positif : présence d’un anticoagulant circulant de type lupique. Faux négatif : anticorps
spécifique d’un facteur de la coagulation non neutralisant et accélérant la clairance plas-
matique du facteur de la coagulation contre lequel il est dirigé (recherche par technique
ELISA) ou recherche durant un traitement substitutif ou un traitement procoagulant par un
agent bypassant (FVIIa ou concentré de complexe prothrombinique activé).

Bibliographie du chapitre 7 Van Belle E, Rauch A, Vincentelli A, et al. Von Willebrand

factor as a biological sensor of blood flow to monitor
FICHE 7.1 – Dosage fonctionnel du facteur
percutaneous aortic valve interventions. Circ Res
Willebrand par mesure de l’activité cofacteur
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Willebrand (VWF :Ag) of von Willebrands disease (VWD) subtypes : direct
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facteur Willebrand à la GPIb (liaison VWF-GPIb) Reports 2017;5:664–70.
Caron C, Hilbert L, Vanhoorelbeke K, et al. Measurement FICHE 7.10 – Facteur Willebrand, activité inhibitrice
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fragment of glycoprotein Ibalpha in an enzyme-linked Coleman R, Favaloro EJ, Soltani S, et al. Acquired
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Chapitre 8
Examens complémentaires pour
l’exploration d’une consommation
de facteurs de la coagulation

Fiche 8.1
Mesure quantitative des D-dimères
Code NABM 10221
Signification biologique du paramètre le seuil décisionnel à l’âge (âgeX10 pour établir

Les D-dimères (DDi) sont des produits de dégra- un seuil diagnostique d’exclusion de l’embolie
dation spécifiques de la fibrine, c’est-à-dire des pulmonaire). D’autre part, la mesure des DDi
produits terminaux de la lyse du caillot. En effet, peut être prescrite dans le diagnostic d’une
le motif DD apparaît lors de l’association de deux coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
domaines D de monomères de fibrine, stabilisés Dans cette situation, la positivité des DDi est
(de façon covalente) par le facteur XIIIa. L’appa- souvent très élevée (CIVD aiguë) et s’intègre
rition de DDi résulte de l’activité protéolytique de dans un tableau biologique complexe, évolutif
la plasmine secondaire à l’activation de la coagu- dans le temps. Des scores cliniques et biolo-
lation. Les DDi s’élèvent de façon physiologique giques sont proposés, notamment par l’ISTH,
avec l’âge et pendant la grossesse. Ils s’élèvent qui incluent la positivité de la mesure des DDi
également dans les périodes post-opératoires et (ou d’analyses de produits de dégradation de la
dans certaines pathologies (inflammation, cancer, fibrine).
etc.).
indications de prescription Dans le contexte de l’exclusion de la MTEV :
La mesure quantitative des DDi est prescrite l’analyse des DDi est utile lorsque la probabilité
dans le diagnostic d’exclusion d’un épisode clinique de MTEV (calculée selon un score de
aigu de maladie thromboembolique veineuse type Wells ou Genève) est faible ou intermédiaire,
(MTEV) en l’absence de traitement anticoa- de façon à éviter le recours à des examens complé-
gulant. Dans cette indication, l’analyse doit mentaires. Dans le contexte de la CIVD, les DDi
garantir une sensibilité et une valeur prédictive sont prescrits en association avec un panel d’ana-
négative élevées, proches de 100 %. Le seuil retenu lyses incluant, au minimum, TQ, fibrinogène et
pour l’exclusion d’une MTEV est généralement de plaquettes. L’interprétation biologique doit inté-
0,5 mg/L (500 ng/mL), jusqu’à l’âge de 50 ans. grer l’ensemble de ces paramètres mais également
Au-delà de 50 ans, il est recommandé d’ajuster leur évolution au cours du temps.
Recommandations Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017.
pour la qualité
du prélèvement
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de la recherche de DDi après le prélèvement doivent respecter les
recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à 24 h à température ambiante
(acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à 24 mois < – 20 °C et 36 mois < – 70 °C.
1. Idem fiche 9.1.

C hapitre 8. Examens complémentaires pour l’exploration d’une consommation de facteurs... 153
Principe méthodologique Les DDi sont dosés par des méthodes immunologiques utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques
du domaine DD. Les méthodes diffèrent en fonction des anticorps et de la méthode de détection
utilisée : enzymatique (ELISA), fluorescence (FIA, ELFA), luminescence (LIA), turbidimétrie. La technique
de référence est la technique ELISA en microplaques. Selon la méthode de calibration, les signaux
mesurés sont convertis en unités D-dimères ou en unités équivalentes fibrinogène (FEU) et exprimés en
mg/L ou ng/mL (1 µg/mL de FEU = 0,5 µg/mL Unités DDi).
Type de méthode Méthode automatisée ou automatisable.
Valeurs de référence/ Seuil de positivité proche de 500 ng/mL pouvant varier en fonction des réactifs. Pour l’exclusion d’une
Interprétation MTEV, les sensibilités et valeurs prédictives négatives doivent être proches de 100 %. Validation du seuil
et performances diagnostique par des études prospectives souhaitables. Dans un contexte de CIVD aiguë, les concen-
trations de DDi peuvent être très élevées. Une quantification n’est pas indispensable au diagnostic mais
elle peut s’avérer utile dans le suivi de la coagulopathie.
Causes d’erreur, limites Les mesures optiques peuvent être influencées par l’hémoglobine, la bilirubine, les lipides. Les
méthodes immunologiques peuvent être influencées par la présence de facteur rhumatoïde ou
d’anticorps hétérophiles. Outre les éléments identifiés dans la maîtrise des risques, il est indis-
pensable d’évaluer les performances de la méthode dans des zones proches des valeurs seuils. Les
renseignements cliniques et thérapeutiques (anticoagulants) sont indispensables à l’interprétation des
résultats, tous les anticoagulants diminuant le taux de D-dimères. Les circonstances physiologiques ou
pathologiques d’élévation des D-dimères doivent être connues du prescripteur.
Fiche 8.2
Détermination semi-quantitative des D-dimères ou des
produits de dégradation de la fibrine (PDF)
Code NABM 1021
Signification biologique du paramètre d’une coagulation intravasculaire disséminée

Les produits de dégradation de la fibrine (PDF) (CIVD), lorsqu’une mesure quantitative des DDi
apparaissent sous l’action de la plasmine, lors du n’est pas disponible. La CIVD est évoquée devant
processus de fibrinolyse. Ces PDF constituent un certains tableaux cliniques, la positivité des DDi
mélange très hétérogène de molécules incluant ou des PDF s’intègre dans un tableau biologique
potentiellement des produits de dégradation complexe, évolutif dans le temps. Des scores cli-
du fibrinogène. Les D-dimères (DDi) sont, au niques et biologiques sont proposés, notamment
contraire, des produits de dégradation spécifiques par l’ISTH, qui incluent la positivité de la mesure
de la fibrine. En effet, le motif DD qui les définit des DDI ou des PDF. Une détermination semi-
est constitué par l’association de deux domaines D quantitative des DDi ou des PDF est suffisante
de monomères de fibrine, stabilisés (de façon pour étayer le diagnostic de CIVD. En revanche,
covalente) par le facteur XIIIa. L’apparition de le suivi évolutif de CIVD sera affiné par une
DDi résulte de l’activité protéolytique de la plas- détermination quantitative des DDi.
mine secondaire à l’activation de la coagulation. Il n’est pas recommandé d’utiliser une
Avec le développement d’anticorps monoclonaux méthode non quantitative de détermination
spécifiques des DDi, les techniques de recherche des D-dimères dans le diagnostic d’exclusion
de PDF sont devenues obsolètes. Par ailleurs, des d’une maladie thromboembolique veineuse.
méthodes quantitatives, automatisées et perfor-
mantes, sont largement disponibles, ce qui limite Place dans la hiérarchie d’un
l’intérêt des méthodes semi-quantitatives et des bilan d’exploration
méthodes manuelles.
Dans un contexte de CIVD, la détermination
semi-quantitative des DDi ou des PDF peut être
prescrite en urgence lorsqu’une mesure quantita-
indications de prescription tive des DDi n’est pas disponible. Cette prescrip-
La détermination semi-quantitative des DDi ou tion s’intègre dans un panel d’analyses incluant,
des PDF peut être utilisée dans le diagnostic au minimum, TQ, fibrinogène et plaquettes.
[3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également pos-
sible.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation des PDF après le prélèvement doivent respecter les
recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à 24 h à température
ambiante (acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à 24 mois < – 20 °C et
36 mois < – 20 °C.

Principe méthodologique Méthodes immunologiques utilisant l’agglutination de billes de latex, recouvertes d’anticorps mono-
clonaux dirigés contre le domaine DD. Ces méthodes sont rapides, unitaires, ne nécessitant aucun
équipement lourd.
Type de méthode Méthodes manuelles ou automatisables.
CIQ CIQ disponibles.
EEQ EEQ disponibles.
Valeurs de référence/ Méthodes peu sensibles, opérateur-dépendantes. Bien que les fiches-produits des industriels
Interprétation indiquent des performances acceptables dans le diagnostic d’exclusion de la MTEV, la détermination
et performances semi-quantitative des PDF/D-Dimères dans ce contexte n’est pas recommandée, dans la mesure où il
existe des méthodes alternatives plus performantes. Dans un contexte de CIVD, la détection de PDF/D-
Dimères peut être retenue dans le calcul d’un score biologique de CIVD.
Causes d’erreur, limites Outre les éléments identifiés dans l’analyse de la maîtrise des risques, les méthodes manuelles et
la lecture optique de l’agglutination sont peu adaptées aux exigences de l’accréditation et doivent
faire l’objet d’études des variations inter-opérateurs. Les renseignements cliniques et thérapeutiques
(anticoagulants) sont indispensables à l’interprétation des résultats. Les circonstances physiologiques
ou pathologiques d’élévation des D-dimères, doivent être connues du prescripteur, ainsi que l’acces-
sibilité aux tests quantitatifs.
Fiche 8.3
Monomères de fibrine : mesure quantitative
sur automate
Code LC E152
Signification biologique du paramètre de fibrine ont été dosés dans de nombreuses

Les monomères de fibrine se forment à partir du situations (pro-) thrombotiques.
fibrinogène, après clivage des fibrinopeptides A et Indications : circonstances cliniques induisant un
B par la thrombine. Ils ont une structure et une état d’activation excessive de la coagulation et leur
masse très proches de celles du fibrinogène. Ils extrême, la coagulation intravasculaire disséminée
ont la propriété de se polymériser pour constituer (CIVD). Monomères de fibrine et D-dimères
un réseau de fibrine. Ils ont aussi la capacité peuvent être quantifiés pour calculer le score de
de se lier au fibrinogène, mais également aux CIVD de l’ISTH. Les indications de prescription
produits de dégradation du fibrinogène et de la sont voisines de celles des D-dimères. Cepen-
fibrine, sous la forme de complexes solubles. Les dant, durant le choc septique, les monomères de
monomères de fibrine sont un reflet de la géné- fibrine, isolés ou intégrés au score de CIVD de
ration de thrombine et de la fibrinoformation. l’ISTH, sont mieux associés au pronostic vital
Ils sont différents des D-dimères qui apparais- que les D-dimères. Les monomères de fibrine
sent après stabilisation du réseau de fibrine par le s’élèvent peu pendant la grossesse et ne s’élèvent
FXIIIa et protéolyse par la plasmine. Bien que de pas lors du vieillissement, ce qui tranche avec le
signification biologique différente, monomères de comportement des D-dimères.
fibrine et D-dimères sont des biomarqueurs de la
génération de thrombine et de la fibrinoformation Place dans la hiérarchie d’un
in vivo. Toutefois, les monomères de fibrine ne bilan d’exploration
dépendent que de la coagulation tandis que les Lors de l’exploration d’un état d’activation de la
D-dimères dépendent de la coagulation et de la coagulation, les monomères de fibrine peuvent,
fibrinolyse/protéolyse plasmine-dépendante. Le selon les circonstances cliniques, mieux indiquer
volume de distribution des monomères de fibrine le pronostic vital que les D-dimères (choc sep-
plasmatiques est proche du volume circulant plastique en particulier). Ce marqueur apparaîtrait
matique, tandis que celui des D-dimères, de alors ici en première intention avant le dosage
masse plus faible, pouvant diffuser, est bien plus des D-dimères. Enfin, dans ces états, lorsque la
large, comprenant aussi le secteur extra-vasculaire. discussion porte sur le rôle de la fibrinolyse sur les
anomalies observées, monomères de fibrine et D-
Objectifs de l’analyse et principales dimères ne sont pas impactés de façon similaire.
Objectif : mettre en évidence un excès de géné-
ration de thrombine in vivo. Les monomères

prélèvement. L’industriel indique une stabilité de 8 h du plasma à température ambiante et de 1 mois
à – 20 °C. Le dosage peut se faire sur plasma congelé à – 70 °C.
Principe méthodologique Les tests non immunologiques identifiant les complexes solubles (gélification par l’éthanol, sulfate de
protamine, test de Largo utilisant une méthode d’agglutination) ne sont plus réalisés. Les monomères
de fibrine sont mis en évidence par des anticorps monoclonaux spécifiques par ELISA ou agglutination
de particules sensibilisées. Ces anticorps doivent être précisément caractérisés.
CIQ CIQ disponibles.
EEQ Pas d’EEQ commercialisé.
Valeurs de référence/ Résultats exprimés en µg/mL. Bonnes performances pour les méthodes automatisées, qui doivent être
Interprétation et appréciées pour les valeurs basses et élevées. Dans un contexte d’indications assez larges allant du
performances dépistage d’un état thrombotique à un diagnostic de CIVD, il faut définir le domaine de mesure de la
technique qui doit être étendu (5 à 150 µg/mL). Le seuil de détection doit être précisé. En l’absence
d’EEQ, cet examen doit être considéré comme en phase d’évaluation.
Causes d’erreur, limites Les méthodes immunoturbidimétriques peuvent entraîner une surestimation en présence de facteur
rhumatoïde et une sous-estimation lors de fortes concentrations.
Bibliographie du chapitre 8 Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for

venous thromboembolism diagnosis: 20 years later.
FICHE 8.1 – Mesure quantitative des D-dimères
J Thromb Haemost 2008;6:1059–71.
Di Nisio M, Squizzato A, Rutjes AW, et al. Diagnostic
Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravascular
accuracy of D-dimer test for exclusion of venous
Coagulation of the ISTH. The scoring system of
thromboembolism: a systematic review. J Thromb
the Scientific and Standardisation Committee on
Haemost 2007;5:296–304.
Disseminated Intravascular Coagulation of the Inter-
Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for
national Society on Thrombosis and Haemostasis: a
venous thromboembolism diagnosis : 20 years later.
5-year overview. J Thromb Haemost 2007;5:604–6.
FICHE 8.3 – Monomères de fibrine : mesure
Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravas-
quantitative sur automate
cular Coagulation of the ISTH. The scoring system
Hamano A, Tanaka S, Takeda Y, et al. A novel monoclonal
of the Scientific and Standardisation Committee
antibody to fibrin monomer and soluble fibrin for the
on Disseminated Intravascular Coagulation of the
detection of soluble fibrin in plasma. Clin Chim Acta
International Society on Thrombosis and Hae-
2002;318:25–32.
mostasis: a 5-year overview. J Thromb Haemost
Wada H, Sakuragawa N. Are fibrin-related markers useful
2007;5:604–6.
for the diagnosis of thrombosis? Semin Thromb
FICHE 8.2 – Détermination semi-quantitative des Haemost 2008;34:33–8.
D-dimères ou des produits de dégradation de la
Grossman KB, Arya R, Peixoto AB, et al. Maternal and
fibrine (PDF)
pregnancy characteristics affect plasma fibrin mono-
mer complexes and D-dimer reference ranges for
venous thromboembolism in pregnancy. Am J Obst
thromboembolism: a systematic review. J Thromb
Gynecol 2016;215:466e1–8e.
Haemost 2007;5:296–304.
Chapitre 9
Diagnostic d’exclusion de maladie
thromboembolique veineuse

Fiche 9.1
Mesure quantitative des D-dimères
Code NABM 10221
Signification biologique du paramètre seuil décisionnel à l’âge (âge × 10) pour établir

Les D-dimères (DDi) sont des produits de dégra- un seuil diagnostique d’exclusion de l’embolie
dation spécifiques de la fibrine, c’est-à-dire des pulmonaire. D’autre part, la mesure des DDi
produits terminaux de la lyse du caillot. En effet, peut être prescrite dans le diagnostic d’une
le motif DD apparaît lors de l’association de deux coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
domaines D de monomères de fibrine, stabilisés Dans cette situation, la positivité des DDi est
(de façon covalente) par le facteur XIIIa. L’appa- souvent très élevée (CIVD aiguë), et s’intègre
rition de DDi résulte de l’activité protéolytique de dans un tableau biologique complexe, évolutif
la plasmine secondaire à l’activation de la coagu- dans le temps. Des scores cliniques et biolo-
lation. Les DDi s’élèvent de façon physiologique giques sont proposés, notamment par l’ISTH,
avec l’âge et pendant la grossesse. Ils s’élèvent qui incluent la positivité de la mesure des DDi
également dans les périodes post-opératoires et (ou d’analyses de produits de dégradation de la
dans certaines pathologies (inflammation, cancer, fibrine).
etc.).
Place dans la hiérarchie d’un bilan
Objectifs de l’analyse et principales d’exploration
indications de prescription Dans le contexte de l’exclusion de la MTEV :
La mesure quantitative des DDi est prescrite l’analyse des DDi est utile lorsque la probabilité
dans le diagnostic d’exclusion d’un épisode clinique de MTEV (calculée selon un score de type
aigu de maladie thromboembolique veineuse Wells ou Genève) est faible ou intermédiaire, de
(MTEV) en l’absence de traitement anticoagu- façon à éviter le recours à des examens complé-
lant. Dans cette indication, l’analyse doit garantir mentaires. Dans le contexte de la CIVD, les DDi
une sensibilité et une valeur prédictive négative sont prescrits en association avec un panel d’ana-
élevées, proches de 100 %. Le seuil retenu pour lyses incluant, au minimum, TQ, fibrinogène et
l’exclusion d’une MTEV est généralement de plaquettes. L’interprétation biologique doit inté-
0,5 mg/L (500 ng/mL) jusqu’à l’âge de 50 ans. grer l’ensemble de ces paramètres mais également
Au-delà de 50 ans, il est recommandé d’ajuster le leur évolution au cours du temps.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de la recherche de DDi après le prélèvement doivent
respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à
24 h à température ambiante (acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à
24 mois < – 20 °C et 36 mois < – 70 °C.
1. Idem fiche 8.1.
Chapitre 9. Diagnostic d’exclusion de maladie thromboembolique veineuse 161
Principe méthodologique Les DDi sont dosés par des méthodes immunologiques utilisant des anticorps monoclonaux
spécifiques du domaine DD. Les méthodes diffèrent en fonction des anticorps et de la méthode
de détection utilisée : enzymatique (ELISA), fluorescence (FIA, ELFA), luminescence (LIA), turbidi-
métrie. La technique de référence est la technique ELISA en microplaques. Selon la méthode de
calibration, les signaux mesurés sont convertis en unités D-dimères ou en unités équivalentes
fibrinogène (FEU) et exprimés en mg/L ou ng/mL (1 µg/mL de FEU = 0,5 µg/mL Unités DDi).
Type de méthode Méthode automatisée ou automatisable.
Valeurs de référence/ Seuil de positivité proche de 500 ng/mL pouvant varier en fonction des réactifs. Pour l’exclusion
Interprétation et performances d’une MTEV, les sensibilités et valeurs prédictives négatives doivent être proches de 100 %.
Validation du seuil diagnostique par des études prospectives souhaitables. Dans un contexte de
CIVD aiguë, les concentrations de DDi peuvent être très élevées. Une quantification n’est pas
indispensable au diagnostic mais elle peut s’avérer utile dans le suivi de la coagulopathie.
Causes d’erreur, limites Les mesures optiques peuvent être influencées par l’hémoglobine, la bilirubine, les lipides. Les
méthodes immunologiques peuvent être influencées par la présence de facteur rhumatoïde
ou d’anticorps hétérophiles. Outre les éléments identifiés dans la maîtrise des risques, il est
indispensable d’évaluer les performances de la méthode dans des zones proches des valeurs
seuils. Les renseignements cliniques et thérapeutiques (anticoagulants) sont indispensables
à l’interprétation des résultats, tous les anticoagulants diminuant le taux de D-dimères. Les
circonstances physiologiques ou pathologiques d’élévation des D-dimères doivent être connues
du prescripteur.
Bibliographie du chapitre 9 Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravascular

Coagulation of the ISTH. The scoring system of
FICHE 9.1 – Mesure quantitative des D-dimères
the Scientific and Standardisation Committee on
Disseminated Intravascular Coagulation of the Inter-
national Society on Thrombosis and Haemostasis : a
thromboembolism : a systematic review. J Thromb
5-year overview. J Thromb Haemost 2007;5:604–6.
Haemost 2007;5:296–304.
Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for
venous thromboembolism diagnosis : 20 years later.
Chapitre 10
Exploration des facteurs
de risque biologiques
de maladie thromboembolique

Synopsis V
Recherche de facteurs biologiques de risque de maladie

thromboembolique veineuse
Figure 10.1. Recherche de facteurs biologiques de risque de maladie thromboembolique veineuse.

*TV site inhabituel : thrombose veineuse profonde du membre supérieur, splanchnique, cérébrale, rétinienne,
pelvienne, etc. (recherche de la mutation V617F de JAK2, CALR, MPL et recherche de clone HPN).
Circonstances déclenchantes majeures (transitoire ou non) : immobilisation plâtrée, fracture d’un membre inférieur,
chirurgie sous anesthésie générale ≥ 30 minutes, alitement aigu > 3 jours dans les 3 mois précédents, cancer actif dans
les deux ans précédents, césarienne.
Circonstances déclenchantes non-majeures : grossesse ou post-partum, contraception œstroprogestative ou traitement
hormonal substitutif de la ménopause dans l’année précédant la MTEV, voyage ≥ 6 heures.
FBR héréditaire : activité AT, PC, PS, F5 Leiden G1691A, F2 G20210A.
FBR acquis : anticoagulant lupique, Ac anticardiolipines, Ac anti-β2GP1.
- FBR : facteurs biologiques de risque
- TV : thrombose veineuse
- TVP : thrombose veineuse profonde

C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 165
Fiche 10.1
Dosage fonctionnel de l’antithrombine par la mesure
de l’activité cofacteur de l’héparine
Code NABM 0189
Signification biologique du paramètre sont en grande majorité quantitatifs (type I), mais

L’antithrombine (AT) est l’inhibiteur physiolo- aussi qualitatifs, conséquences de mutations qui
gique principal des facteurs activés de la cas- affectent l’inhibition des protéases (type IIRS), la
cade de la coagulation (thrombine (IIa), Xa, liaison à l’héparine (type IIHBS), ou la stabilité
IXa et XIa). Elle est synthétisée par le foie, sa de la protéine (type IIPE). Ils sont facteurs de
masse moléculaire est de 58 KDa, sa demi-vie risque d’évènements thromboemboliques veineux
plasmatique d’environ 65 h. Elle a deux sites (risque différent en fonction des mutations impli-
fonctionnels essentiels : le site actif d’inhibition quées). Il existe des mutations à effet fort et
des protéases (RS) et un site de liaison à l’héparine d’autres à effet faible y compris au sein des déficits
(HBS). L’héparine est un catalyseur de la réaction de type IIHBS, longtemps considérés comme
d’inhibition. globalement peu thrombogènes.
Indications : recherche de facteurs génétiques de
risque de thrombose veineuse, exploration d’une
résistance biologique à l’héparinothérapie, suivi
de la réponse aux concentrés d’AT, surveillance
Objectifs : mise en évidence de déficits exposant à d’un traitement à l’asparaginase.
un risque de maladie thromboembolique veineuse
(MTEV). Les déficits acquis peuvent être liés à une Place dans la hiérarchie d’un
diminution de synthèse (insuffisance hépatocellu- bilan d’exploration
laire), une consommation (thromboses étendues
et CIVD), une perte de la protéine non compen- La mesure de l’activité cofacteur de l’héparine est
sée (syndrome néphrotique) ou peuvent être la l’examen de première intention pour dépister un
conséquence de certains traitements (asparaginase, déficit en AT car elle est sensible à tous les types
héparine non fractionnée à posologies curatives). de déficits. Le typage plasmatique d’une anomalie
Les déficits constitutionnels (prévalence des défi- constitutionnelle comporte de plus la mesure
cits hétérozygotes entre 1/2 000 et 1/5 000 dans de l’activité progressive de l’AT et la mesure de
la population générale et 1 à 2 % chez les sujets l’antigène. Le génotypage est nécessaire dans
atteints de maladie thromboembolique veineuse) certains cas pour déterminer le degré de risque
thromboembolique.
Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube
CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible.
Contraintes d’achemine- Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du
ment GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
prélèvement pour la mesure de l’AT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une
stabilité à température ambiante d’au moins 48 h en sang total et 24 h en plasma citraté, et d’au
moins 2 ans en plasma congelé à température ≤ – 20 °C.
Principe méthodologique Méthode colorimétrique mesurant l’activité amidolytique résiduelle de la thrombine bovine ou du FXa
sur un substrat chromogénique spécifique, en présence d’héparine.

Valeurs de référence/Inter- Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la
prétation et performances naissance 63 % (écart-type : 12), taux de l’adulte atteint vers l’âge de 1 an : 80-120 %. La sensibilité
vis-à-vis de certains variants diffère en fonction des réactifs (Alhenc-Gelas 2009). Une expertise
en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen.
Causes d’erreur, limites Interférence possible avec l’hémolyse, l’ictère et la lactescence.
Ne pas réaliser en présence d’anticoagulants oraux directs (anti-Xa ou anti-IIa) selon la méthode :
risque de surestimation des taux d’AT.
Réalisation de l’examen possible sous héparine ou antivitamine K (AVK).

Fiche 10.2
Dosage immunologique de l’antithrombine
Code NABM 0188
Signification biologique du paramètre sont facteurs de risque d’évènements throm-

L’antithrombine (AT) est l’inhibiteur physiolo- boemboliques veineux (risque différent en fonc-
gique principal des facteurs activés de la cascade tion des mutations impliquées). Il existe des
de la coagulation (thrombine (IIa), Xa, IXa et mutations à effet fort et d’autres à effet faible
XIa). Elle est synthétisée par le foie, sa masse y compris au sein des déficits de type IIHBS,
moléculaire est de 58 KDa, sa demi-vie d’environ longtemps considérés comme globalement peu
65 h. Elle a deux sites fonctionnels essentiels, le thrombogènes.
site actif d’inhibition des protéases (RS) et un site Indication : cet examen qui mesure la concentra-
de liaison à l’héparine (HBS). L’héparine est un tion plasmatique d’antithrombine est indiqué en
catalyseur de la réaction d’inhibition. complément de la mesure de l’activité cofacteur
de l’héparine lorsqu’un déficit constitutionnel
en AT est suspecté. Le typage plasmatique d’une
anomalie constitutionnelle comporte également
la mesure de l’activité progressive de l’AT. Le
Objectif : typage des déficits constitutionnels en génotypage est nécessaire dans certains cas pour
AT. Les déficits constitutionnels (prévalence des déterminer le degré de risque thromboembolique.
déficits hétérozygotes entre 1/2 000 et 1/5 000
dans la population générale et 1 à 2 % chez les Place dans la hiérarchie d’un
sujets atteints de maladie thromboembolique bilan d’exploration
veineuse) sont en grande majorité quantitatifs
(type I), mais aussi qualitatifs, conséquences de Examen à réaliser en deuxième intention, après
mutations qui affectent l’inhibition des protéases le dosage fonctionnel par mesure de l’activité
(type IIRS), la liaison à l’héparine (type IIHBS), cofacteur de l’héparine, dans le cadre du typage
ou la stabilité de la protéine (type IIPE). Ils plasmatique d’un déficit constitutionnel.
prélèvement pour la mesure de l’AT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une
stabilité à température ambiante d’au moins 48 h en sang total et 24 h en plasma citraté, et d’au
moins 2 ans en plasma congelé à température ≤ – 20 °C.
Principe méthodologique Méthode immunologique (turbidimétrie principalement).
Type de méthode Méthode automatisée ou manuelle.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen
Interprétation et à la naissance 63 % (écart-type : 12), taux de l’adulte atteint vers l’âge de 1 an : 80-120 %. Ce test
performances ne détecte pas les déficits qualitatifs. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation
de cet examen.
Causes d’erreur, limites Pour les techniques immunoturbidimétriques :
- possible surestimation en cas de plasma trouble (lipémique) ;
- interférences possibles du facteur rhumatoïde si > 800 UI/mL.

Fiche 10.3
Dosage fonctionnel de la protéine C par méthode
de coagulation
Code NABM 0191
Signification biologique du paramètre acquis sont liés à une diminution de synthèse

La protéine C (PC) est une protéine vitamine K (insuffisance hépatocellulaire), à la production
dépendante qui, après activation par le complexe de facteurs non fonctionnels (hypovitaminose K
thrombine/thrombomoduline et aidée par son et traitements par antivitamine K (AVK)), à une
cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et consommation (thromboses étendues et CIVD)
FVIIIa de la coagulation. Elle est synthétisée par ou à une perte de la protéine non compensée
le foie, sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa (syndrome néphrotique). Il existe de rares cas
demi-vie plasmatique est de 6 à 8 h. d’auto-anticorps anti-protéine C.
Indication : recherche de facteurs génétiques de
risque de thrombose veineuse, exploration d’un
purpura fulminans néonatal, dans de rares cas
surveillance des traitements par concentrés de
Objectifs : mise en évidence de déficits exposant à protéine C.
un risque de maladie thromboembolique veineuse
(MTEV) ou exceptionnellement à un risque de Place dans la hiérarchie
purpura fulminans néonatal (déficit sévère homo- d’un bilan d’exploration
zygote). Les déficits constitutionnels sont rares
(prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 Cet examen, qui permet d’évaluer l’activation de
pour 1 000 dans la population générale et 3 % chez la PC (in vitro, le Protac remplace le complexe
les sujets atteints de MTEV), en grande majorité thrombine/thrombomoduline) et l’activité pro-
quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs, consé- téasique de la PCa, est le seul examen sensible à
quences de mutations qui affectent le site protéa- tous les types de déficits constitutionnels. C’est
sique (IIAM) ou des régions d’interactions avec donc la méthode à utiliser en première intention
ses partenaires PS, FVa, FVIIIa, phospholipides dans le cadre de la recherche d’anomalies géné-
(IIAC). La littérature ne permet pas de donner tiques responsables de thromboses. Le typage
des informations sur les degrés de risque asso- plasmatique d’un déficit constitutionnel comporte
ciés aux différents types de déficits. Une origine de plus le dosage immunologique et la mesure de
acquise du déficit doit toujours être éliminée dans l’activité amidolytique de la PC. Le génotypage
le cadre d’un bilan de thrombophilie. Les déficits est nécessaire au diagnostic dans certains cas.
Contraintes Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations
d’acheminement du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
du prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité de la PC d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins
2 ans en plasma congelé à une température ≤ – 20 °C (pas de donnée pour le plasma non congelé).
Principe méthodologique Méthode chronométrique mesurant le degré d’allongement d’un test global de coagulation induit par
la PC du plasma du patient après activation par le Protac dans un système comportant du plasma
commercial déplété en PC.
Interprétation et à la naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %.
performances Compte tenu de l’hétérogénéité du phénotype plasmatique chez les sujets porteurs d’un déficit
constitutionnel, un résultat normal ne permet pas d’exclure la présence d’une mutation délétère avec
100 % de certitude. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen.
Causes d’erreur, limites Ne pas réaliser cet examen sous anticoagulants oraux directs ou AVK.
Interférence possible (en fonction des coffrets) avec certains anticoagulants lupiques (risque de
surestimation), des taux de FVIII très élevés, le FV Leiden (risque de sous-estimation), les héparinémies
très élevées.

Fiche 10.4
Dosage fonctionnel de la protéine C par mesure
de l’activité amidolytique
Code NABM 0191
Signification biologique du paramètre ou des régions d’interactions avec ses partenaires

La protéine C (PC) est une protéine vitamine K PS, FVa, FVIIIa, phospholipides (IIAC). La litté-
dépendante qui, après activation par le complexe rature ne permet pas de donner des informations
thrombine/thrombomoduline et aidée par son sur les degrés de risque associés aux différents
cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et types de déficit.
FVIIIa de la coagulation. Elle est synthétisée par Indication : la mesure de l’activité amidolytique
le foie, sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa évalue la fonctionnalité du site protéasique de la
demi-vie plasmatique est de 6 à 8 h. PC. De ce fait, son utilisation en première inten-
tion n’est pas recommandée car elle ne permet pas
de dépister tous les types de déficits qualitatifs. Sa
réalisation fait partie du typage plasmatique des
déficits constitutionnels. Le génotypage est néces-
Objectifs : typage des déficits constitutionnels. saire au diagnostic dans certains cas.
Les déficits constitutionnels en PC sont rares
(prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 Place dans la hiérarchie d’un
pour 1 000 dans la population générale et 3 % bilan d’exploration
chez les sujets atteints de maladie thromboem-
bolique veineuse), en grande majorité quantitatifs Examen, à réaliser en deuxième intention, après le
(type I), mais aussi qualitatifs conséquences de dosage fonctionnel de la PC par test de coagula-
mutations qui affectent le site protéasique (IIAM) tion dans le cadre du typage d’un déficit.
prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
Principe méthodologique Méthode chromogénique : activation de la PC (in vitro, le Protac remplace le complexe thrombine/
thrombomoduline) puis mesure de sa capacité à cliver un substrat chromogène spécifique.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la
Interprétation et naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %. Ce test ne détecte pas
performances les déficits qualitatifs de type IIAC. De plus, compte tenu de l’hétérogénéité du phénotype plasmatique
chez les sujets porteurs d’un déficit constitutionnel quel qu’en soit le type, un résultat normal ne
permet pas d’exclure la présence d’une mutation délétère avec 100 % de certitude. Une expertise en
hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen.
Causes d’erreur, limites Interférence possible avec les plasmas ictériques, hémolysés ou lactescents.
Dépistage du déficit constitutionnel non recommandé sous AVK (difficulté d’interprétation). Pas
d’interférence des traitements anticoagulants.

Fiche 10.5
Dosage immunologique de la protéine C
Code NABM 1027
Signification biologique du paramètre mutations qui affectent le site protéasique (IIAM)

La protéine C (PC) est une protéine vitamine K ou des régions d’interactions avec ses partenaires
dépendante qui, après activation par le complexe PS, FVa, FVIIIa, phospholipides (IIAC). La litté-
thrombine/thrombomoduline et aidée par son rature ne permet pas de donner des informations
cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et sur les degrés de risque associés aux différents
FVIIIa de la coagulation et ainsi inhibe la généra- types de déficits.
tion de thrombine. Elle est synthétisée par le foie, Indication : cet examen, qui mesure la concen-
sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa demi-vie tration plasmatique de la protéine C, est pres-
plasmatique est de 6 à 8 h. crit pour déterminer le caractère quantitatif ou
qualitatif d’un déficit en protéine C. Sa réalisation
fait partie du typage des déficits constitutionnels.
Le génotypage est nécessaire au diagnostic dans
certains cas.
Objectifs : typage des déficits constitutionnels.
Les déficits constitutionnels en PC sont rares Place dans la hiérarchie d’un
(prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 bilan d’exploration
pour 1 000 dans la population générale et 3 %
chez les sujets atteints de maladie thromboem- Examen à réaliser en deuxième intention, après le
bolique veineuse), en grande majorité quantitatifs dosage fonctionnel de la PC par test de coagula-
(type I), mais aussi qualitatifs conséquences de tion dans le cadre du typage d’un déficit.
prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
Principe méthodologique Méthode immunologique type ELISA ou ELFA.
CIQ Au moins deux niveaux. Contrôles commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL).
Interprétation et à la naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %.
performances Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs.
Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen.
Causes d’erreur, limites Pas d’interférence des traitements anticoagulants. Recherche de déficit constitutionnel par dosage
plasmatique non recommandé sous AVK (difficulté d’interprétation).
Fiche 10.6
Dosage fonctionnel de la protéine S
Code NABM 0190
Signification biologique du paramètre acquis sont liés à une diminution de synthèse

La protéine S (PS) est une protéine vitamine K (insuffisance hépatocellulaire), à la production
dépendante qui circule dans le plasma, liée à de facteurs non fonctionnels (hypovitaminose K
la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre et traitements par antivitamine K (AVK)), à une
régule la coagulation par son effet cofacteur de la consommation (thromboses étendues et CIVD),
protéine C activée qui dégrade les FVa et FVIIIa une perte de la protéine non compensée (syn-
et ainsi inhibe la génération de thrombine. Elle drome néphrotique). La protéine S diminue éga-
est synthétisée en partie par le foie, sa demi-vie lement au cours des traitements estrogéniques
plasmatique est de 42 h. par voie orale et précocement au cours de la
grossesse. Il existe de rares cas d’auto-anticorps
anti-protéine S.
Indication : recherche de facteurs génétiques de
risque de thrombose veineuse, exploration d’un
Objectifs : mise en évidence de déficits expo- purpura fulminans néonatal.
sant à un risque de maladie thromboembolique
veineuse (MTEV) ou exceptionnellement à un Place dans la hiérarchie d’un
risque de purpura fulminans néonatal (déficit bilan d’exploration
sévère homozygote). Les déficits constitutionnels
sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes Cet examen qui mesure l’activité cofacteur de
estimée entre 1/1 000 et 1/3 000 dans la la PCa de la PS doit être utilisé en première
population générale et 2 % chez les sujets atteints intention pour dépister un déficit en PS car il est
de MTEV), en grande majorité quantitatifs, mais sensible à tous les types de déficits. Le typage d’un
aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique déficit constitutionnel comporte de plus le dosage
est fonction des mutations sous-jacentes et du immunologique de la PS libre. Le dosage de la PS
taux de protéine S active circulante. Une origine totale n’est pas recommandé car il n’apporte pas
acquise du déficit doit toujours être éliminée dans d’information susceptible d’influencer la prise en
le cadre d’un bilan de thrombophilie. Les déficits charge thérapeutique du patient. Le génotypage
est nécessaire dans certains cas.
CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole) est également possible.
prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une
stabilité d’au moins 1 an en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la
stabilité dans les prélèvements non congelés, que ce soit sur sang total ou sur plasma, n’est rapportée.
Principe méthodologique Méthode chronométrique mesurant le degré d’allongement d’un test global de coagulation induit par
la PS du plasma du patient dans un système comportant du plasma déficient en PS et de la PCa.


Valeurs de référence/ Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris
Interprétation et entre 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins
performances de 50 ans : 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %.
La mesure d’activité est sensible à tous les types de déficits en protéine S. Une expertise en
hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen.
Causes d’erreur, limites Ne pas réaliser cet examen sous anticoagulants oraux directs ni sous AVK.
Interférences possibles (en fonction des coffrets) avec certains anticoagulants lupiques (surestimation),
des taux de FVIII très élevés, le FV Leiden (sous-estimation), les héparinémies très élevées.
Fiche 10.7
Dosage immunologique de la protéine S libre
Code NABM 1025
Signification biologique du paramètre veineuse), en grande majorité quantitatifs, mais

La protéine S (PS) est une protéine vitamine K aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique
dépendante qui circule dans le plasma, liée à est fonction des mutations sous-jacentes et du
la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre taux de protéine S active circulante.
régule la coagulation par son effet cofacteur de la Indication : cet examen qui mesure la concen-
protéine C activée qui dégrade les FVa et FVIIIa tration plasmatique de la forme libre de la PS
et ainsi inhibe la génération de thrombine. Elle est prescrit dans le cadre du typage d’un déficit
est synthétisée en partie par le foie, sa demi-vie constitutionnel en protéine S.
plasmatique est de 42 h. Place dans la hiérarchie d’un
Examen à réaliser en deuxième intention, après
indications de prescription le dosage fonctionnel de la PS dans le cadre du
Objectif : typage des déficits constitutionnels. Les typage d’un déficit constitutionnel. Le dosage de
déficits constitutionnels sont rares (prévalence des la PS totale n’est pas recommandé car il n’apporte
déficits hétérozygotes estimée entre 1/1 000 et pas d’information susceptible d’influencer la prise
1/3 000 dans la population générale et 2 % chez en charge thérapeutique du patient. Le génoty-
les sujets atteints de maladie thromboembolique page est nécessaire dans certains cas.
Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD
(citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible.
prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique
une stabilité d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et au moins 1 an en
plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la stabilité dans les plasmas non
congelés n’est rapportée.
Principe méthodologique Méthode immunologique : ELISA ou immunoturbidimétrie faisant intervenir soit un anticorps spécifique
de la PS libre soit des billes recouvertes de C4bBP, puis un anticorps anti-PS.
Valeurs de référence/ Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris entre
Interprétation et 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins de 50 ans :
performances 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %. Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs.
Possibilité de mauvaise reconnaissance de la protéine si une anomalie moléculaire affecte l’épitope de
la PS reconnu par l’anticorps (NB : les patients ont une activité normale ou subnormale).
Causes d’erreur, limites La présence extrêmement rare d’anticorps anti-souris chez certains sujets peut conduire à des résultats
erronés.
Dépistage du déficit constitutionnel non recommandé chez les patients sous AVK (difficulté d’interprétation).

Fiche 10.8
Dosage immunologique de la protéine S totale
Code NABM 1026
Signification biologique du paramètre veineuse), en grande majorité quantitatifs, mais

La protéine S (PS) est une protéine vitamine K aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique
dépendante qui circule dans le plasma, liée à est fonction des mutations sous-jacentes et du
la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre taux de protéine S active circulante.
régule la coagulation par son effet cofacteur de la Indication : évaluation de la PS totale (fraction libre
protéine C activée vis-à-vis de la dégradation des + liée) dans le cadre du typage d’un déficit constitu-
FVa et FVIIIa. Elle est synthétisée en partie par le tionnel en protéine S. Dans l’état actuel des connais-
foie, sa demi-vie plasmatique est de 42 h. sances, l’activité de la PS est portée par sa fraction
libre dans le plasma et l’évaluation de la PS totale
n’apporte pas d’information susceptible d’influencer
la prise en charge thérapeutique du patient.
Objectif : typage des déficits constitutionnels. Les Place dans la hiérarchie d’un
déficits constitutionnels sont rares (prévalence des bilan d’exploration
déficits hétérozygotes estimée entre 1/1 000 et
1/3 000 dans la population générale et 2 % chez Le dosage systématique de la PS totale n’est pas
les sujets atteints de maladie thromboembolique à recommander.
prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une
stabilité de la PS totale d’au moins 8 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins
1 an en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la stabilité dans les
plasmas non congelés n’est rapportée.
Principe méthodologique Méthode immunologique.
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux.
Valeurs de référence/ Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris
Interprétation et entre 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins de
performances 50 ans : 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %.
Causes d’erreur, limites La présence extrêmement rare d’anticorps anti-souris chez certains sujets peut conduire à des
résultats erronés.
Fiche 10.9
Recherche et identification d’un anticoagulant de type
lupique (ou antiphospholipide par une technique de
coagulation, anciennement « antiprothrombinase »)
Code NABM 1020
Signification biologique du paramètre dans le SAPL. Les patients les plus à risque sont
La détection d’un anticoagulant circulant de ceux avec triple positivité des marqueurs biolo-
type lupique ou lupus anticoagulant (LA) signe giques (LA + , aβ2GPI + , aCL + ). La prescription
la présence d’anticorps antiphospholipides (aPL) d’une recherche de LA devra s’accompagner de
capables d’induire la prolongation de tests de celle d’une recherche d’aCL et d’aβ2GPI.
coagulation in vitro. Il s’agit, avec la recherche
d’anticorps anti-β2 -GPI (aβ2GPI) et anticardioli- Objectifs de l’analyse et principales
pine (aCL) par techniques immunologiques, d’un indications de prescription
des trois critères biologiques du syndrome des Objectifs : mettre en évidence la présence d’anti-
antiphospholipides (SAPL) associant, à la présence corps antiphospholipides capables d’induire la
persistante à au moins 12 semaines d’intervalle d’au prolongation de tests de coagulation in vitro si le
moins un de ses critères biologiques, la survenue contexte clinique le justifie.
de manifestations thrombotiques artérielles et/ou Indications
veineuses, et/ou des complications obstétricales 1. Niveau élevé : évènement veineux throm-
sans qu’il y ait plus de 5 ans entre les manifesta- boembolique (EVTE) inexpliqué (idiopathique)
tions cliniques et la détection des marqueurs bio- ou thrombose artérielle chez un patient jeune
logiques. La présence d’un LA n’est pas spécifique (< 50 ans), thromboses récidivantes, thrombose
du SAPL et peut apparaître au cours d’infections de site inhabituel, pertes fœtales tardives, toute
(présence transitoire le plus souvent), de cancers thrombose ou complication obstétricale chez des
et d’hémopathies lymphoïdes (notamment celles patients avec maladie auto-immune.
s’accompagnant d’un pic monoclonal d’immuno- 2. Niveau moyen : bilan de pathologie auto-
globulines M qui peut avoir une activité LA), immune, fausses couches précoces répétées,
de maladies auto-immunes (autres que le lupus EVTE non idiopathique sujet jeune.
érythémateux systémique fréquemment associé au
SAPL), et de certains traitements (bêtabloquants
notamment). Malgré la prolongation des tests
de coagulation in vitro, la présence d’un LA ne bilan d’exploration
s’accompagne pas d’un risque hémorragique, sauf La recherche d’un LA associée à celle des aCL et
lorsque le LA est associé à une hypo-prothrombi- aβ2GPI est une prescription de première intention
némie sévère due à des anticorps anti-facteur II. du bilan de thrombophilie. La conclusion doit
La présence d’un LA est le marqueur biologique le intégrer le profil aPL complet et signaler la néces-
mieux corrélé au risque de manifestations cliniques sité du contrôle à 12 semaines, en cas de positivité.
Recommandations pour la Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Double centrifugation
qualité du prélèvement indispensable, dans le but d’éliminer le maximum de plaquettes résiduelles du plasma (< 107/mL),
qui apportent des phospholipides et réduisent la sensibilité des tests (faux négatifs). Renseigner
obligatoirement la notion de traitement anticoagulant : héparines, AVK, AOD et effectuer sur tout
échantillon TP, TCA, fibrinogène, éventuellement un temps de thrombine, activité anti-Xa.

du prélèvement pour cet examen. Le plasma doit être congelé à une température < à – 70 °C et
décongelé avant l’analyse au bain-marie, 5 min à + 37 °C.
Principe méthodologique Quatre étapes :
1) recherche d’un allongement d’un test de coagulation de dépistage, temps de venin de vipère
Russell dilué (dRVVT) et/ou temps de céphaline avec activateur (TCA) avec réactif sensible au LA ;
2) mise en évidence de la présence d’un inhibiteur (test sur mélange) avec calcul de l’index
d’anticoagulant circulant ;
3) confirmation de la dépendance en phospholipides (PL) (raccourcissement des tests de dépistage
après ajout de PL) ;
4) exclusion d’une anomalie de la coagulation associée si TCA allongé (diagnostic différentiel :
hémophilie A acquise).
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Variable en fonction de la sensibilité des réactifs.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, limites Ne pas réaliser en présence de traitements anti-Xa ou anti-IIa directs (AOD) ni chez les patients
traités par HNF : risque de faux positifs. Pour les patients sous HBPM, prélever juste avant l’injection
(résiduel). Pour les patients sous AVK avec INR ≥ 1,5, tests réalisés sur mélange avec risque de faux
négatifs par dilution de l’anticorps. Faux négatifs : grossesse, inflammation (facteur VIII élevé).
Faux positifs : inflammation (fibrinogène, CRP élevée).
Fiche 10.10
Recherche des polymorphismes F5 G1691A (facteur V
Leiden) et F2 G20210A du gène la prothrombine
Codes NABM 1029 et 1 030 groupés code NABM 1031
Signification biologique du paramètre s’agit de marqueurs de génétique constitution-

Le polymorphisme Arg506Gln (F5 R506Q) dû à nelle qui doivent être prescrits dans le cadre d’une
la transition G1691A dans le gène du facteur V consultation de thrombophilie et qui nécessitent
(F5) est responsable du FV Leiden. La transition le recueil du consentement éclairé et signé du
F2 G20210A est située en position 3’ non traduite patient. La prescription de ces bilans est encadrée,
du gène de la prothrombine. Le F5 Leiden est à tenant compte notamment de l’âge du patient au
l’origine d’une résistance à la protéine C activée premier évènement thromboembolique, de son
alors que la transition G20210A est associée à sexe et du caractère provoqué ou non de chaque
une augmentation modérée du taux plasmatique épisode (cf. recommandations nationales Pernod
de la prothrombine. La prévalence du F5 Leiden G.).
est de 3 à 5 % en Europe avec un gradient nord/
sud et est associée à une augmentation du risque Place dans la hiérarchie d’un
relatif de maladie thromboembolique de 3 à 8 à bilan d’exploration
l’état hétérozygote et de 80 à l’état homozygote. La recherche de ces deux polymorphismes doit
La prévalence de la transition G20210A est de 2 être réalisée en première ligne du bilan de throm-
à 4 % en Europe avec une augmentation du risque bophilie en complément du dosage de l’activité
relatif de 3 à l’état hétérozygote. de l’antithombine, des protéines C et S et de la
recherche d’anticorps antiphospholipides, en plus
Objectifs de l’analyse et principales de l’hémogramme. La recherche du F5 Leiden doit
indications de prescription se substituer en première intention à la recherche
Ces deux variants sont des facteurs de risque de d’une résistance à la protéine C activée souvent
thrombose veineuse dont la recherche fait partie sensible aux interférences et traitements anticoa-
du bilan de thrombophilie constitutionnelle. Il gulants, sauf cas particuliers (patients greffés).
Nature du prélèvement Sang total EDTA ou tout échantillon permettant une extraction d’ADN génomique.
Nature du prélèvement
Recommandations pour la Aucune.
Contraintes Acheminement du prélèvement dans les 48 h.
d’acheminement
Principe méthodologique Les techniques de génotypage sont nombreuses et commerciales (souvent marquage CE-IVD,
validation de méthode en portée A pour le Cofrac) ou « maison » (validation de méthode selon le
COFRAC en portée B). Il s’agit souvent de techniques de PCR (réaction d’amplification de l’ADN)
couplées à une détection sur gel d’agarose ou sur support solide (microplaque ou billes) avec
une révélation colorée ou fluorescente. Les plus utilisées utilisent le FRET, le reverse Dot-Blot,
l’amplification spécifique d’allèle, la PCR en temps réel de type TaqMan© ou la RFLP. Ces analyses
sont réalisées selon les directives du décret n°2008-321 du 04/04/2008 et de l’arrêté du 27/05/2013
relatifs à « l’examen des caractéristiques génétiques d’une personne à des fins médicales ». Les
biologistes réalisant ces analyses de génétique constitutionnelle sont agréés par l’agence de la
Biomédecine et les locaux dédiés sont autorisés par l’ARS.

Type de méthode Méthode automatisée mais parfois manuelle.

Type de mesure Mesure qualitative : absence ou présence de la mutation à l’état hétérozygote ou homozygote.
CIQ Des contrôles homozygote sain, hétérozygote et homozygote muté doivent être intégrés à chaque
série analytique.
EEQ Oui (RFB-ECAT) (www.ecat.nl).
Valeurs de référence/ Sensibilité et spécificité proche de 100 % pour les deux mutations.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, limites Il s’agit d’un diagnostic de quasi-certitude quant à la présence ou à l’absence de ces mutations.
Les causes d’erreur sont rares et pourraient théoriquement être dues à des polymorphismes de type
SNP présents sous le site des amorces ou des sondes de révélation et empêchant leur fixation, par
exemple le variant C20209T du gène de la prothrombine mais qui est très rare. Chez les greffés de
cellules souches hématopoïétiques, l’ADN ne doit pas être extrait des leucocytes.
Bibliographie du chapitre 10 thromboembolique veineuse : état des connaissances

et conséquence pour la pratique en biologie clinique.
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Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration
FICHE 10.2 – Dosage immunologique de
l’antithrombine biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10.
Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche FICHE 10.6 – Dosage fonctionnel de la protéine S
des facteurs biologiques de risque établis de maladie Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La
thromboembolique veineuse : état des connaissances recherche des facteurs biologiques de risque établis
et conséquence pour la pratique en biologie clinique. de maladie thromboembolique veineuse : état des
Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. connaissances et conséquence pour la pratique en
Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;
paramètres de la coagulation : revue des données 21:12–39.
disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des
Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration paramètres de la coagulation : revue des données
biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5.
Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Hugon-Rodin J, et al. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al.
GFHT study group on Genetic Thrombophilia. GEHT genetic thrombophilia group. PROS1
Thrombotic risk according to SERPINC1 genotype in genotype phenotype relationships in a large cohort of
a large cohort of subjects with antithrombin inherited adults with suspicion of inherited quantitative protein
deficiency. Thromb Haemost 2017;117:1040–51. S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9.
FICHE 10.3 – Dosage fonctionnel de la protéine C Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration
par méthode de coagulation biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10.
Allaart CF, Poort SR, Rosendaal FR, et al. Increased risk of FICHE 10.7 – Dosage immunologique de la
venous thrombosis in carriers of hereditary protein C protéine S libre
deficiency defect. Lancet 1993;341:134–8. Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche
Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie
des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances
thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique.
et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39.
Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des
Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données
paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5.
disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration
Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10.
biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al.
FICHE 10.4 – Dosage fonctionnel de la protéine C GEHT genetic thrombophilia group. PROS1
par mesure de l’activité amidolytique genotype phenotype relationships in a large cohort of
Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche adults with suspicion of inherited quantitative protein
des facteurs biologiques de risque établis de maladie S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9.

FICHE 10.8 – Dosage immunologique de la of the Scientific and Standardisation Committee

protéine S totale of the International Society on Thrombosis and
Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche Haemostasis. J Thromb Haemost 2009;7:
des facteurs biologiques de risque établis de maladie 1737–40.
thromboembolique veineuse : état des connaissances Darnige L. Anticoagulant circulant de type lupique (lupus
et conséquence pour la pratique en biologie clinique. anticoagulant). EMC Biologie médicale 2015;.
Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. 0(0) :1-7 [Article 90-20-0007-A].
Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des FICHE 10.10 – Recherche des polymorphismes
paramètres de la coagulation : revue des données F5 G1691A (facteur V Leiden) et F2 G20210A du
disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. gène la prothrombine
Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, et al. Mutation in
GEHT genetic thrombophilia group. PROS1 blood coagulation factor V associated with resistance
genotype phenotype relationships in a large cohort of to activated protein C. Nature 1994;369:64–7.
adults with suspicion of inherited quantitative protein Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, et al. A common
S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9. genetic variation in the 3’-untranslated region of
Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration the prothrombin gene is associated with elevated
biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. plasma prothrombin levels and an increase in venous
FICHE 10.9 – Recherche et identification thrombosis. Blood 1996;88. 3698-3670.
d’un anticoagulant de type lupique (ou Pernod G, Biron-Andreani C, Morange PE, et al. French
antiphospholipide par une technique group on haemostasis and thrombosis ; French
de coagulation, anciennement Society of vascular medicine. Recommendations on
« antiprothrombinase »)
testing for thrombophilia in venous thromboembolic
Pengo V, Tripodi A, Reber G, et al. Update of the guidelines
disease : a French consensus guideline. J Mal Vasc
for lupus anticoagulant detection. Subcommittee on
2009;34:156–203.
lupus anticoagulant/Antiphospholipid Antibody
Chapitre 11
Suivi biologique des traitements
antithrombotiques

Fiche 11.1
Temps de Quick (INR) en cas de traitement par
antivitamine K
Code NABM 0127
Signification biologique du paramètre biologique par l’INR pour l’adaptation des doses.
Le temps de Quick (TQ) est un temps de coagula- Le résultat du TQ est obligatoirement rendu en
tion, mesuré à + 37 °C, d’un plasma citraté pauvre INR en cas de traitement par AVK.
en plaquettes (PPP), après addition de thrombo- Indications : suivi biologique des traitements par
plastine calcique. C’est un test semi-global de AVK, y compris en cas de surdosage en AVK ou
la coagulation qui permet d’explorer les déficits d’arrêt récent.
en 3 des 4 facteurs Vitamine K-dépendants (fac-
teurs II, VII et X). Il est exprimé en INR (Inter- Place dans la hiérarchie d’un
national Normalized Ratio) chez un patient traité bilan d’exploration
par anti-vitamine K (AVK) pour la surveillance du Le TQ (INR) est le seul test de première inten-
traitement anticoagulant. tion pour la surveillance du traitement par AVK.
Les posologies et les INR doivent être consi-
Objectifs de l’analyse et principales gnées dans un carnet de suivi de traitement par
indications de prescription AVK (ANSM). À l’instauration du traitement,
Objectifs : adaptation des doses et suivi du trai- l’utilisation d’algorithmes posologiques est recom-
tement par AVK. Ce sont des inhibiteurs de la mandée pour atteindre plus rapidement l’INR
vitamine K époxyde réductase impliquée dans le cible. En cas de surdosage asymptomatique, de
cycle de régénération de la forme réduite de la toute situation à risque hémorragique ou d’acci-
vitamine K, indispensable à la maturation post- dents hémorragiques chez des patients traités
traductionnelle hépatique des facteurs II, VII, IX par AVK, des recommandations basées sur les
et X. Ils induisent la synthèse de zymogènes pas ou valeurs de l’INR sont proposées par la HAS. Des
peu fonctionnels appelés protéines induites par les appareils d’automesure de l’INR à partir d’un
AVK ou PIVKA (Protein Induced by Vitamin K), prélèvement capillaire sont remboursés en France
d’où leur effet anticoagulant. Ce sont des dérivés, chez les enfants de moins de 18 ans et chez les
soit coumariniques (acénocoumarol ou warfarine), adultes porteurs de valves mécaniques après éduca-
soit de l’indanedione (fluindione, plus de 80 % tion thérapeutique. Un contrôle des automesures
des prescriptions d’AVK en France). Leurs princi- par un INR au laboratoire d’analyses biomédicales
paux inconvénients sont leur marge thérapeutique doit être réalisé en début de traitement puis tous
étroite, leur large variabilité dose-réponse inter- les 6 mois. Les deux prélèvements doivent être
et intra-individuelle nécessitant une surveillance réalisés dans un délai inférieur à 3 h.
Recommandations pour la Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Renseigner le nom de l’AVK, la
qualité du prélèvement posologie et la date de tout arrêt éventuel du traitement.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de l’INR après le prélèvement doivent respecter les
recommandations pré-analytiques du GFHT 2017.
En sang total et plasma : recommandé à température ambiante jusqu’à 24 h, acceptable jusqu’à
4 h à température réfrigérée ou jusqu’à 2 h entre + 25 °C et + 30 °C.
Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 187
Principe méthodologique Le résultat est exprimé en INR, égal au rapport TQ patient/TQ témoin élevé à la puissance ISI
(index de sensibilité international de la thromboplastine). Les réactifs à ISI proches de 1,0 sont
actuellement recommandés pour améliorer la standardisation de l’INR.
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation, interlaboratoires possible (CIL).
Valeurs de référence/Inter- L’INR chez l’adulte sain non traité est inférieur à 1,2-1,3 selon la nature et le lot de thrombo-
prétation et performances plastine. L’ANSM précise que, à l’exception de certaines situations spécifiques (valvulopathies
et prothèses de valve cardiaque mécaniques notamment), un INR compris entre 2,0 et 3,0 est
recherché chez les patients sous AVK, avec une valeur cible de 2,5. Normes maximales acceptables
(95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité de l’INR (GFHT
2015) : INR < 2 ; CV < 7,2% / INR > 2 ; CV < 8,5%.
Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Le TQ/INR
du test est sensible à des concentrations d’héparine non fractionnée > 1,0 UI/mL et de bas poids molécu-
laire > 1,5 UI anti-Xa/mL. En cas d’hématocrite élevé > 55 %, l’INR est surestimé, un prélèvement
sur tube adapté est nécessaire. L’INR ne permet pas d’évaluer l’effet des anticoagulants oraux
directs (AOD). Des interférences en cas de fibrinogène élevé ou d’anticoagulant lupique fort sont
également observées avec certains réactifs.
Fiche 11.2
Activité anti-Xa des héparines et apparentés : héparine
non fractionnée (HNF), héparines de bas poids
moléculaire (HBPM), fondaparinux, danaparoïde
Code NABM 0186
Signification biologique du paramètre des seuils de surdosage, qui sont propres à chaque
La mesure de l’activité anti-Xa plasmatique permet HBPM (cf. infra). Les adaptations éventuelles de
d’évaluer la concentration des chaînes d’héparine doses n’ont pas été validées lors d’essais cliniques,
(ou apparenté) circulant dans le plasma ayant qui ont été réalisés sans suivi de l’activité anti-Xa.
une activité inhibitrice vis-à-vis du facteur Xa Patients concernés :
(FXa) (apporté comme réactif) en présence • insuffisants rénaux (clairance < 60 mL/min
d’antithrombine (AT). L’activité anti-Xa évalue évaluée par Cockcroft), particulièrement ceux
ainsi spécifiquement l’activité biologique des âgés > 75 ans ;
chaînes d’héparine porteuses du pentasaccharide • poids < 40 kg ou > 120 kg ;
se liant à l’AT et potentialisant son action inhi- • résistance clinique au traitement (par exemple :
bitrice. La cinétique de l’activité anti-Xa des patients cancéreux).
héparines et apparentés dépend notamment de Fréquence du suivi : au début du traitement
leur poids moléculaire moyen et de la proportion (après la 3e injection pour les schémas à 2 injec-
relative des chaînes courtes et longues d’héparine. tions/24 h, deuxième injection pour les schémas
à 1 injection/24 h), puis au bout de quelques
jours (rythme de la surveillance à adapter selon
les résultats, l’évolution de la fonction rénale chez
les patients insuffisants cardiaques ou en réanima-
– Activité anti-Xa de l’héparine non fraction- tion, la durée du traitement). Le suivi de l’activité
née (HNF) (improprement appelée « hépari- anti-Xa des HBPM est inutile dans les autres cas
némie »)/du danaparoïde à dose « curative » du fait de la bonne prédictibilité de leur effet, sauf
Objectifs : le suivi de l’HNF à dose curative est situation particulière.
indispensable du fait de la grande variabilité inter- – Heures de prélèvement : (hors situation parti-
et intra-individuelle de la réponse au traitement. culière : cf. infra).
Après administration d’une dose initiale d’HNF HNF/danaparoïde : →perfusion IV : > 4 h après
(ou danaparoïde) avec ou sans bolus, l’objectif est l’instauration du traitement, ou > 2 h après
d’ajuster les posologies de manière à se situer dans un changement posologique, à n’importe quel
une zone thérapeutique, définie en fonction de moment ; →voie SC : à mi-chemin entre 2 injec-
l’indication, en respectant les délais entre le prélè- tions (6 h après l’injection si schéma à 2 injec-
vement et l’administration lorsque celle-ci est dis- tions/24 h, 4 h après l’injection si schéma à
continue. Les posologies sont augmentées en cas 3 injections/24 h).
de sous-dosage, diminuées en cas de surdosage. HBPM : au pic d’activité, soit 3 à 4 h après
Patients concernés : tous. l’injection pour les schémas à 2 injections/24 h, 4
Fréquence du suivi : au moins quotidienne. à 6 h pour les schémas à 1 injection/24 h.
– Activité anti-Xa des HBPM à dose « curative » Fondaparinux : au pic d’activité, soit 2 à 3 h après
Objectifs : la mesure de l’activité anti-Xa des l’injection.
HBPM/fondaparinux permet de dépister un sur- – Situations particulières : avant un geste invasif à
dosage et/ou une accumulation chez les patients haut risque hémorragique pour s’assurer de l’absence
à risque (cf. infra). Le prélèvement doit être fait d’activité anti-Xa détectable ; lors d’une hémorragie
au pic d’activité pour permettre une interprétation pour s’assurer de l’absence de surdosage.
– À dose préventive, le suivi de l’activité anti-Xa HBPM/fondaparinux : l’activité anti-Xa mesu-

des traitements hépariniques n’a pas d’indication. rée à l’aide calibrations dédiées est le seul test
utilisable pour évaluer les concentrations de ces
Place dans la hiérarchie d’un médicaments, mais n’est pas directement corré-
bilan d’exploration lée à l’activité antithrombotique. Les résumés et
caractéristiques du produit (RCP) indiquent des
HNF : l’intérêt de l’activité anti-Xa par rapport
valeurs moyennes mesurées chez des sujets traités
au TCA pour le suivi de l’HNF est de n’être
par chaque HBPM, qui ne sont pas des zones thé-
influencée ni par les variations des protéines
rapeutiques. Il n’est pas défini à ce jour à partir de
inflammatoires (facteur VIII, fibrinogène, CRP,
quel seuil une diminution de posologie peut être
etc.) ni par des déficits acquis en facteurs.
envisagée ; en revanche, il ne faut pas augmenter la
Zone thérapeutique de l’HNF : 0,3 à 0,7 UI/
posologie si la valeur est inférieure à ces moyennes.
mL (0,3 à 0,6 UI/mL dans les syndromes coro-
nariens aigus).
Spécialité Posologie Activité anti-Xa au pic
m ± ET Seuil de surdosage
Schéma d’HBPM à 2 injections par jour – prélèvement 3-4 h après l’injection
enoxaparine 100 UI/kg/12 h 1,20 ± 0,17 UI/mL ND
dalteparine 100-120 UI/kg/12 h 0,6 ± 0,25 UI/mL 1,0
nadroparine 85 UI/kg/12 h 1,0 ± 0,2 UI/mL ND
Schéma d’HBPM à une injection par jour – prélèvement 4-6 h après l’injection
tinzaparine 175 UI/kg/24 h 0,87 ± 0,15 UI/mL 1,5
nadroparine 171 UI/kg/24 h 1,34 ± 0,15 UI/mL 1,8
fondaparinux (une injection par jour) – prélèvement 2-3 h après l’injection
fondaparinux 7,5 mg/24 h 1,40 ± 0,40 µg/mL ND
Danaparoïde : cf. RCP.
[3,8 %]) ou CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole).
Recommandations pour Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Respecter le délai entre l’heure
la qualité du prélèvement d’injection et celle du prélèvement. Renseigner obligatoirement le médicament, sa posologie par unité
de temps, les heures d’administration et de prélèvement.
Contraintes d’achemi- Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du
nement GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de la mesure de l’anti-Xa après le prélèvement doivent res-
pecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017 :
- en sang total sur tube citraté : jusqu’à 2 heures, à température ambiante ;
- en plasma sur tube citraté : jusqu’à 4 h si centrifugation dans l’heure, plasma décanté ou non,
conservation à température réfrigérée (+ 2 à + 8 °C) ou ambiante ;
- en sang total ou plasma sur tube CTAD : jusqu’à 6 h à température ambiante.
Principe méthodologique Activité anti-Xa amidolytique : méthode de cinétique enzymatique en un ou deux temps, avec
ajout d’un excès connu de FXa (réactif) et de substrat chromogène spécifique du FXa. Le FXa non
inhibé par l’anticoagulant hydrolyse le substrat, libérant de la paranitroaniline de façon inversement
proportionnelle à la concentration de l’anticoagulant. Les résultats sont obtenus à partir d’une droite
de calibration établie à l’aide de plasmas titrés en HNF/HBPM, fondaparinux, ou danaparoïde suivant le
médicament.
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoires possible (CIL).

Valeurs de référence/ Résultats exprimés en UI/mL. Coefficient de variation intralaboratoire de la plupart des méthodes
Interprétation et automatisées < 10 %. La variabilité interlaboratoire est plus élevée (CV > 20 %) liée à l’hétérogénéité
performances des réactifs (présence d’antithrombine ou de sulfate de dextran).
Causes d’erreur, limites Prélèvement réalisé du côté du bras perfusé, contamination par de l’héparine au moment du
prélèvement, concentrations résiduelles d’AOD anti-Xa (y compris < 30 ng/mL), prélèvement ictérique,
hémolysé, déficit sévère en AT avec certaines méthodes. Le sulfate de dextran présent dans certains
réactifs peut entraîner une surestimation de l’activité anti-Xa dans certains contextes notamment après
neutralisation par le sulfate de protamine.
Fiche 11.3
Activité anti-Xa des anticoagulants oraux (hors héparine
ou dérivés) rivaroxaban, apixaban, edoxaban
Signification biologique du paramètre ne doit pas être utilisée en dehors de ces situations
La mesure de l’activité anti-Xa des anticoagulants d’urgence ni pour l’adaptation des doses.
oraux directs (AOD) permet la quantification de
la concentration plasmatique des AOD anti-Xa Place dans la hiérarchie d’un
(xabans) : rivaroxaban, apixaban et edoxaban. bilan d’exploration
Test de première intention dans les situations lis-
Objectifs de l’analyse et principales tées ci-dessus. En cas d’accident hémorragique,
indications de prescription d’acte invasif urgent, d’intention de thrombolyse
La mesure de la concentration des xabans est d’un infarctus cérébral, une prise en charge spé-
réalisée dans certaines situations critiques : accident cifique basée sur la concentration est proposée
hémorragique ou thromboembolique, nécessité (GFHT, GIHP, SFNV). À noter que les xabans
d’un acte invasif urgent, thrombolyse d’un infarctus peuvent interférer avec les tests de coagulation
cérébral, aggravation brutale de la fonction rénale de façon différente selon le xaban et les réactifs
ou hépatique pouvant exposer à un surdosage. Elle de laboratoire.
possible.
du prélèvement pour cet examen. Stabilité en sang total : au moins 4 h, température ambiante.
Stabilité en plasma : au moins 8 h, température ambiante. Congélation à – 20 °C : stabilité au
moins 30 jours.
Principe méthodologique Activité anti-Xa amidolytique : méthode en un ou deux temps, avec ajout d’une quantité connue
de facteur Xa et de substrat spécifique du facteur Xa. Le facteur Xa non inhibé par l’anticoagulant
hydrolyse le substrat. La libération de paranitroaniline est inversement proportionnelle à la concen-
tration de l’anticoagulant. Les résultats exprimés en concentrations dites pondérales (en ng/mL)
sont obtenus à partir d’une droite de calibration établie à l’aide de plasmas titrés surchargés en
rivaroxaban, apixaban ou edoxaban, suivant le médicament pris par le patient. Il n’existe pas d’AOD
anti-Xa universel de référence pour la calibration.
Valeurs de référence/Inter- Le domaine de linéarité est compris entre ∼20 ng/mL et 500 ng/mL.
Causes d’erreur, limites À interpréter selon le contexte clinique. L’interprétation est rendue difficile du fait d’une importante
variabilité inter-individuelle des concentrations attendues. Pour information, les valeurs (5e-
95e percentiles) retrouvées chez les patients traités pour FA sont comprises au pic (2 à 3 h après la
prise) entre 184 et 343 ng/mL (rivaroxaban 20 mg) ; 91 et 321 ng/mL (apixaban 5 mg × 2) ; 120 et
250 ng/mL (edoxaban 60 mg) ; et en résiduel (juste avant la prise suivante, soit 12 h pour apixaban
et 24 h pour rivaroxaban et edoxaban), entre 12 et 137 ng/mL (rivaroxaban 20 mg) ; 41 et 230 ng/
mL (apixaban 5 mg × 2) ; 10 et 40 ng/mL (edoxaban 60 mg). Du fait de la variation des concen-
trations au cours du temps, le résultat doit être interprété en fonction du délai entre la dernière
prise et le prélèvement. L’exposition du patient au médicament est plus fidèlement représentée
par la valeur mesurée en résiduel. Actuellement, il n’existe pas de seuil de surdosage associé à un
risque accru de saignement pour les xabans. Ainsi, une expertise en hémostase est nécessaire pour
l’interprétation des dosages.
Tout autre anticoagulant à activité anti-Xa, notamment lors de relais par les dérivés hépariniques,
peut interférer et faussement majorer la concentration mesurée de xabans. Des trousses de dosage
spécifiques des AOD, sans interférences avec les dérivés hépariniques sont disponibles.
Fiche 11.4
Activité anti-IIa des anticoagulants oraux (hors héparine
ou dérivés) dabigatran
Signification biologique du paramètre surdosage. Elle ne doit pas être utilisée en dehors
La mesure de l’activité anti-IIa permet la quantifi- de ces situations ou pour l’adaptation des doses.
cation plasmatique de la concentration de dabiga-
tran, anticoagulant oral direct. Place dans la hiérarchie d’un
Test de première intention dans les situations lis-
indications de prescription tées ci-dessus. En cas d’accident hémorragique,
La mesure de la concentration du dabigatran d’acte invasif urgent, de thrombolyse d’un infarc-
est réalisée dans certaines situations critiques : tus cérébral, une prise en charge spécifique basée
accident hémorragique ou thromboembolique, sur la concentration et la disponibilité ou non de
nécessité d’un acte invasif urgent, thrombolyse l’antidote, l’idarucizumab, est proposée (GFHT,
d’un infarctus cérébral avec ou sans réversion GIHP, SFNV). À noter que le dabigatran peut
par l’antidote (l’idarucizumab), aggravation bru- interférer avec les tests de coagulation de façon
tale de la fonction rénale pouvant exposer à un différente selon les réactifs de laboratoire.
prélèvement pour cet examen. Stabilité en sang total : au moins 4 h, température ambiante. Stabilité
en plasma : au moins 8 h, température ambiante. Congélation à – 20 °C, stabilité : au moins 30 jours.
Principe méthodologique Méthode de coagulation : temps de thrombine dilué. L’échantillon plasmatique à tester est dilué
avec un pool de plasma. La coagulation est initiée par ajout de thrombine humaine. Le temps de
coagulation est fonction de la concentration de dabigatran dans le plasma à tester.
Activité anti-IIa amidolytique, test à l’écarine : le principe repose sur le clivage de la prothrombine
par l’écarine. Les produits de clivage générés, principalement la meizothrombine, clivent un subs-
trat chromogène libérant de la paranitroaniline. Ce clivage est inhibé par le dabigatran et la quantité
de paranitroaniline mesurée est inversement proportionnelle à la concentration de dabigatran. Les
résultats exprimés en concentrations dites pondérales (en ng/mL) sont obtenus à partir d’une droite
de calibration établie à l’aide de plasmas titrés surchargés en dabigatran.
EEQ Oui.
Performances du test Le domaine de linéarité est compris entre ∼15 ng/mL et ∼500 ng/mL.
Causes d’erreur, limites L’interprétation est rendue difficile du fait d’une importante variabilité inter-individuelle des concen-
du test trations attendues. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation des dosages.
Une concentration supérieure à 200 ng/mL est associée à un risque accru de saignement lorsque la
mesure est effectuée en résiduel chez un patient traité pour fibrillation atriale. Pour information, les
valeurs (25e-75e percentiles) retrouvées chez les patients traités par dabigatran 150 mg × 2 pour
FA, sont comprises entre 117-275 ng/mL au pic et entre 61 et 143 ng/mL en résiduel.
À interpréter selon le contexte clinique.
Tout autre anticoagulant à activité anti-IIa directe peut interférer et faussement majorer la concen-
tration mesurée de dabigatran avec les 2 types de tests.
Seul le « temps de thrombine dilué » est sensible à la présence d’héparine non fractionnée qui peut
majorer la concentration mesurée dabigatran.
Fiche 11.5
Mesure du temps de thrombine
Code RIHN E201
Signification biologique du paramètre Place dans la hiérarchie d’un

Le temps de thrombine (TT), est un test global bilan d’exploration
d’exploration de la fibrinoformation. Le TT ne Chez un patient traité par dabigatran, en situation
figure plus à la nomenclature des actes de biologie d’urgence (accident hémorragique, nécessité d’un
médicale. acte invasif urgent, thrombolyse d’un infarctus
cérébral) et en l’absence de test de dosage spé-
Objectifs de l’analyse et principales cifique, un TT peut être réalisé. Un TT dans les
indications de prescription valeurs de référence (ratio temps du malade/
temps du témoin < 1,20 le plus souvent), corres-
Le TT n’est préconisé ni dans la prise en charge de
pond à une concentration très faible à nulle de
l’évaluation préopératoire du risque hémorragique,
dabigatran. En revanche, le TT est inutilisable
ni pour l’exploration d’une CIVD, ni pour le suivi
pour la quantification du dabigatran. Le TT peut
des traitements hépariniques. Pour les anomalies
aussi s’inscrire dans une démarche préanalytique
rares du fibrinogène, le TT peut être substitué par
d’assurance-qualité du prélèvement d’hémostase
le dosage fonctionnel du fibrinogène (méthode de
pour vérifier l’absence de traces d’héparine ou
Clauss). Le TT est d’une extrême sensibilité au
de dabigatran dans le prélèvement ou lorsque la
dabigatran, inhibiteur direct de la thrombine, mais
nature de l’anticoagulant que reçoit le patient
aussi à la présence d’autres composants naturels ou
n’est pas connue.
chimiques, exerçant une activité anti-IIa, parmi
lesquels l’héparine non fractionnée.
[3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine dipyridamole) est également possible.
du prélèvement pour la mesure du TT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indiquait
une stabilité en plasma frais de 7 jours et en plasma congelé inférieure à 10 mois.
Principe méthodologique Le TT, test chronométrique, est un temps de coagulation à + 37 °C d’un plasma citraté, en présence
de thrombine calcique. La formation du caillot est détectée par des méthodes électromécaniques ou
optiques. Le résultat est exprimé en secondes rapportées au temps d’un plasma témoin.
CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoires possible (CIL).
Valeurs de référence/Inter- En fonction des fournisseurs, les concentrations de thrombine varient. Ainsi, compte tenu de
prétation et performances l’absence de standardisation de ce test, chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de
référence. Au-delà de 120 sec., le TT manque de précision.
Causes d’erreur, limites - L’allongement du TT est peu spécifique et peut survenir dans différents contextes clinico-biolo-
giques : hypofibrinogénémies, dysfribinogénémies, protéines monoclonales, produits de dégradation
du fibrinogène ou de la fibrine (du fait de leur activité antithrombine) au cours de fibrinolyse aiguë
ou de coagulopathie de consommation, patients ayant reçu des solutés de remplissage.
- Le TT est très sensible à la présence de traces d’héparine dans le prélèvement (contamination
ou traitement reçu par le patient).
Fiche 11.6
Thrombopénies induites par l’héparine (TIH) : Recherche
d’anticorps anti-facteur 4 plaquettaire (FP4) par
technique immunologique
Code NABM 1024
Signification biologique du paramètre Un score de probabilité pré-test (score des 4 T’s)

Les traitements par héparine peuvent induire la aide à guider la prescription de ces analyses qui
synthèse d’anticorps dits héparine-dépendants seront réalisées essentiellement en cas de score
généralement dirigés contre le facteur 4 plaquet- intermédiaire ou élevé (≥ 4), mais il manque
taire associé à l’héparine (anti-HFP4) responsables de sensibilité dans certains contextes, comme en
d’une thrombopénie induite par l’héparine (TIH). réanimation ou après chirurgie cardiaque avec
circulation extracorporelle où la persistance de
la thrombopénie postopératoire ou une nouvelle
chute des plaquettes sont les critères les plus
fiables.
La recherche d’anticorps anti-HFP4 ne doit être
prescrite que lors d’une suspicion de TIH repo-
sant sur un faisceau d’arguments : Place dans la hiérarchie d’un
• diminution de 30 à 50 % de la numération bilan d’exploration
plaquettaire sous héparine dans un délai de 5 à Examen de première intention lors d’une suspicion
21 jours après le début du traitement (délai plus de TIH. Compte tenu de son manque de spécifi-
précoce possible si exposition à l’héparine dans les cité, avant de conclure à un diagnostic de TIH,
100 jours antérieurs) ; un test immunologique positif doit être complété
• thrombose veineuse ou artérielle (nouvelle ou par un test fonctionnel pour vérifier le pouvoir
extension d’un processus thrombotique initial), pathogène des anticorps anti-HFP4. Si la suspicion
nécrose cutanée au site d’injection sous-cutané clinique est forte et la recherche d’anticorps anti-
de l’héparine, réaction systémique après injection HFP4 est négative, les tests fonctionnels peuvent
intraveineuse d’héparine. mettre en évidence des anticorps héparine-dépen-
dants dirigés contre une autre cible.
Nature du prélèvement Sang prélevé sur tube sec ou sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]).
Recommandations pour la Pas de recommandations spécifiques.
Contraintes Température ambiante si transport rapide, sinon réfrigéré ou congelé.
d’acheminement
Mode de conservation Pas de recommandations spécifiques du GFHT. Plasma ou sérum réfrigéré pendant 7 jours, congelé au-delà.
Principe méthodologique - Tests ELISA, IgG ou IgG/A/M et cibles antigéniques variables : FP4/héparine - FP4/polyvinylsulfonate
(PVS) - héparine + lysat plaquettaire.
- Test en chimiluminescence (CLIA), IgG ou IgG/A/M, cible FP4/PVS.
- Méthode compétitive d’agglutination de particules de latex (PaGIA®), Ig G/A/M, cible FP4/PVS (test
unitaire).
- Agglutination de particules de latex/filtration sur gel, IgG/A/M, cible FP4/Héparine.
- Immunochromatographie sur membrane (STIC), Ig G, cible Ag FP4/polynanion (test unitaire).
Type de méthode - Méthode compétitive d’agglutination de particules de latex : automate ACLTop®.

- Test en chimiluminescence : automate AcuStar®.
- Agglutination de particules de latex/filtration sur gel : centrifugeuse spécifique.
- Tests ELISA : lecteur spectrophotométrique de microplaque.
Type de mesure Mesure semi-quantitative pour ELISA et chimiluminescence, qualitative pour les autres.
CIQ Fournis dans chaque trousse.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Excellente sensibilité (Ss) au prix d’une moins bonne spécificité (Sp) : ELISA IgG : Ss : 98,3, Sp :
Interprétation et 85,4 %. ELISA IgG/A/M : Ss 96,7 % Sp 86,8 % ; CLIA IgG : Ss : 98,8, Sp 94,6 %. CLIA IgG/A/M : Ss :
performances 98,9, Sp 85,6 % ; PaGIA : Ss 96,5 %, Sp 93,7 %. STIC : Ss 98,4 %, Sp 90,3 %. Dans un contexte de
chirurgie cardiaque, la Sp est médiocre : 30 à 50 % des patients développent des anticorps anti-FP4,
associés à une TIH dans 1 à 3 % des cas.
Les anticorps pathogènes étant d’isotype IgG, l’utilisation de trousses IgG spécifiques est
recommandée. Lors de la réalisation d’un test ELISA, la probabilité clinique de la TIH est fortement
corrélée à l’absorbance mesurée et les résultats doivent être exprimés en mentionnant l’absorbance et
le seuil de positivité.
Causes d’erreur, limites Les tests unitaires rapides présentent parfois une difficulté d’interprétation. Tout test douteux
doit être considéré comme positif afin de garantir leur bonne valeur prédictive négative et un test
semi-quantitatif doit être réalisé.
Fiche 11.7
Thrombopénies induites par l’héparine (TIH) : tests
fonctionnels pour la mise en évidence des anticorps
héparine-dépendants
Code NABM 1011 par méthode d’agrégation
Signification biologique du paramètre Ces tests doivent être prescrits après discussion
Les traitements par héparine peuvent induire la syn- clinico-biologique. Un score de probabilité aide
thèse d’anticorps dits héparine-dépendants générale- à guider la prescription de ces analyses qui sont
ment dirigés contre le facteur 4 plaquettaire associé réalisées essentiellement en cas de score inter-
à l’héparine (anti-HFP4) responsables d’une throm- médiaire ou élevé (≥ 4), mais il manque de
bopénie induite par l’héparine (TIH). Ces anticorps sensibilité dans certains contextes comme en
peuvent être détectés par un test fonctionnel qui réanimation ou après chirurgie cardiaque avec
met en évidence in vitro une activation et/ou une circulation extracorporelle où la persistance de
agrégation plaquettaire en présence d’héparine. la thrombopénie postopératoire ou une nouvelle
chute des plaquettes sont les critères les plus
fiables.
La recherche de ces anticorps ne doit être pres-
crite que lors d’une suspicion de TIH reposant bilan d’exploration
sur un faisceau d’arguments : La recherche d’une activation ou d’une agréga-
• diminution de 30 à 50 % de la numération tion plaquettaire doit être réalisée pour confirmer
plaquettaire (NP) sous héparine dans un délai de le pouvoir pathogène des anti-HFP4 mis en évi-
5 à 21 jours après le début du traitement (délai dence par un test immunologique. Elle est géné-
plus précoce possible si exposition à l’héparine ralement réalisée en deuxième intention après un
dans les 100 jours antérieurs) ; test immunologique positif mais peut aussi venir
• thrombose veineuse ou artérielle (nouvelle ou en première ligne en fonction du contexte. Si la
extension d’un processus thrombotique initial), suspicion clinique est forte et la recherche d’anti-
nécrose cutanée au site d’injection sous-cutané HFP4 négative, les tests fonctionnels peuvent
de l’héparine, réaction systémique après injection mettre en évidence des anticorps héparine-dépen-
intraveineuse d’héparine. dants dirigés contre une autre cible.
Nature du prélèvement Sang prélevé sur tube sec ou sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]).
Recommandations pour la Attention à NE PAS PRÉLEVER sur tubes CTAD (qui contiennent un inhibiteur de l’activation
qualité du prélèvement plaquettaire) qui pourraient rendre le test faussement négatif.
Prélever avant la mise sous Orgaran qui peut négativer les tests fonctionnels.
Contraintes Température ambiante si transport rapide, sinon réfrigéré ou congelé.
d’acheminement
Mode de conservation Pas de recommandations spécifiques du GFHT. Plasma ou sérum du jour, congelé au-delà.
Principe méthodologique Les plaquettes-témoin, lavées pour le test de libération de sérotonine radiomarquée (SRA) ou non
lavées pour le test d’agrégation plaquettaire (TAP) ou pour la cytométrie en flux (CMF), sont incubées
avec le plasma du patient et une faible concentration d’héparine (0,5 UI ou 1 UI/mL). Lorsque des
anticorps anti-HFP4 pathogènes sont présents dans le plasma, les plaquettes sont activées. Le
signal d’activation est mesuré en fluorescence (CMF), par la libération de SRA ou par le pourcentage
d’agrégation plaquettaire (TAP ou HIPA). Les seuils de positivité sont définis par le laboratoire. Cette
activation/agrégation ne doit pas être observée en présence d’une forte concentration d’héparine (10 UI
ou 100 UI) et/ou lorsque les plaquettes ont préalablement été incubées avec un anticorps monoclonal
IV.3 qui bloque l’accès au Récepteur Fc γ RII. SRA avec agrément pour utilisation de la radioactivité.
Type de mesure Mesure qualitative.
CIQ Non. Utiliser comme CIQ le plasma d’un patient ayant un test fonctionnel positif.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ TAP : sensibilité > 80 % avec une spécificité > à 90 %.
Interprétation et SRA et CF. : sensibilité > 90 %. Spécificité > 95 %.
performances
Causes d’erreur, limites Faux négatifs :
1) défaut de sensibilité des plaquettes-témoin aux anticorps de TIH ;
2) présence d’héparine ou d’Orgaran® dans le plasma qui peut inhiber l’activation/agrégation
plaquettaire induite par les anticorps de TIH ;
3) en TAP et CMF si immunoglobulines présentes dans le plasma riche en plaquettes du témoin ;
4) pour les techniques en plaquettes lavées : trop faible quantité de FP4.
Faux positifs : si présence de thrombine dans le plasma patient.
Fiche 11.8
Exploration biologique de la pharmacodynamie des
médicaments antiplaquettaires. Test d’agrégation
plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP)
Code RIHN E054

Les traitements antiplaquettaires par aspirine et indications de prescription
anti P2Y12 : thiénopyridines (clopidogrel, prasu- L’objectif du test d’agrégamétrie est d’analyser la
grel) et anti-P2Y12 directs (ticagrelor, etc.) sont réponse à un anti-P2Y12 et/ou à l’aspirine. Cette
largement utilisés, notamment chez les patients analyse ne doit pas s’appliquer à la surveillance sys-
avec syndrome coronaire aigu et/ou bénéficiant tématique d’un traitement antiplaquettaire mais seu-
d’une angioplastie coronaire, mais également en lement à certains cas rares, notamment pour évaluer :
neurologie interventionnelle (clopidogrel). De • la réponse biologique en cas de résistance
nombreuses études ont montré une variabilité clinique (thrombose de stent ou récidive) ;
interindividuelle de la réponse biologique au clo- • l’observance d’un patient ;
pidogrel, de cause génétique et non génétique, • la récupération des fonctions plaquettaires après
avec environ 30 % des patients présentant un arrêt du (des) traitement(s) avant une procédure
niveau d’inhibition plaquettaire insuffisant. Des invasive ;
interactions médicamenteuses diminuant son effet • la neutralisation de l’antiplaquettaire au décours
existent également. La réponse aux anti-P2Y12 d’un syndrome hémorragique.
directs (ticagrelor) est en revanche plus prévisible. Cette fiche concerne spécifiquement le test
Une inhibition significative de la voie P2Y12 d’agrégamétrie qui peut être complété pour les
permet de réduire la survenue de complications anti-P2Y12 par le test VASP par cytométrie en
thrombotiques notamment en phase aiguë des flux ou ELISA sur sang total (cf. fiche 11.9 « Test
syndromes coronariens aigus (SCA). À l’inverse, VASP par cytométrie en flux ou ELISA »).
une inhibition plaquettaire excessive est à éviter
afin de limiter le risque hémorragique. Place dans la hiérarchie d’un
L’étude de la réponse à un anti-P2Y12 et/ou à
l’aspirine est un examen de première ou seconde
intention selon le contexte.
Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105 ou 0,109 M ou 0,129 M). Prélèvement sur tube CTAD
(citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué.
Recommandations pour la Le sang doit être prélevé après une période de repos pour atténuer l’effet de l’exercice physique et à
qualité du prélèvement distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une absorption de caféine (2 h). Le prélèvement à jeun est
conseillé mais reste possible après une collation très légère et dépourvue de matières grasses.
Le prélèvement doit être effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale dans des
tubes en plastique ou en verre siliconé après avoir éliminé les premiers mL de sang (tube de purge).
Tous les médicaments doivent être signalés pour éviter les biais d’interprétation des résultats (en
particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, inhibiteurs de pompes à protons, etc.). Un traitement de
5 jours minimum pour les thiénopyridines est nécessaire avant les tests d’exploration.
Contraintes Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement possible.
d’acheminement L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire.
Mode de conservation La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conservation possible.
Principe méthodologique Le test est réalisé en plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation du sang citraté
10 min à 200 g entre + 18 et + 22 °C, sans frein, ou par sédimentation en cas de plaquettes
géantes. La numération plaquettaire du PRP ne doit pas être ajustée par du plasma autologue pauvre
en plaquettes jusqu’à 600 G/L. En cas de thrombopénie, les résultats seront interprétés avec prudence.
Le principe du test est basé sur une mesure photométrique de l’éclaircissement du PRP secondaire au
phénomène d’agrégation initié par l’acide arachidonique (aspirine) ou l’adénosine diphosphate, ADP
(anti-P2Y12).
Type de méthode Méthode essentiellement manuelle.
CIQ Pas de CIQ disponible. Les résultats sont interprétés au regard de valeurs de référence établies par les
laboratoires pour le couple réactifs/appareil utilisé.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Les résultats sont exprimés en pourcentage maximal d’agrégation (parfois en vélocité, en agrégation
Interprétation et résiduelle, en aire sous la courbe). L’agrégation plaquettaire sur PRP relève d’une pratique spécialisée
performancesdu test et doit être limitée à des centres expérimentés. À titre indicatif la reproductibilité intra-série (n = 21)
pour les agonistes usuels et pour un couple réactif agoniste défini se situe entre 3,8 et 6,6 %.
Une bonne réponse à un traitement par thiénopyridines se traduit par une agrégation à l’ADP 5, 10 ou
20 µM en PRP < 50 % (à établir pour chaque agrégomètre). Une bonne réponse à un traitement par
l’aspirine se traduit par une agrégation à l’acide arachidonique < 20 %.
Causes d’erreur, limites Les prélèvements très hémolysés, lipémiques ou avec une numération plaquettaire insuffisante dans le
du test PRP (< 150 G/L) modifient l’interprétation des résultats. Les résultats doivent également être interprétés
en fonction du traitement pris par le patient et des maladies associées (diabète, hypertension, AOMI, etc.).
Fiche 11.9
Test VASP par cytométrie en flux ou ELISA pour
l’exploration biologique de la pharmacodynamie des
médicaments antiplaquettaires anti-P2Y12
Code RIHN E140

Les traitements antiplaquettaires anti-P2Y12 par indications de prescription
thiénopyridines (clopidogrel, prasugrel) et anti- L’objectif du test VASP est d’analyser la réponse à
P2Y12 directs (ticagrelor, etc.) sont largement un anti-P2Y12. Cette analyse ne doit pas s’appli-
utilisés, notamment chez les patients avec syn- quer à la surveillance systématique d’un traite-
drome coronaire aigu et/ou bénéficiant d’une ment anti-P2Y12, mais elle est indiquée dans
angioplastie coronaire, ainsi qu’en neurologie certains cas rares, notamment pour évaluer :
interventionnelle (clopidogrel et ticagrelor). De • la réponse biologique en cas de résistance
nombreuses études ont montré une variabilité clinique (thrombose de stent ou récidive) ;
interindividuelle de la réponse biologique au clo- • l’observance d’un patient ;
pidogrel, de cause génétique et non génétique • la récupération des fonctions plaquettaires après
(≈ 30 % des patients présentent un niveau d’inhi- arrêt du (des) traitement(s) avant une procédure
bition plaquettaire insuffisant). Des interactions invasive ;
médicamenteuses diminuant son effet existent • la neutralisation de l’anti-P2Y12 au décours
également. La réponse aux anti-P2Y12 directs d’un syndrome hémorragique.
(ticagrelor) est en revanche plus prévisible. Une Cette fiche concerne spécifiquement le test de
inhibition significative de la voie P2Y12 permet phosphorylation de VASP par cytométrie en flux
de réduire la survenue de complications throm- ou ELISA réalisé sur sang total. Pour les tests en
botiques notamment en phase aiguë des syn- agrégométrie, voir fiche 11.8 : « Exploration bio-
dromes coronariens aigus (SCA). À l’inverse, une logique de la pharmacodynamie des médicaments
inhibition plaquettaire excessive peut être associée antiplaquettaires ».
à un risque hémorragique. Le principe du test
repose sur la mesure de la phosphorylation de la Place dans la hiérarchie d’un
VASP (Vasodilatator Stimulated Phosphoprotein), bilan d’exploration
protéine intra-plaquettaire spécifique de la signali-
La recherche de résistance aux traitements anti-
sation liée au récepteur P2Y12. Le degré de phos-
plaquettaires anti-P2Y12 est à réaliser en fonction
phorylation de la VASP est corrélé à l’efficacité du
du contexte clinique.
traitement par les anti- P2Y12.
Nature du prélèvement Sang total sur tube citrate de sodium à 0,105, 0,109 M (3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %). Prélèvement sur
tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué.
Recommandations pour la Les conditions de prélèvement sont clairement définies par l’ISTH.
qualité du prélèvement Une durée de traitement minimum aux thiénopyridines (minimum de 5 jours) doit être respectée avant
d’effectuer ce test pour une évaluation de réponse pertinente en traitement chronique. En phase aiguë
d’un SCA, le test peut être réalisé 12 heures après la dose de charge.
Contraintes d’achemi- Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, en minimisant les chocs
nement (ne pas utiliser de système pneumatique).
Mode de conservation À réaliser dans les 48 heures qui suivent le prélèvement.
Principe méthodologique Test VASP réalisé par cytométrie en flux ou par ELISA, sur sang total dans les deux cas. Après perméa-
bilisation cellulaire, la VASP phosphorylée est marquée avec un anticorps spécifique par marquage
indirect. Deux conditions sont testées en présence de PGE1 seul ou de PGE1 + ADP. Il est conseillé de
confronter les résultats à ceux d’un test d’agrégométrie (technique de référence).
Type de méthode Méthode manuelle, lecture semi-automatique (cytométrie en flux, ELISA). À ce jour un seul fournisseur
existe : Biocytex-Stago.
Type de mesure Mesure quantitative. Les résultats sont exprimés en Index de réactivité plaquettaire (IRP) en ( %).
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ Valeurs de référence à établir par le laboratoire. Les performances varient selon la sensibilité et les
Interprétation et réglages du cytomètre. Une bonne réponse à un traitement par anti-P2Y12 se traduit par un IRP*
performances < 50 % et a été déterminée après dose de charge en phase aiguë du SCA. Aucun seuil n’a été
déterminé dans les autres pathologies. Une valeur < à 20 % expose à un risque hémorragique (3,4).
Absence d’interférence avec l’aspirine et les anti-GPIIbIIIa.
Causes d’erreur, limites Les plaquettes sont sensibles à de nombreux facteurs pouvant induire un biais à cette technique s’ils
du test ne sont pas maîtrisés (ex : qualité du prélèvement, choc physique ou thermique, etc.).
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Chapitre 12
Autres contextes
clinico-biologiques

Fiche 12.1
Mesure de l’activité de la protéase du facteur Willebrand
(ADAMTS 13)
Code LC E048

ADAMTS13 (A Disintegrin And Metalloprotease indications de prescription
with ThromboSpondin type 1 repeats, member 13) Objectifs : dans un contexte de diagnostic différen-
est une métalloprotéase qui clive spécifiquement tiel des MAT, cet examen a pour objectif de mettre
le facteur Willebrand (VWF) au niveau de la en évidence ou non un déficit fonctionnel sévère de
liaison peptidique Tyr1605-Met1606 (domaine l’activité d’ADAMTS13 (< 10 %). Dans un contexte
A2 du VWF). Cette protéase réduit ainsi la taille de suivi de PTT, cet examen a pour objectif de
des multimères du VWF et régule ses fonctions détecter une diminution de l’activité d’ADAMTS13
hémostatiques. ADAMTS13 est synthétisée par les au cours de la période de rémission clinique.
cellules Ito du foie, les cellules endothéliales et les Principales indications :
mégacaryocytes. Sa concentration plasmatique est 1) diagnostic positif de PTT dans un contexte
de l’ordre de 1 µg/mL et sa demi-vie comprise de MAT (argument biologique confirmant le
entre 2 et 3 jours. En pathologie, un déficit sévère diagnostic clinique) ;
de l’activité d’ADAMTS13 (< 10 %) est associé 2) diagnostic d’exclusion d’un PTT dans un
au purpura thrombotique thrombocytopénique contexte de suspicion de syndrome hémolytique
(PTT). Le PTT est une microangiopathie throm- et urémique atypique (argument biologique
botique (MAT) et donc définie à ce titre par l’asso- confortant l’utilisation d’eculizumab) ;
ciation d’une anémie hémolytique mécanique, 3) suivi d’un PTT acquis connu (détection d’une
d’une thrombopénie sévère de consommation et rechute biologique précédant une rechute cli-
d’une ischémie multiviscérale qui sont à l’origine nique).
des signes cliniques observés chez les patients.
L’absence d’activité d’ADAMTS13 aboutit à Place dans la hiérarchie d’un
l’accumulation de VWF très hautement multimé- bilan d’exploration
risé qui favorise la formation spontanée de thrombi
Dans le bilan de MAT, la mesure de l’activité
plaquettaires dans la microcirculation, responsables
d’ADAMTS13 est un examen de première inten-
de la MAT. Il s’agit d’une maladie rare dont la
tion. En cas d’activité effondrée (< 10 %), la
prévalence annuelle en France est estimée à 13 cas
recherche d’IgG anti-ADAMTS13 doit être effec-
par million d’habitants. Sur le plan physiopatholo-
tuée en seconde intention. La mesure antigénique
gique, on distingue 3 formes de PTT :
d’ADAMTS13 n’est pas à retenir pour le diagnos-
• le PTT acquis auto-immun dû à la présence
tic biologique : cet examen est réservé à quelques
d’auto-anticorps anti-ADAMTS13 (75 % des cas) ;
rares cas pour la caractérisation de certains patients
• le PTT acquis via des mécanismes non détermi-
atteints d’USS, ou à des fins de recherche clinique.
nés (22 % des cas) ;
• le déficit congénital en ADAMTS13 résultant
de mutations du gène ADAMTS13 (syndrome
d’Upshaw-Schulman [USS], ∼ 3 % des cas).
Chapitre 12. Autres contextes clinico-biologiques 209
0,129 M [3,8 %]) ou sur tube sec. Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine,
dipyridamole) est également possible.
Recommandations pour L’EDTA inhibe l’activité d’ADAMTS13 : les prélèvements sur EDTA sont formellement contre-
la qualité du prélèvement indiqués.
Contraintes d’acheminement Sang total, plasma citraté ou sérum congelés selon le délai d’acheminement. Suivre les
Mode de conservation Pas de recommandation spécifique.
Principe méthodologique Le principe repose sur la dégradation d’un substrat exogène (VWF) par ADAMTS13 du plasma
testé et la mise en évidence des produits de dégradation. Les techniques varient par la nature du
substrat et par la méthode de mise en évidence des produits de dégradation du VWF.
- Méthodes utilisant le VWF entier : mesure des produits de protéolyse par des méthodes élec-
trophorétiques (multimères ou fragments) ou immunologiques (liaison au collagène, VWF:Ag).
- Méthodes utilisant des fragments peptidiques du VWF contenant le site de clivage : mesure
des produits de protéolyse par des méthodes fluorimétriques (FRETS-VWF73) (méthode de
référence), spectrométrie de masse (SELDI-TOF) ou immunologiques (ELISA).
Type de méthode Les méthodes actuellement disponibles sont manuelles.
CIQ Pas de CIQ spécifique disponible, excepté ceux des trousses commerciales ELISA.
EEQ Oui. Standard international depuis 2015 et ECAT (www.ecat.nl).
Valeurs de référence/ Il est recommandé de titrer le plasma destiné à l’étalonnage et d’exprimer les résultats en UI/mL
Interprétation et performances (1 UI/mL = 100 % d’activité). Les méthodes commerciales peuvent présenter des discordances
aux valeurs seuils de diagnostic par rapport la méthode de référence (environ 10 % des cas).
Causes d’erreur, limites Fluorimétrie : hémolyse ou bilirubinémie importantes, prélèvements autofluorescents.
Méthodes utilisant le VWF entier : risque d’interférence avec le VWF endogène si le taux de
VWF:Ag plasmatique/sérique est > 300 %.
Fiche 12.2
Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé
contre la protéase du facteur Willebrand (anti-ADAMTS 13)
Code LC E049
Signification biologique du paramètre auto-immune d’un déficit sévère de l’activité

Les anticorps anti-ADAMTS13 sont des auto- d’ADAMTS13 chez un patient atteint de PTT.
anticorps de nature polyclonale. Ils peuvent être Indications :
« neutralisants » (c’est-à-dire inhibiteurs) et 1) diagnostic du caractère acquis auto-immun
inhiber l’activité d’ADAMTS13, ou « non neu- d’un PTT ;
tralisants » et accélérer la clairance d’ADAMTS13 2) suivi d’un PTT acquis auto-immun (si l’activité
en formant des complexes immuns. La plupart d’ADAMTS13 demeure < 10 %) ;
du temps, ces deux mécanismes coexistent. Ces 3) suivi d’un PTT héréditaire (détection d’une
anticorps sont à l’origine de l’effondrement de allo-immunisation post-transfusionnelle après
l’activité de la métalloprotéase ADAMTS13, pro- échanges plasmatiques).
téase spécifique du facteur Willebrand (VWF).
L’absence d’activité d’ADAMTS13 aboutit à Place dans la hiérarchie d’un
l’accumulation de VWF très hautement multi- bilan d’exploration
mérisé, ce qui favorise la formation spontanée de Examen de seconde intention dans un contexte
thrombi plaquettaires dans la microcirculation d’exploration de PTT. Cet examen est à réaliser
et l’apparition d’une microangiopathie throm- si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est
botique (MAT) appelée purpura thrombotique < 10 % ou durant le suivi d’un PTT tant que
thrombocytopénique (PTT). Les auto-anticorps l’activité d’ADAMTS13 est < 10 %. Le titrage des
anti-ADAMTS13 peuvent être recherchés et titrés IgG anti-ADAMTS13 est à privilégier par rapport
par des méthodes immunologiques ou grâce à des aux tests fonctionnels car ces derniers sont moins
tests fonctionnels. sensibles notamment pour la détection des anti-
corps « non neutralisants ».
Objectifs : la mise en évidence d’auto-anticorps
anti-ADAMTS13 permet d’affirmer l’étiologie
[3,8 %]) ou sur tube sec. Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est
Recommandations pour À part le citrate de sodium, tous les autres anticoagulants sont contre-indiqués. En revanche, le
la qualité du prélèvement prélèvement sur tube sec est possible.
Contraintes Sang total, plasma citraté ou sérum congelés selon le délai d’acheminement. Suivre les recommanda-
d’acheminement tions du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport.
Mode de conservation Pas de recommandation spécifique.
Principe méthodologique Méthodes de type ELISA : plusieurs méthodes (western blot ou Elisa) dédiées à la détection et/
ou au titrage des auto-anticorps anti-ADAMTS13 (IgG, IgM et IgA) ont été développées. Seules les
méthodes permettant de titrer les IgG anti-ADAMTS13 ont été adaptées en trousses commerciales de
recherche clinique. Ces méthodes utilisent des plaques recouvertes d’un ADAMTS13 recombinant et la
révélation, des anti-IgG humaines couplées à la peroxydase.
Tests de mélange pour les tests fonctionnels : mélange de plasma témoin et de plasma testé préchauffé
à + 56 °C afin de dissocier d’éventuels complexes immuns. L’activité ADAMTS13 résiduelle est mise en
évidence selon différentes méthodes (cf. Mesure de l’activité d’ADAMTS13) avec les limites inhérentes à
ces dernières. Les tests de mélange sont des méthodes semi-quantitatives et peu sensibles.
Il n’existe pas de consensus quant à l’expression des résultats.
Type de méthode Méthode manuelle ou automatisable (ELISA) pour le titrage des IgG anti-ADAMTS13. Manuelle (tests
de mélange) pour la détection d’un inhibiteur circulant anti-ADAMTS13.
Type de mesure Mesure quantitative (ELISA) ou semi-quantitative (tests de mélange).
CIQ Pas de CIQ spécifique, excepté ceux des trousses commerciales ELISA.
EEQ Oui, ECAT (www.ecat.nl).
Valeurs de référence/Inter- ELISA : la limite principale de l’examen dépend du seuil de positivité. Avec les trousses commerciales,
prétation et performances celle définie par le fabricant est comprise entre 10 U/mL et 15 U/mL. Ce seuil est probablement
du test sous-estimé. Il est recommandé que chaque laboratoire définisse son seuil à l’aide d’une population
de volontaires sains.
Causes d’erreur, limites L’administration d’immunoglobulines chez le patient peut constituer une interférence (faux positif). De
plus, la recherche d’IgG anti-ADAMTS13 est négative à la phase inaugurale chez environ 20 % des
PTT acquis. Cela est vraisemblablement dû à plusieurs facteurs :
1) une limite de sensibilité du test pour la détection des IgG anti-ADAMTS13 non libres (c’est-à-dire
liées à ADAMTS13 au sein de complexes immuns circulants) ;
2) l’absence d’IgG anti-ADAMTS13 circulantes chez certains patients PTT dont tous les complexes
immuns ont subi une clairance par le système macrophagique ;
3) le caractère non auto-immun de certains PTT acquis (défaut de synthèse, dégradation ou inhibition
catalytique d’ADAMTS13).
Fiche 12.3
Dosage de l’activité amidolytique du plasminogène (PLG)
Code RIHN E100
Signification biologique du paramètre récurrente de pseudo-membranes fibrineuses au

Le plasminogène est le précurseur inactif de la niveau des muqueuses oculaires pouvant conduire
plasmine, enzyme clé du système fibrinolytique à la cécité. Plus rarement, il a été rapporté une
vasculaire et extravasculaire. Le plasminogène est atteinte des muqueuses utérine, digestive ou res-
une glycoprotéine d’environ 92 kDa de la famille piratoire. Dans de rares cas, ces dépôts fibrineux
des sérines protéases synthétisée principalement surviennent au niveau du système nerveux central
par le foie. Il circule dans le plasma sous deux à l’origine d’hydrocéphalie occlusive chez le nou-
formes : l’une native, majoritaire, le Glu-plasmi- veau-né et nécessitent la recherche d’un déficit en
nogène (demi-vie : 2-3 jours), l’autre étant le Lys- plasminogène.
plasminogène qui a subi une protéolyse partielle La prévalence des thromboses veineuses profondes
(demi-vie : 20 h). Sous l’influence de l’activateur associées à un déficit en plasminogène étant iden-
tissulaire du plasminogène (t-PA) ou de l’uroki- tique à celle de la population générale, le dosage
nase (u-PA), le plasminogène est converti en plas- de l’activité du plasminogène n’est pas indiqué
mine. Son rôle principal consiste à lyser la fibrine dans le cadre d’un bilan de thrombophilie.
insoluble pour permettre la formation de produits
de dégradation de la fibrine solubles. La plasmine
est ensuite rapidement neutralisée par l’alpha-2
antiplasmine. Le dosage de l’activité du plasminogène est
un examen de première intention en cas de
conjonctivite ligneuse. Un déficit doit toujours
être confirmé sur un second prélèvement. Une
indications de prescription diminution de l’activité du plasminogène devra
La principale indication du dosage de l’activité être complétée par un dosage antigénique du
du plasminogène est la conjonctivite ligneuse. Il plasminogène. Il existe deux types de déficits :
s’agit de la principale manifestation clinique asso- l’hypoplasminogénémie (type 1) avec antigène et
ciée au déficit congénital en plasminogène avec dosage fonctionnel abaissés et la dysplasminogé-
une incidence < 106. Elle correspond à un défaut némie (type 2) avec taux antigénique normal et
de la fibrinolyse extravasculaire, avec formation taux fonctionnel inférieur à 60 %.
du prélèvement pour la mesure du plasminogène. Il est habituellement admis une stabilité :
1) en sang total inférieure à 4 h à température ambiante ;
2) en plasma pauvre en plaquettes congelé 1 mois à – 20 °C et 6 mois à – 80 °C.
La centrifugation du sang total pour obtenir du plasma doit se faire dans les 2 h suivant le
prélèvement.
Principe méthodologique Le dosage de l’activité du plasminogène est réalisé par méthode amidolytique. De la streptoki-
nase en excès est ajoutée au plasma dilué permettant la formation d’un complexe plasminogène-
streptokinase avec une activité « plasmine-like ». Cette quantité de complexes, proportionnelle
à la quantité de plasminogène initiale, est évaluée par son action sur un substrat chromogène.
Dans ces conditions, la réaction est insensible aux inhibiteurs plasmatiques du plasminogène.
CIQ Oui commerciaux, au moins 2 niveaux.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/Inter- Résultats exprimés en pourcentage. L’activité du plasminogène est diminuée de 50 % chez le
prétation et performances nouveau-né à terme et atteint des valeurs adultes à l’âge de 6 mois (valeurs de référence :
80-120 %). Chez les patients atteints de conjonctivite ligneuse associée à un déficit constitution-
nel en plasminogène, l’activité est en général < 40 %.
L’activité du plasminogène peut être augmentée en cas de grossesse, de syndrome inflamma-
toire ou infectieux.
Causes d’erreur, limites Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte inflammatoire ou
infectieux.
Fiche 12.4
Recherche d’un auto-anticorps dirigé contre la
protéine S
Code RIHN E106

Les auto-anticorps dirigés contre la protéine S indications de prescription
(PS) peuvent être responsables d’un déficit acquis La recherche d’auto-anticorps dirigés contre la
en PS. Quand ce déficit est sévère, des accidents protéine S est indispensable lors de la mise en évi-
thrombotiques graves ou un purpura fulminans dence d’un déficit sévère en protéine S diagnos-
post-infectieux se manifestant par des lésions tiqué dans un contexte d’accident thrombotique
ecchymotiques, voire nécrotiques, peuvent sur- grave ou de purpura fulminans post-infectieux
venir. Ces manifestations gravissimes, souvent pour débuter rapidement un traitement adapté.
accompagnées d’une coagulation intravascu La mise en évidence d’une décroissance progres-
laire disséminée, surviennent principalement au sive des anticorps anti-PS est nécessaire pour
décours d’un épisode infectieux, le plus souvent s’assurer de l’efficacité du traitement.
une varicelle. Un diagnostic précoce est indis-
pensable pour permettre une prise en charge Place dans la hiérarchie d’un bilan
adaptée. Ils peuvent parfois être rencontrés au d’exploration
cours de maladies auto-immunes. Ces anticorps,
La recherche d’auto-anticorps anti-PS est un
lorsqu’ils inhibent l’activité anticoagulante de la
examen de deuxième intention à réaliser en cas
PS, sont dits neutralisants.
de déficit isolé sévère en PS dans un contexte cli-
nique n’évoquant pas un déficit constitutionnel.
Cette recherche s’effectue dans un laboratoire
spécialisé.
Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]), CTAD (citrate,
théophylline, adénosine, dipyridamole), EDTA ou tube sec.
Recommandations pour Pas de recommandations spécifiques disponibles ; le même prélèvement étant le plus souvent
la qualité du prélèvement utilisé pour le dosage de la PS, suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour ce dosage.
Contraintes d’acheminement Sang total, plasma ou sérum congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations
du prélèvement pour la mesure de la PS. Certaines trousses indiquent que le plasma doit être
utilisé dans les 8 heures suivant sa préparation ou être congelé à une température au moins
– 20 °C pendant 6 mois maximum.
Principe méthodologique Utilisation d’une plaque ELISA sensibilisée par de la PS humaine puis stabilisée. L’échantillon à
tester est déposé dans le puits. Les auto-anticorps anti-PS, lorsqu’ils sont présents se fixent sur la
PS immobilisée. Après lavage, les anticorps fixés sont révélés par un immunoconjugué spécifique
des IgG humaine ou des IgM humaines. La coloration qui se développe est proportionnelle à la
quantité d’auto-anticorps anti-PS présente dans le milieu.
Type de méthode Méthode manuelle de type ELISA. Trousses commerciales disponibles.
Type de mesure Mesure quantitative : titre en unités arbitraires UA/mL obtenues grâce à une courbe d’étalonnage.
CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- Les seuils de positivité sont indiqués par le fabricant. Les kits ELISA disponibles sur le marché
prétation et performances n’ont pas de marquage CE.
Causes d’erreur, limites Un lavage insuffisant peut se traduire par un bruit de fond élevé et une valeur trop forte du
contrôle négatif.
Comme pour tout auto-anticorps, la présence d’un état inflammatoire ou infectieux, d’immun-
complexes circulants, de gammapathie, de pathologies auto-immunes, peuvent entraîner une
réactivité aspécifique faible.
Bibliographie du chapitre 12 Mariotte E, Azoulay E, Galicier L, et al. French Refe-

rence Center for Thrombotic Microangiopathies.
FICHE 12.1 – Mesure de l’activité de la protéase du
Epidemiology and pathophysiology of adulthood-
facteur Willebrand (ADAMTS 13).
onset thrombotic microangiopathy with severe
Veyradier A, Wolf M, Stepanian A, et al. ADAMTS13,
ADAMTS13 deficiency (thrombotic thrombocytope-
la protéase spécifique de clivage du facteur Von
nic purpura) : a cross-sectional analysis of the French
Willebrand. EMC Biologie médicale 2011;. 90-20-
national registry for thrombotic microangiopathy.
0003-A.
Lancet Haematol 2016;3:e237–245.
Mariotte E, Azoulay E, Galicier L, et al. French Refe-
Ferrari S, Mudde GC, Rieger M, et al. IgG subclass dis-
rence Center for Thrombotic Microangiopathies.
tribution of anti-ADAMTS13 antibodies in patients
Epidemiology and pathophysiology of adulthood-
with acquired thrombotic thrombocytopenic pur-
onset thrombotic microangiopathy with severe
pura. J Thromb Haemost 2009;7:1703–10.
ADAMTS13 deficiency (thrombotic thrombocytope-
nic purpura) : a cross-sectional analysis of the French FICHE 12.3 – Dosage de l’activité amidolytique du
plasminogène (PLG).
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Lancet Haematol 2016;3:e237–245. Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of
Hubbard AR, Heath AB, Kremer Hovinga JA. Subcom- fibrinolysis. Br J Haematol 2005;129:307–21.
mittee on von Willebrand Factor. Establishment of Hilali MM, Gilliver BE. Physiological activation of plas-
the WHO 1st International Standard ADAMTS13, minogen in full term newborn infants. J Clin Pathol
plasma (12/252) : communication from the SSC 1984;37:1264–7.
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Thouzeau S, Capdenat S, Stépanian A, et al. Évaluation of contre la protéine S.
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ment. Thromb Haemost 2013;110:852–3. corps dirigés contre la protéine S : référentiels hémos-
Joly B, Stepanian A, Hajage D, et al. Évaluation of a chro- tase/Société française d’hématologie. Hématologie
mogenic commercial assay using VWF-73 peptide 2012;18:233–8.
for ADAMTS13 activity measurement. Thromb Res Larakeb AS, Evrard S, Louillet F, et al. Acute renal cortical
2014;134:1074–780. necrosis due to acquired antiprotein S antibodies.
Pediatr Nephrol 2009;24:207–9.
FICHE 12.2 – Recherche et titrage d’un anticorps
spécifique dirigé contre la protéase du facteur
Boccara O, Lesage F, Regnault V, et al. Nonbacterial pur-
Willebrand (anti-ADAMTS 13). pura fulminans and severe autoimmune acquired pro-
Veyradier A, Wolf M, Stepanian A, et al. ADAMTS13, tein S deficiency associated with human herpesvirus-6
la protéase spécifique de clivage du facteur Von active replication. Br J Dermatol 2009;161:181–3.
Willebrand. EMC Biologie médicale 2011;. 90-20-
0003-A.
Chapitre 13
Annexes

Fiche 13.1
Tableau de synthèse des recommandations
pré-analytiques
(mise à jour mai 2017)
Paramètres Recommandé Acceptable Non conforme

Tube Tube sous « vide », stérile.
Tube citrate : PET étanche, poly- Verre siliconé. Autres.
propylène
Tube CTAD : PET ou verre siliconé.
Volume résiduel
Volume d’air résiduel ≤ 20 %. d’air > 20 % (pour
la surveillance des trai-
tements par héparine
non fractionnée).
Respect strict des dates de
péremption.
Anticoagulant Citrate 3,2 %. Citrate 3,8 %. Autres.
CTAD : dont citrate 3,2 %.
Le GEHT recommande une concen-
tration de citrate unique pour un
LBM compte tenu des possibles
variations des valeurs de référence
des tests globaux en particulier
(TQ/TCA).
pH plasma anticoa- 7,3 à 7,45 < 7,3 ou > 7,45
gulé
Hématocrite 0,20 (20 %) à 0,55 (55 %). 1/ Si > 0,55 (55 %) : le GEHT recom- > 0,55 (55 %) :
mande au minimum une information aux résultat rendu sans
prescripteurs. La correction du volume information au pres-
de citrate au niveau du tube est laissée à cripteur.
l’appréciation de chaque LBM.
2/ Si < 0,20 (20 %) en accord avec les < 0,20 (20 %) : pas
recommandations documentées du CLSI d’ajustement recom-
(5e édition), un ajustement du volume de mandé du volume de
citrate est possible (appréciation LBM). citrate, résultat rendu
Cependant les examens d’hémostase sans information au
peuvent être réalisés sans correction du prescripteur.
volume d’anticoagulant.
Calibre de l’aiguille 19 à 22 gauge. 23 gauge : veines difficiles, pédiatrie, > 25 gauge.
gériatrie, oncologie, etc.
Matériel de Polymère inerte, matériel stérile,
prélèvement apyrogène.
Utilisation d’unités à ailettes (épicrâ-
niennes) autorisée en particulier en
cas de veines difficiles, en pédiatrie,
gériatrie, oncologie, etc.
Chapitre 13. Annexes 219

Garrot < 1 min. Peu serré. Entre 1 à 3 min. > 3 min. Trop serré.
Site de ponction Veineux. Artériel. Autres.
Prélèvement sur cathéter : après rejet
d’un volume de sang qui tient compte de
l’espace mort que représente le cathéter
(environ 5 à 10 mL).
Place du tube 2e tube après un tube de « purge » 1er tube, si ponction veineuse franche Après tube sec
(neutre sans additif) ou un tube sec et si le bilan ne comporte que des avec activateur ou
(sans activateur de l’hémostase) ou tests courants de coagulation (TQ en anticoagulant autre
après des hémocultures. particulier) non affectés par l’activation que citrate.
endothéliale.
Lors des prélèvements avec une En cas de prélèvement avec aiguille
aiguille épicrânienne, le tube de épicrânienne, à défaut d’un tube de
purge est recommandé. purge, il est recommandé de s’assurer
obligatoirement du volume de remplis-
sage acceptable (volume mort de la
tubulure < 10 % du volume final du
tube).
Remplissage ≥ 90 %. ≥ 80 %. < 80 %.
Homogéinisation Dès la fin du remplissage du Homogénéisation du
du tube après le tube, par retournements lents et tube par retourne-
prélèvement complets. ments non réalisée ou
décalée par rapport à
la fin du prélèvement.
Agitation vigoureuse.
Transport sang total Non réfrigéré. Pour les températures intermédiaires, le Réfrigéré (+ 2 à + 8 °C)
GEHT n’émet pas de recommandations, Glace.
mais préconise d’associer lors de la >+ 37 °C.
+ 15 à + 25 °C. maîtrise des risques la température ET la
durée du transport.
Le GEHT recommande de minimiser

les chocs et les vibrations pour
éviter de dénaturer les protéines et
limiter l’activation plaquettaire (CLSI
5e édition).
Le transport par pneumatique fait l’objet de recommandations spécifiques pour la qualification, basées sur
la longueur, la vitesse moyenne, les accélérations et décélérations, les forces appliquées à l’échantillon,
la température… L’argumentaire est disponible ici : http://site.geht.org/wp-content/uploads/2016/12/
Reco_Transport_pneumatique.pdf
Conservation et délai À la date du 01/07/2018, données disponibles pour les examens suivants : TP, TCA, fibrinogène, D dimères,
avant l’examen activités anti-Xa HNF et anti-Xa HBPM. En cours de révision pour les autres examens.

Centrifugation
Conditions standard 1 500 à 2 000 g ET au moins < 1 500 g ET 15 min.
L’argumentaire est dis- 15 min
ponible ici : http://site.
geht.org/wp-content/ ou < 2 000 g ET 10 min.
uploads/2016/12/cen- 2 000 à 2 500 g ET au moins
trifugation.pdf 10 min.
Centrifugation rapide > ou = 3 000 g ET au moins 5 min < 3 000 g ET 5 min.
(Limitée aux TQ,
TCA, fibrinogène et
Ddimères)
L’argumentaire est dis-
ponible ici : http://site. ou
geht.org/wp-content/ > ou = 4440g ET au moins 2 min. < 4 440 g ET 2 min.
uploads/2016/12/cen-
trifugation.pdf
Double centrifugation Deux centrifugations standard Centrifugation standard unique (sous Filtration
L’objectif est d’obtenir successives (avec décantation entre réserve de vérification de l’obtention ou
un taux de plaquettes les 2 centrifugations). d’un plasma avec un nombre résiduel de centrifugation rapide
résiduelles dans le plaquettes < 10 G/L). (en première et/ou
plasma < 10 G/L deuxième centrifu-
L’argumentaire est dis- gation).
geht.org/wp-content/
trifugation.pdf
Température Centrifugeuse à température Si fonctionnement ponctuel, les cen- <+ 15 °C ou >+ 25 °C.
L’argumentaire est dis- contrôlée = + 15 à + 25 °C. trifugeuses sans système de refroidis-
ponible ici : http://site. sement peuvent être utilisées
geht.org/wp-content/ (sous réserve que la température reste
uploads/2016/12/cen- <+ 25 °C au cours de l’utilisation).
trifugation.pdf
Rotor Rotor à godets mobiles. Rotor angulaire à angle fixe (sous réserve
L’argumentaire est dis- de vérifier l’absence de contamination du
ponible ici : http://site. plasma par les cellules sanguines).
trifugation.pdf
Frein Frein désactivé. Frein (puissance minimum). Frein (puissance
L’argumentaire est dis- maximum).
trifugation.pdf
Contrôles des Au moins une fois par an. < une fois par an.
centrifugeuses Critères de contrôle des plasmas : Moins de 6 échan-
L’argumentaire est dis- plaquettes < 10 G/L sur au moins tillons consécutifs
ponible ici : http://site. 6 échantillons consécutifs analyses. analyses.
trifugation.pdf

Congélation Rapide à au moins – 70 °C. Rapide à au moins – 20 °C. Autres.
Conservation des
échantillons congelés
Au moins – 70 °C. Au moins – 20 °C (< 15 jours). < – 20 °C.
Tube non mouillable avec
bouchon à vis.
Capacité adaptée au volume du
plasma.
À la date du 01/07/2018, données disponibles pour les examens suivants : TP, TCA, fibrinogène, D dimères,
activités anti-Xa HNF et anti-Xa HBPM. En cours de révision pour les autres examens.
Transport Carboglace. Il est recommandé de Glace ou accumulateur de froid (plaque Température ambiante,
d’échantillon congelé s’assurer de la conformité du trans- eutectique). fraîche ou réfrigérée.
port et du matériel à la réception. Il est recommandé de s’assurer de la
conformité du transport et du matériel à
la réception.
Décongélation Rapide à + 37 °C au bain-marie Température ambiante.
avec une immersion complète de Étuve, Micro-ondes.
l’aliquote et un temps de décongéla- >+ 39 °C.
tion adapté au volume de plasma de
l’aliquote.
Fiche 13.2
Stabilité des paramètres d’hémostase générale et délais
de réalisation des analyses. Sang total et plasma frais
Mise à jour mai 2017
Les délais en sang total correspondent au délai à • T°C réfrigérée : + 2- + 8 °C (d’après la Phar-
partir du prélèvement. macopée européenne).
Les délais des plasmas correspondent à des • Entre + 8 et + 15 °C : Absence de données.
échantillons centrifugés dans les deux heures En l’absence de données suffisantes, le GFHT ne
suivant le prélèvement. Conservation en tube se prononce pas sur la conformité de conditions
primaire bouché. de conservation non mentionnées dans le tableau.
• T°C ambiante : + 15- + 25 °C (d’après la Pharma- Lien vers Recommandations texte long GFHT
copée européenne). délai de réalisation : http://site.geht.org/actu/
recommandations-preana-2017/
Paramètre SANG TOTAL et PLASMA FRAIS
Recommandé Acceptable Non conforme
TP/INR Sang total et plasma : jusqu’à Sang total et plasma : Sang total et plasma :
(demande seule en 24 h à T°C ambiante. - jusqu’à 4 h à T°C réfrigérée ; - au-delà de 24 h à T°C
attente des recom- - jusqu’à 2 h à T°C comprise ambiante ;
mandations pour les entre + 25 °C et + 30 °C. - au-delà de 4 h à T°C réfrigérée ;
dosages des facteurs - au-delà de 2 h à T°C comprise
de la voie exogène) entre + 25 °C et + 30 °C ;
- T°C > + 30 °C ;
- conservation sur glace.
Fibrinogène Sang total et plasma : jusqu’à Sang total : jusqu’à 24 h, entre Sang total et plasma :
24 h, à T°C ambiante. + 4 °C et + 30 °C. - au-delà de 24 h, quelle que soit
Plasma: jusqu’à 24 h, entre la T°C de conservation ;
+ 4 °C et + 25 °C. - conservation sur glace.
D-dimères Sang total : jusqu’à 24 h à T°C Sang total : jusqu’à 24 h à T°C Sang total :
ambiante. entre + 4 °C et + 8 °C. - au-delà de 24 h quelle que soit
Plasma : données bibliogra- la température de conservation ;
phiques insuffisantes, se référer - < + 4 °C ou > + 25 °C ;
aux fiches produits fournisseurs. - conservation sur glace.
Paramètre SANG TOTAL et PLASMA FRAIS

Recommandé Acceptable Non conforme
TCA sans HNF Sang total (si dosage des fac- Sang total :
teurs de la voie endogène) : - au-delà de 4 h à T°C ambiante
jusqu’à 4 h à T°C ambiante. si dosage des facteurs de la voie
Sang total (sans dosage endogène ;
des facteurs de la voie - au-delà de 6 h à T°C ambiante
endogène) : jusqu’à 6 h, à T°C sans dosage des facteurs de la
ambiante. voie endogène ;
- conservation sur glace ou à
température réfrigérée.
Plasma (si dosage des Plasma (sans dosage des Plasma :
facteurs de la voie endogène) : facteurs de la voie endogène) : - au-delà de 4 h à T°C ambiante
jusqu’à 4 h à T°C ambiante, si jusqu’à 8 h à T°C réfrigérée. si dosage des facteurs de la voie
centrifugation dans les 2 heures. endogène ;
Plasma (sans dosage - au-delà de 8 h à T°C ambiante
des facteurs de la voie ou réfrigérée sans dosage des
endogène) : jusqu’à 8 h à T°C facteurs de la voie endogène.
ambiante, si centrifugation dans
les 2 heures.
TCA avec HNF et/ou Sang total sur tube citraté : Tube citraté :
Activité anti-Xa jusqu’à 2 heures après le Sang total : > 2 h après le prélève-
HNF prélèvement, à T°C ambiante. ment si échantillon conservé à T°C
ambiante.
Plasma sur tube citraté :
jusqu’à 4 h après le prélève-
ment, si centrifugation dans
l’heure, plasma décanté ou non,
conservation à T°C refrigérée ou
ambiante (données insuffisantes
si la centrifugation n’est pas
réalisée dans l’heure suivant le
prélèvement).
Sang total ou plasma sur tube Sang total ou plasma sur tube
CTAD : jusqu’à 6 h après le CTAD : > 6 h après le prélève-
prélèvement, à T°C ambiante. ment, à T°C ambiante.
Activité anti-Xa Sang total et plasma : jusqu’à
HBPM 6 h à T°C ambiante
(données insuffisantes au-delà
de 6 h).
TP : Taux de prothrombine. INR : International normalized ratio. TCA : Temps de céphaline avec activateur. HNF : Héparine non fractionnée. HBPM : Héparine de bas
poids moléculaire. CTAD : Citrate théophylline adénosine dipyridamole.
Fiche 13.3
Stabilité des paramètres d’hémostase générale et délais
de réalisation des analyses. Plasma décanté et congelé
En l’absence de données suffisantes, le GFHT ne Lien vers Recommandations texte long GFHT
se prononce pas sur la conformité de conditions délai de réalisation : http://site.geht.org/actu/
de conservation non mentionnées dans le tableau. recommandations-preana-2017/.
Paramètre PLASMA DÉCANTÉ et CONGELÉ

Recommandé Acceptable Non conforme Pas de données ou
données insuffi-
santes
TP Pas de congélation. Décantation dans les 4 h Conservation à une T°C Au-delà de 3 ans à
INR après le prélèvement : > – 20 °C. T°C < – 70 °C.
(demande TP seule en - jusqu’à 4 semaines à Conservation au-delà de
attente des recom- T°C ≤ – 20 °C ; 4 semaines à – 20 °C ≤
mandations pour les - jusqu’à 3 ans à T°C ≤ T°C < – 70 °C.
dosages des facteurs – 70 °C.
de la voie exogène)
Fibrinogène Jusqu’à 24 mois à Conservation à une T°C Au-delà de 24 mois
T°C ≤ – 20 °C et/ou > – 20 °C. à T°C < – 20 °C et/
≤ – 70 °C. ou < – 70 °C.
D-dimères Jusqu’à 24 mois à Conservation à une T°C Au-delà de 24 mois
T°C ≤– 20 °C. > – 20 °C. à des T°C comprises
Jusqu’à 36 mois à entre – 20 °C <
T°C ≤ – 70 °C. T°C < – 70 °C.
Au-delà de 36 mois à
T°C < – 70 °C.
TCA sans HNF Pas de congélation. Décantation dans les 4 h Conservation à une T°C Au-delà de 2 ans à
après le prélèvement : > – 20 °C. T°C < à – 70 °C.
- jusqu’à 12 mois à Conservation au-delà de
T°C ≤ – 20 °C ; 12 mois à
- jusqu’à 2 ans à T°C ≤ – 20 °C ≤ T°C < – 70 °C.
- 70 °C.
Paramètre PLASMA DÉCANTÉ et CONGELÉ

Recommandé Acceptable Non conforme Pas de données ou
données insuffi-
santes
TCA avec HNF Pas de congélation. Centrifugation dans Conservation à une T°C Au-delà de
l’heure qui suit le prélè- > – 20 °C. 2 semaines à T°C <
vement du tube citraté et – 20 °C.
décantation dans les 4 h Conservation du
après le prélèvement. plasma congelé à
Jusqu’à 2 semaines à partir des tubes CTAD.
T°C ≤ – 20 °C.
Activité anti-Xa HNF Pas de congélation. Centrifugation dans Conservation à une T°C Au-delà d’une
l’heure qui suit le > – 20 °C. semaine à T°C <
prélèvement du tube – 70 °C.
citrate. Conservation du
Jusqu’à 1 semaine à plasma congelé à
T°C ≤ à – 70 °C. partir des tubes CTAD.
Activité anti-Xa HBPM Pas de congélation. Plasma décanté et Conservation à une T°C Au-delà de 24 h à
congelé dans les 4 h > – 20 °C. des T°C inférieure
après le prélèvement : à – 20 °C.
- jusqu’à 24 h à T°C ≤ Au-delà d’une
- 20 °C ; semaine à T°C <
- jusqu’à 1 semaine à – 70 °C.
T°C ≤ – 70 °C.
TP : Taux de prothrombine. INR : International normalized ratio. TCA : Temps de céphaline avec activateur. HNF : Héparine non fractionnée. HBPM : Héparine de bas
poids moléculaire. CTAD : Citrate théophylline adénosine dipyridamole.
Chapitre 14
Groupes sanguins érythrocytaires

Fiche 14.1
Le groupage sanguin ABO-RH1 (RhD)
Code NABM 1140

Le polymorphisme érythrocytaire est immuno- indications de prescription
gène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à L’objectif de l’analyse est de connaître le résultat
la grossesse et pour certains groupes, à la trans- du groupe ABO-RH1 d’un patient afin d’assurer
plantation incompatible. la sécurité immuno-hémolytique des transfusions,
• Une transfusion incompatible peut aboutir, a greffes et transplantations et un suivi immunohé-
minima, à une inefficacité transfusionnelle, au matologique de la grossesse.
pire au décès du patient. Ainsi, les anticorps des • En contexte transfusionnel, la disponibilité
différents systèmes dictent les règles de compatibi- d’un groupe ABO-RH1 valide du receveur est
lité transfusionnelle qui ont pour objectif d’éviter obligatoire. Elle permet d’assurer les règles de
un conflit et/ou de prévenir une allo-immuni- compatibilité lors de la sélection des concentrés
sation. Parmi les différents systèmes de groupes de globules rouges et de plaquettes ainsi que du
sanguins, deux sont considérés comme majeurs. plasma. Il est toujours associé au phénotype RH
Le premier est le système ABO dont les anticorps, (RH2, RH3, RH4, RH5) et KEL1.
naturels et réguliers, représentent un danger dès • En contexte obstétrical, la connaissance du
la première transfusion incompatible qui peut groupe RH1 (RhD) de la mère permet, chez
aboutir à une hémolyse intravasculaire aiguë. Le les femmes RhD négatif (RH:-1) de mettre
second est système Rhésus (RH) et notamment en œuvre un calendrier de suivi adéquat de la
l’antigène D (RH1) qui est le plus immunogène grossesse et, lorsque le RH1 (RhD) de l’enfant
des antigènes de groupes sanguins et dont les (fœtus et nouveau-né) est connu, d’indiquer une
anticorps, immuns et irréguliers, peuvent aboutir immunoprophylaxie anti-D ou de diagnostiquer
à une hémolyse intratissulaire massive. une maladie hémolytique fœtale et/ou néonatale
• Les anticorps de groupes sanguins s’opposent par anti-D. La détermination du groupe RH1
aussi à une grossesse incompatible. Si les anticorps (RhD) du fœtus se fait par génotypage fœtal à
du système ABO peuvent être responsables d’une partir de l’ADN circulant dans le plasma maternel.
maladie hémolytique néonatale souvent modérée, La connaissance du groupe ABO de la mère et du
les anticorps anti-D peuvent être responsables de nouveau-né permet de diagnostiquer une maladie
maladie hémolytique fœtale et néonatale sévères hémolytique néo natale par incompatibilité fœto-
avec parfois mort in utero. maternelle ABO.
• Du fait d’une distribution extra-érythroïde • En contexte de transplantation d’organe, la
(expression endothéliale), les antigènes du système connaissance du groupe ABO-RH1 du receveur
ABO s’opposent également à la transplantation et du greffon permet de sélectionner le gref-
incompatible qui peut aboutir à un rejet aigu. fon adéquat et, dans les transplantations rénales
• Enfin, si l’incompatibilité ABO ne s’oppose pas incompatibles majeures, de poser l’indication
à la greffe de cellules souches hématopoïétiques, d’un titrage des anticorps ABO afin d’envisager
elle peut être responsable d’évènements immuno- une éventuelle stratégie de réduction de ces anti-
hémolytiques au moment de l’infusion du greffon corps.
ou dans les suites immédiates, qui imposent une • En contexte de greffe de cellules souches héma-
prise en charge adaptée. topoïétiques, la connaissance du groupe ABO-
On conçoit donc l’intérêt de connaître de façon RH1 du receveur et du greffon permet d’évaluer
indissociable le groupe ABO-RH1 d’un patient les risques hémolytiques en cas d’incompatibilité
dans ces diverses situations. ABO majeure ou mineure.

Chapitre 14. Groupes sanguins érythrocytaires 231
• Enfin, en cas de recherche d’agglutinines irré- Place dans la hiérarchie d’un bilan
gulières (RAI) positive, le groupe ABO-RH1 d’exploration
contribue à la validation d’un anti-RH1. Dans toutes ces situations, le groupage ABO-
RH1 demeure une analyse de première intention
qui est incontournable et non substituable.

Recommandations pour Test à réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois).
la qualité du prélèvement Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un groupe ABO-RH1
valide est obtenu après deux déterminations sur deux prélèvements réellement différents.
Compte tenu de l’immaturité des antigènes et des anticorps, un groupe ABO de nouveau-né ne peut
être validé avant l’âge de 6 mois.
Contraintes Température ambiante.
d’acheminement
Mode de conservation Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer).
Principe méthodologique La détection des groupes sanguins repose sur des méthodes immunologiques où la réaction
antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par
immunoadhérence (support microplaque).
Une réalisation de groupage ABO repose sur 2 épreuves qui doivent être cohérentes entre elles : une
épreuve globulaire en testant les hématies avec des anticorps monoclonaux (anti-A, anti-B et anti-A,B)
et une épreuve plasmatique en testant le plasma vis-à-vis d’hématies test A1 et B.
Une réalisation de groupage RH1 consiste à tester les hématies vis-à-vis d’un anti-D monoclonal et du
réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative.
Une détermination à partir d’un prélèvement repose sur une réalisation si elle est automatisée et deux
réalisations par deux opérateurs si elle est manuelle.
Un résultat valide repose sur deux déterminations à partir de deux prélèvements différents.
Type de méthode Méthodes manuelles et automatisées.
CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA).
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Il n’y a pas de valeur de référence pour ces caractéristiques inhérentes à l’individu.
Interprétation La qualité du résultat dépend de celle des hématies et anticorps utilisés.
et performances
Causes d’erreur, limites Le principal risque lors de la détermination de groupes sanguins est une inversion de patients.
du test L’identito-vigilance est majeure et renforcée par la nécessité de réaliser deux épreuves différentes.
La présence d’anticorps anti-érythrocytaires peut fausser les résultats (auto- ou allo-immunisation).
232 Immuno hématologie
Fiche 14.2
Le phénotypage RH-KEL1 (Rh-K)
Code NABM 1145
Signification biologique du paramètre d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des

Le polymorphisme érythrocytaire est immuno- transfusions et un suivi immunohématologique de
gène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la la grossesse. Cette analyse est utile dans différents
grossesse et, pour certains groupes, à la trans- cas de figure.
plantation incompatible. À côté des antigènes • En contexte transfusionnel, le phénotype RH-
du système ABO et de l’antigène RH1 du sys- KEL1 est obligatoire chez tout receveur afin
tème RH, d’autres antigènes peuvent être la d’avoir un résultat fiable avant toute transfusion
cible d’anticorps impliqués dans des réactions et d’assurer les règles de compatibilité lors de la
transfusionnelles ou des incompatibilités fœto- sélection des concentrés de globules rouges en
maternelles plus ou moins sévères. Parmi eux, on vue d’éviter un conflit si l’anticorps est présent ou
considère ceux qui sont explorés par le phénotype de prévenir une allo-immunisation chez certains
RH-KEL1 qui regroupe les antigènes RH2 (C), patients pour préserver un avenir obstétrical chez
RH3 (E), RH4 (c) et RH5 (e) du système RH la femme avant la ménopause ou un avenir trans-
et l’antigène KEL1 (K) du système KEL. Les fusionnel chez le polytransfusé potentiel (hémo-
anticorps correspondants, qui peuvent apparaître pathies, hémoglobinopathies).
à la suite d’une stimulation interhumaine (trans- • En contexte obstétrical, la réalisation du phéno-
fusion ou grossesse), sont dits immuns et irrégu- type RH-KEL1 est obligatoire. Outre sa contri-
liers. La connaissance du phénotype RH-KEL1 bution au diagnostic d’une éventuelle maladie
des patients permet de sélectionner les produits hémolytique fœtale ou néonatale impliquant les
sanguins adéquats en vue de prévenir une allo- anticorps correspondants, il permettra d’anticiper
immunisation ou un conflit et contribue à vali- la sélection des produits sanguins pour la mère ou
der la spécificité d’un anticorps lors de l’étape l’enfant si nécessaire.
d’identification d’une recherche d’agglutinines • Enfin en cas de RAI positive, le phénotype RH-
irrégulières (RAI). On conçoit donc l’intérêt de KEL1 est obligatoire et contribue à la validation
connaître le phénotype RH-KEL1 d’un patient d’anticorps dirigés contre les différents antigènes
dans ces diverses situations. qu’il regroupe.
Objectifs de l’analyse et principales Place dans la hiérarchie d’un bilan

indications de prescription d’exploration
L’objectif de l’analyse est de connaître le résul- Dans toutes ces situations, le phénotype RH-
tat du phénotype RH-KEL1 d’un patient afin KEL1 demeure une analyse de première intention
qui est incontournable et non substituable.

Recommandations pour À réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois).
la qualité du prélèvement Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un phénotype RH-KEL1
d’acheminement

Principe méthodologique Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination
(support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque).
Une réalisation de phénotype RH-KEL1 consiste à tester les hématies vis-à-vis d’anti-RH2, -RH3, -RH4,
-RH5, -KEL1 monoclonaux et du réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative.
EEQ Oui.
et performances
Fiche 14.3
Le phénotypage étendu
Code NABM 1146
Signification biologique du paramètre la sécurité immuno-hémolytique des transfusions

Le polymorphisme érythrocytaire est immuno- et un suivi immunohématologique de la grossesse.
gène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la Cette analyse est utile :
grossesse et, pour certains groupes, à la trans- • en contexte transfusionnel, la réalisation
plantation incompatible. À côté des antigènes d’un phénotype étendu est indiquée chez tout
explorés par le groupage ABO-RH1 et le phéno- receveur polytransfusé potentiel (hémopathies,
type RH-KEL1, d’autres antigènes peuvent être hémoglobinopathies) afin d’avoir un résultat
la cible d’anticorps impliqués dans des réactions fiable avant toute transfusion et chez tout receveur
transfusionnelles ou des incompatibilités fœto- présentant un anticorps dirigé contre un ou
maternelles plus ou moins sévères. Parmi eux, on plusieurs antigènes autres que ceux explorés par le
considère ceux qui sont explorés par le phénotype groupage ABO-RH1 et le phénotype RH-KEL1.
étendu qui regroupe les antigènes autres que L’objectif est d’assurer les règles de compatibilité
ceux explorés par le groupage ABO-RH1 et RH- lors de la sélection des concentrés de globules
KEL1, et notamment les antigènes communs rouges en vue d’éviter un conflit si l’anticorps
des systèmes Duffy (FY) (Fya (FY1), Fyb (FY2)), est présent ou de prévenir une allo-immunisation
Kidd (JK) (Jka (JK1), Jkb (JK2)) et MNS (M supplémentaire vis-à-vis d’autres antigènes ;
(MNS1), N (MNS2), S (MNS3) et s (MNS4)). • en contexte obstétrical, la réalisation du phéno-
Les anticorps correspondants qui peuvent appa- type étendu, outre sa contribution au diagnostic
raître à la suite d’une stimulation interhumaine d’une éventuelle maladie hémolytique fœtale ou
(transfusion ou grossesse) sont dits immuns et néonatale impliquant les anticorps correspon-
irréguliers. La connaissance du phénotype étendu dants, permet d’anticiper la sélection des produits
des patients permettra de sélectionner les produits sanguins pour la mère ou l’enfant si nécessaire ;
sanguins adéquats en vue de prévenir une allo- • enfin en cas de RAI positive, le phénotype
immunisation ou un conflit et contribuera à étendu contribue à la validation d’anticorps diri-
valider la spécificité d’un anticorps lors de l’étape gés contre les différents antigènes qu’il regroupe.
d’identification d’une recherche d’agglutinines
irrégulières (RAI). On conçoit donc l’intérêt de Place dans la hiérarchie d’un
connaître le phénotype étendu d’un patient dans bilan d’exploration
ces diverses situations. Dans toutes ces situations, le phénotype étendu
demeure une analyse de première intention qui
Objectifs de l’analyse et principales est incontournable et non substituable.
L’objectif de l’analyse est de connaître le résultat
du phénotype étendu d’un patient afin d’assurer

Recommandations pour Examen à réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois).
la qualité du prélèvement Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un phénotype étendu
d’acheminement

Principe méthodologique Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination
(support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque).
Une réalisation de phénotype étendu consiste à tester les hématies vis-à-vis d’anti-FY1, -FY2, -JK1,
-JK2, -MNS3 et MNS4 et du réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative.
EEQ Oui.
et performances
Fiche 14.4
Groupes sanguins en biologie moléculaire
Code RIHN E201

Le polymorphisme érythrocytaire est immuno- indications de prescription
gène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la L’objectif de l’analyse est de déduire le phé-
grossesse et, pour certains polymorphismes, à la notype du génotype dans les situations où les
transplantation incompatible. techniques sérologiques ne sont pas réalisables
L’ensemble des antigènes de groupes sanguins ou insuffisamment sensibles. Comme pour les
(GS) peut être la cible d’anticorps impliqués dans techniques sérologiques de détermination des GS,
des réactions transfusionnelles ou des incompati- la biologie moléculaire a pour but d’assurer la
bilités fœto-maternelles plus ou moins sévères. Un sécurité immunohémolytique des transfusions et
grand nombre de GS peuvent être explorés par les un suivi immunohématologique de la grossesse.
techniques sérologiques avec l’utilisation d’anti- Ces analyses sont réalisées chaque fois qu’il est
corps spécifiquement dirigés contre les antigènes nécessaire de déterminer un groupe sanguin (cf.
de GS, permettant d’obtenir un phénotype. La fiches 14.1, 14.2 et 14.3) :
détermination du phénotype des patients permet • en contexte transfusionnel récent (< 3 mois) :
de sélectionner les produits sanguins adéquats le phénotype ne peut pas être réalisé par séro-
en vue de prévenir une allo-immunisation ou un logie du fait de la présence concomitante de
conflit et contribue à valider la spécificité d’un globules rouges autologues et transfusés. Les
anticorps lors de l’étape d’identification d’une produits transfusés étant déplétés en leucocytes,
agglutinine irrégulière (RAI). Cependant pour le prélèvement réalisé chez un individu transfusé
certains GS, pour lesquels les situations d’allo- ne contient que ses propres leucocytes, et donc
immunisation sont plus rares, il n’existe pas de uniquement son ADN ;
réactifs commerciaux. La connaissance des bases • dans le cas d’un test indirect à l’antiglobuline
moléculaires du polymorphisme de la plupart des positif de type IgG : la plupart des réactifs
GS permet d’obtenir un génotype dont on peut sérologiques sont des IgG. Si les globules rouges
déduire le phénotype. De plus, pour certains GS, d’un individu sont saturés par des auto-anticorps,
et notamment le système RH, il existe des variants notamment au cours des anémies hémolytiques
pouvant être à l’origine de situations d’incompa- auto-immunes, la détermination du phénotype
tibilité. Deux catégories majeures de variants sont par sérologie donne des faux positifs ;
décrites et caractérisées sur le plan moléculaire : • en l’absence de réactifs commerciaux : pour cer-
• les antigènes partiels dépourvus de certains tains groupes sanguins rares ou pour des groupes
épitopes immunogènes : les porteurs exposés à sanguins générant peu fréquemment des allo-
l’antigène complet via la transfusion ou la gros- anticorps, il n’y a pas de réactifs commerciaux. La
sesse peuvent produire un allo-anticorps contre biologie moléculaire est alors utilisée lorsque les
les épitopes non exprimés ; bases moléculaires sont connues ;
• les antigènes affaiblis, caractérisés par une dimi- • pour la caractérisation des antigènes variants/
nution de la réactivité sérologique, mais sans partiels pour lesquels le risque et les conséquences
risque d’immunisation pour le porteur. Les tech- de l’allo-immunisation sont majeurs et une pré-
niques sérologiques d’agglutination ne sont pas vention possible :
suffisamment discriminantes pour caractériser ces – en contexte obstétrical face à un affaiblis-
variants, le recours à la biologie moléculaire est sement d’expression d’un antigène RH, dont
indispensable. on ne peut déterminer s’il s’agit d’un antigène
partiel (qui peut aussi avoir une expression techniques sérologiques d’absorption ne per-
affaiblie). Une porteuse d’un antigène RH1 mettent de conclure à son caractère autologue.
partiel (D partiel) est prise en charge sur le plan La mise en évidence d’un antigène partiel est en
immuno-hématologique comme une femme faveur d’un allo-anticorps.
RH:-1 (D négatif),
– chez les patients drépanocytaires présentant Place dans la hiérarchie d’un
souvent des antigènes RH partiels avec des bilan d’exploration
conséquences d’allo-immunisation sévères,
Le génotype est une analyse de première intention
– lorsqu’un individu produit un anticorps vis-
incontournable et non substituable, mais seule-
à-vis d’un antigène qu’il exprime, sans que les
ment dans les cas mentionnés ci-dessus.

Recommandations pour Sang hépariné contre-indiqué (inhibiteur de PCR).
la qualité du prélèvement Quantité minimale de globules blancs afin de disposer d’assez d’ADN.
d’acheminement
Mode de conservation Réfrigération pendant 1 mois (tests de robustesse à effectuer).
Principe méthodologique Méthodes de biologie moléculaire où le phénotype est déduit du génotype :
- technologies de PCR en temps réel par sondes d’hydrolyse avec discrimination allélique en point
final ;
- technologies de PCR multiplex : élongation des polymorphismes (e-map) ou PCR-SSO (Luminex).
Séquençage après amplification par PCR de fragments d’ADN génomique ou d’ARN.
EEQ Oui.
et performances
du test L’identito-vigilance est majeure mais moins prégnante dans ces tests réalisés dans des conditions
spécifiques et pour des patients particuliers.
Bibliographie du chapitre 14 Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre

2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du
FICHE 14.1 – Le groupage sanguin ABO-RH1 (RhD)
14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6.
Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre
HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion
1999 relatif à la bonne exécution des analyses de
de globules rouges homologues : produits, indica-
biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002
tions alternatives. 2014.
page 8375 texte n° 80.
FICHE 14.3 – Le phénotypage étendu
Clavier B. Le groupage sanguin en question : actualité
et perspectives. Revue française des Laboratoires Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre
2012;42:43–8. 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de
Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du col- biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002
lège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé page 8375 texte n° 80.
par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du col-
2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche lège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé
d’anticorps anti-érythrocytaires. par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février
Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche
2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du d’anticorps anti-érythrocytaires.
14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre
HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du
de globules rouges homologues : produits, indica- 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6.
tions alternatives. 2014. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion
FICHE 14.2 – Le phénotypage RH-KEL1 (Rh-K)
FICHE 14.4 – Groupes sanguins en biologie
moléculaire
Yip SP. Sequence variation at the human ABO locus. Ann
Hum Genet 2002;66:1–27.
Clavier B. Le groupage sanguin en question : actualité
et perspectives. Revue française des Laboratoires
2012;42:43–8.
Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du col-
lège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé
Prager M. Molecular genetic blood group typing by
par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février
the use of PCR-SSP technique. Transfusion 2007;
2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche
47(1 Suppl):54S–9S.
d’anticorps anti-érythrocytaires.
Chapitre 15
Anticorps anti-érythrocytaires

240 Immunohématologie
Fiche 15.1
Recherche d’agglutinines irrégulières (RAI)
Codes NABM 1141, 1131, 1149, 1150
Signification biologique du paramètre d’une RAI réalisée sur un échantillon de moins

La détection des anticorps anti-érythrocytaires de 72 h. Dans certains cas, une extension à
est un élément majeur de la sécurité immuno- 21 jours peut être acceptée, sur prescription
hémolytique des transfusions et du suivi de et sous réserve d’une absence de risque d’allo-
grossesse. En contexte transfusionnel, les anti- immunisation (transfusion ou accouchement)
corps présents dictent les règles de sélection dans les 6 mois précédents. Par ailleurs, l’hémo-
des concentrés de globules rouges (CGR) afin vigilance impose de détecter une allo-immu-
d’éviter un conflit. nisation post-transfusionnelle par la pratique
En contexte obstétrical, les anticorps présents dic- d’une RAI entre 1 mois et 3 mois après une
tent les modalités de suivi de la femme enceinte et transfusion. Enfin, il faut rappeler l’importance,
l’évaluation de leur pouvoir hémolytique pour le pour la sélection des CGR, de la prise en
fœtus et le nouveau-né. compte des anticorps connus même s’ils ne
Deux analyses permettent de détecter ces anti- sont plus détectés par la RAI le jour de la trans-
corps : fusion (« un anticorps un jour, un anticorps
• les anticorps du système ABO sont détectés par toujours »).
le biais du groupage ABO ; • En contexte obstétrical, la réalisation d’une
• les anticorps autres que ABO sont détectés par RAI est obligatoire et a un triple objectif :
la recherche d’agglutinines irrégulières (RAI). – dépister (à 4 reprises chez la femme RH:-1
La RAI a pour objectif de dépister et d’identifier et à 2 reprises chez la femme RH1) et suivre
les anticorps dirigés contres les antigènes autres une allo-immunisation susceptible d’engen-
que ABO en testant le sérum ou le plasma drer une maladie hémolytique fœtale/néona-
du patient vis-à-vis d’hématies humaines non tale,
poolées et spécifiquement sélectionnées sur leur – identifier, chez les femmes RhD négatif,
phénotype. Elle comporte deux étapes, le dépis- celles qui doivent bénéficier d’une immuno-
tage et l’identification. Si le dépistage est positif, prophylaxie (femmes RH:-1, non immuni-
l’identification est obligatoire. sée vis-à-vis de RH1, porteuse d’un enfant
RH1),
– disposer d’un résultat de RAI au moment de
l’accouchement afin d’anticiper la sélection des
CGR si nécessaire pour la mère ou l’enfant.
L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité
immuno-hémolytique des transfusions et un suivi
immunohématologique de la grossesse. Place dans la hiérarchie d’un
• En contexte transfusionnel, compte tenu de bilan d’exploration
l’évanescence des anticorps, la réglementation Dans toutes ces situations, la RAI demeure une
et les recommandations actuelles prévoient de analyse de première intention qui est incontour-
disposer avant chaque transfusion du résultat nable et non substituable.
Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires 241
Nature du Plasma ou sérum (tube EDTA ou tube sec).

prélèvement
Recommandations Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours.
pour la qualité du Extension possible à 21 jours en absence d’allo-immunisation dans les 6 mois précédents.
prélèvement Chez le fœtus, RAI sur prélèvement maternel de moins de 3 jours.
Chez nouveau-né avant 4 mois, RAI sur prélèvement maternel réalisé entre 72 h avant l’accouchement et
4 mois après.
Chez le nouveau-né après 4 mois, idem adulte.
d’acheminement
Principes Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support
méthodologiques filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque).
La technique est un test indirect à l’antiglobuline polyvalente ou anti-IgG dont la sensibilité permet la
détection, au minimum, d’un anti-RH1 < 20 ng/mL.
Le recours aux enzymes protéolytiques peut être utile en cas de mélange d’anticorps, voire obligatoire en
cas d’exploration d’une réaction transfusionnelle immunohémolytique.
EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Ces anticorps sont normalement absents.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, Certains anticorps irréguliers dirigés contre des groupes rares sont plus difficiles à mettre en évidence.
limites du test
Fiche 15.2
Dosage pondéral des agglutinines irrégulières (RAI) dans
le cadre du suivi de grossesse
Code NABM 1150
Signification biologique du paramètre de l’âge de la grossesse, indiquer une transfusion

Les conséquences de la rencontre in vivo entre in utero ou un accouchement prématuré avec une
antigènes érythrocytaires et anticorps sont prise en charge transfusionnelle du nouveau-né.
variables et dépendent de nombreux paramètres
liés aux antigènes, aux anticorps et à la réactivité Objectifs de l’analyse et principales
du système phagocytaire (ou réticulo-endothélial) indications de prescription
qui est propre à l’individu. Le dosage pondéral d’un anticorps anti-érythro-
Ainsi, l’évaluation de sa signification clinique d’un cytaire chez une femme enceinte est un élément
anticorps identifié chez un patient ou un donneur fondamental d’appréciation du risque immuno-
est un élément fondamental. hémolytique fœtal et de la surveillance de l’allo-
L’un des éléments d’appréciation du risque hémo- immunisation au cours de la grossesse. Il concerne
lytique d’un anticorps est son taux qui peut être les anticorps du système RH et notamment les
estimé de façon semi-quantitative par le titrage ou anticorps de spécificité anti-RH1 (anti-D), anti-
par le dosage pondéral. RH2 (anti-C) et anti-RH4 (anti-c). Ces allo-
En contexte d’incompatibilité fœto-maternelle, anticorps susceptibles d’entraîner une maladie
le dosage pondéral permet d’exprimer la concen- hémolytique fœtale et/ou néonatale doivent être
tration en µg/mL ou U.CHP/mL (Centre dosés dès que leur titre atteint un seuil critique, et
national de référence en hémobiologie périnatale, ce dès la 12e semaine d’aménorrhée.
CNRHP) ou UI/mL d’anticorps de nature IgG,
en particulier les anticorps du système RH.
Cette technique ne dépend pas de l’affinité de Place dans la hiérarchie d’un
l’anticorps qui est évaluée par le titrage. L’asso- bilan d’exploration
ciation titrage et dosage pondéral permet une éva- Il s’agit d’une analyse de deuxième intention. Elle
luation complémentaire du risque hémolytique doit être mise en œuvre lorsque le titrage atteint
fœtal d’un d’anticorps. un seuil dit critique (par exemple 16 pour l’anti-
L’atteinte de seuils dangereux impose de recher- RH1 ou 4 pour l’anti-RH4). Elle doit être répétée
cher une souffrance fœtale pouvant, en fonction au même rythme que le titrage de ces anticorps.
Nature du prélèvement Plasma ou sérum, tube EDTA ou tube sec.

Recommandations pour la Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours
qualité du prélèvement Prélèvement précédent (n-1) congelé à – 20 °C.
Mode de conservation Réfrigération à + 4 °C pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer).
Principes méthodologiques En vue d’une comparaison de résultats dans le suivi, les dosages pondéraux pour une femme
enceinte donnée doivent tous être réalisés dans le même laboratoire.
Il s’agit d’une technique d’agglutination automatisée qui est basée sur un dosage comparatif par
rapport à un standard international anti-RH1 et de ses dilutions de concentration connue.
Deux variantes techniques sont mises en œuvre :
- la variante « 2 temps » où l’ensemble des sous-classes d’IgG anti-RH est dosé ;
- la variante « 1 temps » dans laquelle les anticorps anti-RH de sous-classe IgG3 sont détruits par
un contact direct avec des enzymes. Elle permet l’évaluation des anticorps de haute affinité dont la
concentration apparente est souvent supérieure à celle obtenue dans la technique « 2 temps ».
Le seuil dangereux est de 0,7 µg/mL pour les anti-RH1 et 3 µg/mL pour les anti-RH4.
Type de méthode Méthode automatique.
Type de test Mesure semi-quantitative.
Tout dosage est effectué en parallèle :
- d’un redosage de l’échantillon précédent conservé congelé à – 20 °C ;
- d’un standard anti-RH1 et de ses dilutions dont les concentrations sont connues.
EEQ Non.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, limites du Les redosages pour le suivi de l’évolution des taux d’anticorps imposent des prélèvements
test permettant de stocker suffisamment d’échantillons.
Fiche 15.3
Épreuve directe de compatibilité au laboratoire
Code NABM 1152
Signification biologique du paramètre dans les mêmes conditions techniques que la RAI,
La détection des anticorps anti-érythrocytaires est l’hématie de la poche vis-à-vis du sérum/plasma
un élément majeur de la sécurité immuno-hémo- du receveur. L’obtention d’une réaction négative
lytique des transfusions. Les anticorps présents permet de déclarer l’unité « compatible » avec la
dictent les règles de sélection des concentrés de mention de qualification « CGR compatibilisé ».
globules rouges (CGR) afin d’éviter un conflit, Il convient de rappeler que cette analyse n’est pas
en évitant d’apporter les antigènes correspon- indiquée en absence d’allo-immunisation.
dant aux anticorps détectés chez le patient. Dans • Chez le patient drépanocytaire, même en
certaines situations, il convient de s’assurer que absence d’allo-immunisation « apparente ». En
le CGR sélectionné est bien compatible avec le effet, ces patients sont dans la majorité des cas
sérum/plasma du receveur par la pratique d’une originaires d’Afrique subsaharienne. Souvent,
épreuve de compatibilité au laboratoire. C’est une pour des raisons de compatibilité, des unités
véritable RAI « personnalisée » où le panel de la issues de donneurs de même origine sont néces-
RAI est remplacé par les hématies de la poche saires. Or la distribution préférentielle africaine de
sélectionnée. certains antigènes de groupes sanguins (RH10,
RH20, Jsa, etc.) expose ces patients à une allo-
immunisation qui n’est pas détectable par la RAI
de routine, ces antigènes étant absents des panels
utilisés. Aussi, afin de rattraper cette situation
L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité d’incompatibilité si nocive pour le drépanocytaire,
immuno-hémolytique des transfusions. Elle est une épreuve de compatibilité est réalisée même si
réalisée dans deux situations. la RAI est apparemment négative.
• Chez un patient allo-immunisé avec une RAI
positive ou avec simplement avec un anticorps
connu dans son historique. Dans ces conditions,
il convient de sélectionner un CGR dépourvu de
l’antigène correspondant à l’anticorps, suivi d’une Dans toutes ces situations, l’épreuve de compati-
validation de cette sélection par la réalisation d’une bilité demeure une analyse de première intention
épreuve de compatibilité au laboratoire en testant, qui est incontournable et non substituable.
Nature du prélèvement Plasma ou sérum (tube EDTA ou tube sec).

Recommandations pour la Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours avec les mêmes exigences que pour la RAI.
Principes méthodologiques L’épreuve de compatibilité repose sur les mêmes méthodes que la RAI. Méthodes immunologiques
où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque
ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque).
La technique est un test indirect à l’antiglobuline polyvalente ou anti-IgG dont la sensibilité permet
la détection, au minimum, d’un anti-RH1 < 20 ng/mL.

EEQ Oui.
Valeurs de référence/Inter- Ces anticorps sont normalement absents.
Causes d’erreur, limites L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou d’auto-anticorps
du test peut gêner le test (voir test d’adsorption).
Fiche 15.4
Test direct à l’antiglobuline (TDA)
Signification biologique du paramètre de préciser la cause (immunologique ou non) de

La survenue d’un syndrome hémolytique impose l’hémolyse. Il permet ainsi de mettre en évidence
de préciser les modalités de destruction des une sensibilisation in vivo des hématies :
hématies. On définit classiquement des causes • par un auto-anticorps lié à une anémie hémoly-
corpusculaires (anomalie de la membrane, des tique auto-immune (AHAI) ;
enzymes ou de l’hémoglobine) et extra corpuscu- • par un allo-anticorps lié à une incompatibilité
laires (immunologiques, toxiques et mécaniques). transfusionnelle ou une maladie hémolytique
La définition d’une cause immunologique ou du nouveau-né par incompatibilité fœto-mater-
non immunologique peut représenter une autre nelle ;
approche de l’exploration étiologique centrée sur • par un hétéro anticorps au cours d’une anémie
la réalisation d’un test direct à l’antiglobuline hémolytique médicamenteuse.
en cas de présence de stigmates d’hémolyse. La • On parle aussi de « test de Coombs ».
positivité de ce test, en attestant la sensibilisation
in vivo des hématies par des anticorps et/ou du Place dans la hiérarchie d’un
complément, confirme l’origine immunologique bilan d’exploration
d’une hémolyse.
En cas de survenue d’une hémolyse dans toutes
ces situations pathologiques, le test direct à l’anti-
Objectifs de l’analyse et principales globuline demeure une analyse de première inten-
indications de prescription tion qui est incontournable et non substituable. Si
L’objectif de ce test est de détecter une sensi- le TDA détecte la sensibilisation in vivo des héma-
bilisation in vivo des hématies par un anticorps ties, il ne donne pas le nom de la spécificité de
et/ou le stigmate de son passage par la présence l’anticorps. C’est l’élution directe qui, pratiquée
d’une fraction du complément (C3d). Il doit être secondairement, permettra de définir l’anticorps
indiqué devant tout syndrome hémolytique afin coupable du conflit in vivo.

Recommandations pour la NA.
Principes méthodologiques Méthode immunologique qui repose sur l’utilisation d’antiglobulines humaines reconnaissant des
marqueurs isotypiques humains d’immunoglobulines ou de fractions du complément. La fixation
de l’antiglobuline sur ces marqueurs est révélée par une agglutination des hématies du patient
sur support filtration ou en tube. On utilise classiquement de façon simultanée et séparée une
anti-IgG et une anti-C3d complétées par un réactif témoin qui doit être négatif. Plus rarement,
une anti-IgA est utilisée. Pour ce qui est des IgM, la détection de C3d atteste de son passage.
Une image de double population est possible en contexte d’incident transfusionnel.
Type de méthode Méthodes manuelle et automatisée.

EEQ Oui.
Valeurs de référence/ Ce test est normalement négatif.
Interprétation et performances
Causes d’erreur, limites du test L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou
d’auto-anticorps peut gêner le test (voir test d’adsorption).
Fiche 15.5
Titrage des agglutinines froides
Signification biologique du paramètre tinine froide peut aussi être explorée (anti-I ou
Les anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI) anti-i), mais cette information n’a pas d’impact
sont réparties en AHAI « chaudes » et en AHAI clinique.
« froides ». Le titrage des agglutinines froides est donc une
Dans les AHAI « froides », le test direct à analyse de l’exploration d’une hémolyse immu-
l’antiglobuline (TDA) est classiquement de type nologique.
complément exclusif, révélant l’implication d’une
IgM fixant le complément. Les auto-anticorps Objectifs de l’analyse et principales
froids réagissent plus fortement à + 4 °C qu’à indications de prescription
des températures plus élevées. Dans les AHAI L’objectif du titrage des agglutinines froides est le
à auto-anticorps froids, c’est-à-dire présentant diagnostic et le suivi d’une anémie hémolytique à
une réactivité supérieure aux basses tem- auto-anticorps froids.
pératures vis-à-vis des hématies tests (+ 4 °C,
+ 22 °C, comparativement à + 37 °C), le titrage Place dans la hiérarchie d’un
a un intérêt clinique. En effet, il permet de bilan d’exploration
différencier les anticorps « froids » sans signi-
fication pathologique des anticorps patholo- Le titrage des agglutinines froides est une épreuve
giques dont le titre dépasse 1/64 à + 4 °C, de seconde intention après réalisation du TDA
avec des titres souvent beaucoup plus élevés et (positif de type complément ou négatif) dans
une amplitude thermique importante (réactivité un contexte de survenue d’une hémolyse hors
présente aussi à + 37 °C). La spécificité de l’agglu- contexte transfusionnel et obstétrical.
Nature du prélèvement Prélèvement de 2 tubes secs de 7 mL de sang et de 1 tube de 7 mL sur EDTA.

Recommandations pour la Le prélèvement doit être placé pendant 2 heures à + 37 °C dès son arrivée au laboratoire et
qualité du prélèvement décanté immédiatement à la sortie de l’étuve.
Mode de conservation 48 heures.
Principe méthodologique Le titrage est réalisé sur des hématies traitées à la papaïne et/ou natives.
La technique classique décrite ici est celle réalisée en micotubes de verre avec lecture de
l’agglutination sous microscope. Il s’agit de la technique de référence.
Des techniques en gel filtration, plus simples de réalisation, ont aussi été validées.
Une dilution géométrique de raison 2 du sérum est réalisée dans 10 tubes en verre, sous
un volume de 0,5 mL. Une série de titrages est réalisée à + 4 °C et une autre à + 37 °C,
en déposant 1 goutte d’hématies sélectionnées dans chaque tube. Les hématies sont de 3
catégories : des globules rouges d’adultes (exprimant l’antigène I), des globules rouges de
nouveau-nés (exprimant uniquement l’antigène i), les propres globules rouges du patient
(provenant du tube EDTA).
Après 2 heures à + 4 °C et à + 37 °C, une goutte de chaque tube est déposée entre lame et
lamelle et lue au microscope pour rechercher l’agglutination.
Le résultat du titrage est rendu à + 4 °C et à + 37 °C.

EEQ Oui.
Causes d’erreur, limites du test L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou
d’auto-anticorps peut gêner le test (voir test d’adsorption).
Fiche 15.6
Épreuve d’adsorption d’anticorps anti-érythrocytaires
Code NABM 1156
Signification biologique du paramètre de différencier un auto-anticorps d’un allo-anti-

Les anticorps anti-érythrocytaires peuvent être corps.
des auto-anticorps ou des allo-anticorps. Enfin, lorsqu’il existe un mélange d’allo-anti-
Les auto-anticorps sont produits au cours des corps, la RAI est difficilement interprétable et des
anémies hémolytiques auto-immunes. Ils peuvent adsorptions différentielles des différents anticorps
aussi être présents sans pour autant induire une sont une aide à l’identification du mélange. Deux
pathologie. Ils sont fréquemment dirigés contre épreuves peuvent être réalisées dans ce contexte :
des antigènes de fréquence élevée du globule l’allo-adsorption et l’auto-adsorption.
rouge (système RH, Bande 3, Glycophorine A) de
telle sorte que, lors de la recherche d’agglutinines Objectifs de l’analyse et principales
irrégulières (RAI), ils réagissent avec toutes les indications de prescription
hématies-tests. L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité
Les allo-anticorps anti-érythrocytaires sont pro- immuno-hémolytique des transfusions en identi-
duits au décours d’une transfusion phéno-incom- fiant un ou des allo-anticorps et en différenciant
patible ou pendant la grossesse. Leur détection est les allo-anticorps des auto-anticorps.
un élément majeur de la sécurité immuno-hémo- Une autoadsorption est réalisée pour :
lytique des transfusions et du suivi de grossesses. • confirmer le caractère autologue de réactions
En contexte transfusionnel, les anticorps présents spécifiques ou non spécifiques retrouvées à la
dictent les règles de sélection des concentrés de RAI, avec un témoin de RAI (plasma contre les
globules rouges (CGR) afin d’éviter un conflit. propres hématies du patient) positif ou négatif ;
En contexte obstétrical, les anticorps présents dic- • détecter des allo-anticorps après adsorption
tent les modalités de suivi de la femme enceinte et d’auto-anticorps.
l’évaluation de leur pouvoir hémolytique pour le Une allo-adsorption est réalisée pour permettre la
fœtus et le nouveau-né. détection d’allo-anticorps après adsorption :
En présence d’auto-anticorps, les allo-anticorps • d’auto-anticorps ;
sont difficilement identifiables à la RAI car ils • d’allo-anticorps agglutinant la majorité ou la
sont masqués par la réactivité des auto-anticorps. totalité des hématies : mélange ou anticorps
De plus, dans certains cas, il n’est pas toujours reconnaissant un antigène de fréquence élevée.
possible de déterminer à la RAI si un anticorps
est un allo-anticorps (d’intérêt transfusionnel ou Place dans la hiérarchie d’un
obstétrical) ou un auto-anticorps dont l’impact bilan d’exploration
dans ces situations est plus faible.
L’épreuve d’absorption permet d’identifier les Les épreuves d’adsorption sont des analyses de
allo-anticorps masqués par un auto-anticorps, et seconde intention réalisées au décours d’une RAI.
Elles relèvent de la décision du biologiste.
Nature du prélèvement Recueil de 2 à 3 tubes de 7 mL sur EDTA ou tube sec traité.

Recommandations pour la Traitement dans la semaine suivant le prélèvement.

Principe méthodologique La détection des anticorps repose sur des méthodes immunologiques où la réaction
antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou
par immunoadhérence (support microplaque).
La méthode consiste en 2 étapes :
- adsorption du sérum ;
- RAI réalisée sur le sérum ou le plasma adsorbé pour identifier les anticorps d’intérêt (cf. fiche
15.1).
Pour l’allo-adsorption, des hématies adsorbantes, sélectionnées en fonction de leur phénotype
érythrocytaire, sont incubées avec le sérum ou le plasma à tester. L’adsorbat est ensuite recueilli
après centrifugation du milieu réactionnel. Ce cycle est réalisé plusieurs fois.
Pour l’auto-adsorption, le principe est le même, mais les hématies adsorbantes sont les propres
hématies du patient.
Dans tous les cas, pour une meilleure efficience de l’adsorption, les hématies peuvent être
prétraitées par des enzymes protéolytiques.
EEQ Oui.
Causes d’erreur, limites du Test manuel « maison » dépendant des conditions de réalisation et nécessitant une grande
test expertise.
Fiche 15.7
Épreuve d’élution d’anticorps à partir de globules rouges
Code NABM 1155

La survenue d’un syndrome hémolytique impose indications de prescription
de préciser les modalités de destruction des héma- L’objectif de ce test est d’isoler et d’identifier des
ties. On définit classiquement des causes corpus- anticorps responsables d’une sensibilisation in
culaires (anomalie de la membrane, des enzymes vivo des hématies. Les champs d’applications sont
ou de l’hémoglobine) et extra corpusculaires les suivants :
(immunologiques, toxiques et mécaniques). Le • TDA positif chez un nouveau-né ;
test direct à l’antiglobuline permet de confirmer • notion de syndrome hémolytique en contexte
l’origine immunologique d’une anémie hémo- transfusionnel ou non, quelque soit le résultat du
lytique, mais dans certaines circonstances, il est TDA ;
nécessaire d’identifier la spécificité des anticorps • notion d’incident transfusionnel ou d’ineffica-
ayant sensibilisé les hématies. L’épreuve d’élution cité transfusionnelle ;
permet de « décrocher » ces anticorps des héma- • TDA positif avec antécédent transfusionnel de
ties et ensuite de les identifier par une recherche moins de 3 mois.
d’agglutinines irrégulières (RAI). Enfin, les
limites de sensibilité du test direct à l’antiglobu-
line (TDA, test de Coombs) ne permettent pas bilan d’exploration
toujours de confirmer la sensibilisation. L’épreuve L’épreuve d’élution est une épreuve de seconde
d’élution, en concentrant les éventuels anticorps intention après réalisation du TDA, qu’il soit positif
sensibilisants, peut permettre de confirmer que ou négatif, dans un contexte de survenue d’une
les hématies ont été sensibilisées in vivo par des hémolyse. Elle est réalisée sur décision du biolo-
anticorps. giste.
Nature du prélèvement Tube de 7 mL de sang sur EDTA.

Recommandations pour la Traitement dans les 72 heures.
Mode de conservation Pendant 3 jours à température ambiante.
Principe méthodologique La technique la plus utilisée est la technique d’élution à l’acide (digitonine acide). Des trousses
commerciales existent à cet effet.
Lorsque les anticorps fixés sont susceptibles d’être des anti-A ou anti-B de type IgG dans le
cadre d’une incompatibilité fœto-maternelle, une technique d’élution par choc osmolaire par
congélation-décongélation brutale peut être utilisée, mais elle est peu efficace pour les autres
types d’anticorps.
Dans tous les cas l’éluat, récupéré par centrifugation du milieu réactionnel, est testé en technique
de RAI (cf. fiche 15.1) vis-à-vis des hématies O du panel, exprimant tous les antigènes de groupes
sanguins d’intérêt, mais aussi vis-à-vis d’hématies A et B.

EEQ Oui.
Causes d’erreur, limites Les limites sont représentées par la quantité parfois faible d’anticorps élués ou une élution
défectueuse.
Bibliographie du chapitre 15 HAS. Synthèse des recommandations professionnelles.

FICHE 15.1 – Recherche d’Agglutinines Irrégulières Suivi et orientation des femmes enceintes en fonction
(RAI). des situations à risque identifiées. Mise à jour mai
Décret no 92-143 du 14 février 1992 relatif aux examens 2016.
obligatoires prénuptial, pré et postnatal. JORF n° 40 FICHE 15.4 – Test Direct à l’Antiglobuline (TDA).
du 16 février 1992 page 2505. Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre
Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de
1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002
biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page page 8375, texte n° 80.
8375, texte n° 80. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre
sfar.org/referentiels/2011. 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du
Hémovigilance : Décret n( 2014-1042 du 12 septembre 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6.
2014 relatif au sang humain. JORF n( 0213 du 14 HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion
septembre 2014 page 15115, texte n° 6. de globules rouges homologues : produits, indica-
HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion tions alternatives. 2014.
Parker V, Tormey CA. The direct antiglobulin test :
indications, interpretation, and pitfalls. Arch Pathol
HAS. Synthèse des recommandations professionnelles. Suivi
Lab Med 2017;141:305–10.
et orientation des femmes enceintes en fonction des
FICHE 15.5 – Titrage des agglutinines froides.
situations à risque identifiées. Mise à jour mai 2016.
GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du
FICHE 15.2 – Dosage pondéral des agglutinines
26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des
irrégulières (RAI) dans le cadre du suivi de
grossesse. analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai
Décret no 92-143 du 14 février 1992 relatif aux examens 2002 page 8375, texte n° 80.
obligatoires prénuptial, pré et postnatal. JORF n° 40 Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre
du 16 février 1992 page 2505. 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du
GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6.
26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion
analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai de globules rouges homologues : produits, indica-
2002 page 8375, texte n° 80. tions alternatives. 2014.
Huguet-Jacquot S, Toly-Ndour C, Cortey A, et al. Diag- Berentsen S, Randen U, Tjønnfjord GE. Cold agglutinin-
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FICHE 15.3 – Épreuve directe de compatibilité au HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion
laboratoire. de globules rouges homologues : produits, indica-
Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre tions alternatives. 2014.
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Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre FICHE 15.7 – Épreuve d’élution d’anticorps à partir
2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du de globules rouges.
14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. Johnston MF, Belota MK. Determination of need for
Décision du 20 octobre 2010 fixant la liste et les caractéris- elution studies for positive direct antiglobulin
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de globules rouges homologues : produits, indica- antibodies in acid eluates with the gel microcolumn
tions alternatives. 2014. assay. Transfusion 2002;42:698–701.
Chapitre 16
Autres anticorps anti-éléments
figurés du sang

Fiche 16.1
Recherche d’anticorps dirigés contre la membrane des
polynucléaires neutrophiles
Code NABM 0161
Signification biologique du paramètre et du nouveau-né. Il s’agit le plus souvent d’anti

Les anticorps dirigés contre la membrane des HNA-1 (anti-HNA-1a/NA1, anti-HNA-1b/
polynucléaires neutrophiles peuvent être soit : NA2, plus rarement anti-HNA-1c/SH ou anti-
• des auto-anticorps dirigés contre les glyco- HNA-1d), voire d’anti-HNA-2 ;
protéines de la membrane du polynucléaire neu- • réactions transfusionnelles de type TRALI
trophile (essentiellement CD16/FcγRIIIb et (Transfusion Related Acute Lung Injury). Les
CD177/NB1), ou plus spécifiquement contre les anticorps anti-HNA sont à rechercher chez
antigènes HNA (Human Neutrophil Antigens) le patient, mais surtout chez les donneuses
exprimés par ces glycoprotéines (essentiellement éventuellement impliquées. L’anticorps anti-
HNA-1a/NA1 et HNA-1b/NA2, qui sont des granuleux le plus souvent retrouvé est un
polymorphismes de FcγRIIIb) ; anti-HNA-3a, mais on observe aussi des anti-
• des allo-anticorps dirigés contre les antigènes HNA-3b, anti-HNA-1 et anti-HNA-2 ;
des groupes granulocytaires HNA. Cinq sys- • réactions post-transfusionnelles de type frisson-
tèmes sont décrits à ce jour : HNA-1 (antigènes hyperthermie ;
HNA1a/NA1, HNA-1b/NA2, HNA-1c/SH et • neutropénie inexpliquée post greffe de cellules
HNA-1d) ; HNA-2 ; HNA-3 (antigènes HNA-3a souches hématopoïétiques.
et HNA-3b) ; HNA-4 (antigènes HNA-4a et Toute mise en évidence d’anti-HNA doit être
HNA-4b) ; HNA-5 (antigènes HNA-5a et confrontée au type HNA des sujets (patient ou
HNA-5b) ; donneur) et au typage HNA de la cible. Il s’agit
• des iso-anticorps (rares) anti-CD16 chez les du nouveau-né en cas de neutropénie néonatale,
sujets déficitaires en FcγRIIIb. du patient en cas d’anti-HNA identifié chez une
Les allo-anticorps ne sont désormais présents que donneuse impliquée dans un TRALI classique,
chez des donneuses allo-immunisées pendant la exceptionnellement de la donneuse si on suspecte
grossesse, en raison de la transfusion de produits un TRALI inversé avec anti-HNA identifié chez le
déleucocytés et de l’exclusion du don des patients patient.
ayant un passé transfusionnel.
indications de prescription • Dans l’exploration de suspicion de TRALI,
Un premier objectif de l’analyse est de rechercher et la recherche d’anticorps anti-HLA de classe I
identifier des auto-anticorps dirigés contre la mem- et de classe II chez le receveur, et surtout
brane des polynucléaires neutrophiles dans l’explo- chez la/les donneuses potentiellement impli-
ration des neutropénies de l’adulte et de l’enfant où quée(s), est l’examen de première intention.
une cause auto-immune est suspectée (voir ci-dessus La recherche d’anti-HNA est réalisée dans un
les anticorps les plus souvent impliqués). deuxième temps, systématiquement selon les
Un second objectif est de détecter et identifier des dernières recommandations. À noter que les
allo-anticorps anti-HNA, dans les cas de : porteuses d’anti-HNA ont aussi souvent une
• suspicion de neutropénie néonatale par allo- immunisation anti-HLA.
immunisation fœto-maternelle. Les anticorps • Dans l’exploration d’une neutropénie néona-
anti-HNA sont à rechercher chez la mère, en tale (recherche d’allo-anticorps) ou d’une neu-
parallèle des typages HNA comparatifs de la mère tropénie de l’adulte et de l’enfant (recherche
Chapitre 16. Autres anticorps anti-éléments figurés du sang 257
d’auto-anticorps), la place de ces examens est gine auto-immune, l’absence d’auto-anticorps

fonction de l’ensemble du dossier clinico-biolo- identifié n’exclut pas le diagnostic.
gique. Dans les suspicions de neutropénie d’ori-
Nature du prélèvement Sérum du patient (tube sec) pour la recherche d’anticorps antigranuleux circulants.
À noter : la recherche d’anticorps fixés sur les polynucléaires neutrophiles (test direct prélevé sur EDTA) est
exceptionnellement réalisée et tend à être abandonnée, car souvent non interprétable et non contributive en
raison de la fragilité des cellules, de l’absence de spécificité (pas d’identification possible) et des faux positifs.
Recommandations Prélèvement primaire sur tube sec inférieur ou égal à 4 jours.
pour la qualité du
prélèvement
Contraintes d’achemi- Tubes primaires acheminés dans les 4 jours à température ambiante ou sérum décanté après
nement prélèvement, congelé et acheminé congelé.
Mode de conservation Robustesse à tester.
Par précaution et en raison des contraintes techniques dépendant quotidiennement des donneurs de
cellules granuleuses fraîches, de phénotype HNA défini, pour constituer les panels, les sérums sont
décantés, aliquotés et congelés, pour éviter les cycles de congélation/décongélation.
Principe méthodolo- Il faut réaliser trois techniques « maison » qui sont essentielles, complémentaires et ne se remplacent
gique pas mutuellement. Elles testent le sérum du patient vis-à-vis de panels de cellules granuleuses fraîches
hétérozygotes et homozygotes dans les systèmes HNA connus. Ces techniques sont longues, en
particulier en raison des contraintes de constitution des panels.
- Deux techniques respectivement d’immunofluorescence (Granulocyte Immunofluorescence Test GIFT)
et d’agglutination (Granulocyte Agglutination Test, GAT) sont nécessaires pour le dépistage d’anticorps
anti-granuleux (auto et allo-anticorps circulants), mais peuvent aussi aider à l’identification, voire être la
seule technique d’identification pour certains anticorps purement granuloagglutinants, comme certains
anti-HNA-3 retrouvés dans les TRALI.
- La technique d’immobilisation (Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Granulocyte Antigens,
MAIGA), est essentielle pour l’identification des auto-anticorps circulants anti-glycoprotéines (anti-CD16
et anti-CD177) et des auto- et allo-anticorps anti HNA. À noter qu’il n’y a pas de MAIGA disponible pour
l’identification d’anti-HNA-3. Il s’agit de la capture de la glycoprotéine granulocytaire à l’aide d’anticorps
monoclonaux correspondants et de la mise en évidence de la fixation d’anticorps humains sur cette
glycoprotéine par une technique immuno enzymatique.
Une technique Luminex® a été développée récemment. Elle présente l’avantage d’être rapide et sensible.
Cependant, les comparaisons avec les techniques usuelles montrent d’une part que certains auto-anticorps
et certains anticorps granuloagglutinants ne sont pas identifiés en Luminex®, et d’autre part que l’on peut
noter certains faux positifs aberrants. Cette technique ne peut pas remplacer les techniques classiques
manuelles mais peut être d’un apport complémentaire intéressant, et sa place reste encore à définir.
Type de test Mesures qualitatives (GIFT, GAT) ou qualitatives à données quantifiables (MAIGA, Luminex®).
CIQ négatifs et positifs « maison » pour les techniques de GIFT, GAT et MAIGA.
EEQ Oui.
Interprétation et La GIFT est une technique sensible, mais non spécifique. Elle peut être réalisée en cytométrie en flux
performances ou en lecture en microscopie de fluorescence. La GAT est une technique non spécifique, qui ne met en
évidence que les anticorps de type granuloagglutinants. La lecture s’effectue en microscopie inversée.
Le MAIGA est une technique moins sensible, mais spécifique. Il n’existe aucune trousse commerciale
pour ces techniques de GIFT, GAT ou MAIGA.
Causes d’erreur, limites Faux positifs et faux négatifs justifiant l’utilisation de plusieurs techniques.
Fiche 16.2
Recherche d’anticorps dirigés contre les plaquettes
Signification biologique du paramètre dépistage des anticorps fixés sur les plaquettes
Les anticorps anti-plaquettes peuvent être soit : (sensible mais non spécifique), les kits ELISA
• des auto-anticorps fixés in vivo sur les plaquettes (plus rapides que le MAIPA, mais ne répondant
ou circulants. Dans ce cas, il s’agit d’anticorps pas à tous les besoins), la technologie Luminex®
dirigés spécifiquement contre les glycoprotéines (plus rapide que le MAIPA) conçue pour l’identi-
de la membrane plaquettaire, essentiellement fication des allo-antiHPA d’intérêt transfusionnel
GpIIbIIIa, mais aussi GpIbIX et + GpIaIIa ; uniquement.
• des allo-anticorps circulants. Il s’agit alors
d’anticorps dirigés spécifiquement contre un/des Objectifs de l’analyse et principales
antigènes de groupe plaquettaires (Human Plate- indications de prescription
let Antigens, HPA), qui sont des polymorphismes L’objectif de l’analyse est :
des mêmes glycoprotéines et de la molécule • de détecter et identifier des allo-anticorps anti-
CD109. Les systèmes HPA sont des systèmes bi- plaquettes circulants dans le cadre de thrombo-
alléliques avec un allèle « a » de haute fréquence pénies fœtales/néonatales par allo-immunisation
et un allèle « b » de basse fréquence. Un sujet est materno-fœtale, d’état réfractaire aux transfusions
HPA-aa, ou ab, ou bb, et peut s’immuniser contre plaquettaires, de réaction post-transfusionnelle de
l’antigène qui lui est étranger lors d’une trans- type fièvre et frissons, de thrombopénie prolongée
fusion, d’une grossesse ou d’une greffe. Vingt- post greffe de cellules souches hématopoïétiques
neuf systèmes HPA ont été décrits à ce jour. ou de suspicion de purpura post-transfusionnel.
Seuls HPA-1, HPA-3, HPA-5, et éventuellement Tout allo-antiHPA identifié devra être confronté
HPA-2 et HPA-15 sont d’intérêt transfusionnel ; au typage HPA du patient. La fiabilité de l’identi-
• des iso-anticorps (rares), comme les anti-GpII- fication des allo-antiHPA est primordiale, à la fois
bIIIa circulants dans le contexte particulier de la pour adapter la prise en charge transfusionnelle
maladie de Glanzmann, ou les anti-CD36 (GpIV) plaquettaire, mais aussi, dans le cas des allo-
dans le cadre de sujets de phénotype plaquettaire immunisations fœto-maternelles, pour assurer la
déficitaire en CD36. Ces patients peuvent s’iso- prise en charge anténatale spécifique et adaptée
immuniser après transfusion ou grossesse. des grossesses suivantes ;
Plusieurs techniques sont à ce jour disponibles, • de rechercher des auto-anticorps anti-pla-
mais la technique de référence (gold standard) est quettes spécifiques, fixés et circulants, lors de
le MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immo- l’exploration d’une thrombopénie de l’adulte ou
bilization of Platelet Antigens). Le MAIPA met de l’enfant.
en évidence les anticorps fixés (MAIPA direct)
ou circulants (MAIPA indirect), en dépistage
sur les plaquettes de panels hétérozygotes et en
identification sur les plaquettes de panel homo- bilan d’exploration
zygotes. Le MAIPA est le seul test conçu à la fois Dans l’exploration d’une thrombopénie fœtale/
pour la recherche des auto- et des allo-anticorps néonatale (chez un nouveau-né par ailleurs clini-
anti-plaquettes, mais aussi des anticorps privés quement sain) ou d’une suspicion de purpura post-
(en cross-match entre sérum maternel et pla- transfusionnel, la recherche d’allo-antiHPA est une
quettes paternelles). Il est également adaptable à analyse incontournable, de première intention, et
la recherche spécifique d’anti-HPA-15, contrai- non substituable. On recherchera en particulier un
rement à toutes les autres techniques. Parmi ces allo-antiHPA-1a, mais de nombreuses spécificités
dernières, on peut citer : la cytométrie en flux de peuvent être en cause. Dans l’exploration des
thrombopénies néonatales, la recherche d’anti- Dans l’exploration d’une thrombopénie de l’adulte

HPA est réalisée chez la mère de l’enfant. ou de l’enfant, la recherche d’auto-anticorps n’est
Dans l’exploration d’un état réfractaire ou ni nécessaire ni suffisante pour le diagnostic de
de réactions post-transfusionnelles (RPT), la purpura thrombopénique immunologique (PTI),
recherche d’anti-HLA est l’analyse de première qui repose sur un faisceau d’arguments cliniques
intention. La recherche d’allo-antiHPA est et biologiques. Cette recherche est utile en cas
indiquée en cas de négativité de la recherche de difficulté DIAGNOSTIQUE et quand elle
des anti-HLA ou de la persistance de mauvais met en évidence une spécificité reconnue anti-
rendements transfusionnels ou de RPT malgré glycoprotéine plaquettaire. Un résultat négatif
l’attribution de plaquettes HLA compatibles. n’exclut pas le diagnostic. Dans ce contexte, la
Dans certains cas, la recherche d’anti-HPA peut recherche des auto-anticorps fixés (test direct)
être réalisée d’emblée, en parallèle de celle de est généralement plus contributive que celle des
première intention des anti-HLA, à l’initiative auto-anticorps circulants (en l’absence de trans-
du biologiste, en fonction des circonstances fusions plaquettaires dans les 3 jours précédents
cliniques et biologiques. ou de taux effondré < 10 G/L). En pratique, il
est habituel de rechercher les deux.
Nature du prélèvement Test direct : Plaquettes du patient, isolées à partir de prélèvement sur tube EDTA.
Test indirect : Plasma ou sérum du patient (tube EDTA ou tube sec). Attention aux conditions
pré-analytiques spécifiques requises pour la technique utilisée.
Recommandations Test direct : Prélèvement inférieur ou égal à 48 heures.
pour la qualité du Test indirect : Prélèvement inférieur ou égal à 4 jours.
prélèvement
Contraintes Tubes primaires acheminés à température ambiante.
d’acheminement
Mode de conservation Attention : voir les conditions préanalytiques spécifiques des techniques utilisées, précisées par le
fournisseur, ainsi que les tests de robustesse à effectuer localement.
Les tests directs doivent être réalisés aussi rapidement que possible après avoir isolé les plaquettes.
Pour les tests indirects :
- MAIPA : réfrigération pendant 14 jours possible après avoir décanté les sérums et/ou plasma, puis
congélation ;
- ELISA et Luminex® : réfrigération 48 h possible après avoir décanté puis congélation, ou congélation
d’emblée des sérums (tests de robustesse à effectuer).
Principes 1) MAIPA (technique de référence) : capture d’un antigène plaquettaire à l’aide d’anticorps monoclonaux
méthodologiques de souris dirigés contre la glycoprotéine plaquettaire qui en est le support, et mise en évidence de la
fixation d’anticorps humains sur cet antigène par une technique immuno-enzymatique.
2) ELISA : glycoprotéines purifiées, fixées dans les puits dans lesquels on ajoute le sérum à tester. La
présence d’un anticorps sera mise en évidence par une technique immunoenzymatique.
3) Luminex® : glycoprotéines purifiées, de typage HPA connu, fixées sur des billes fluorescentes mises
en présence du sérum à tester, puis d’une anti-immunoglobuline humaine couplée à la phycoérythrine
(PE). La mise en évidence de la fixation d’un anticorps sur la bille et son identification sont possibles
grâce à deux faisceaux laser : l’un identifiant la bille, l’autre la positivité de la bille après excitation de la
PE.
Type de méthode Méthode manuelle, automatisable.

Type de test Mesure qualitative à données quantifiables.
CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA)
CIQ négatif et positif fournis dans les trousses.
EEQ Oui.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, limites Faux positifs et faux négatifs justifiant l’utilisation de plusieurs techniques.
Bibliographie du chapitre 16 FICHE 16.2 – Recherche d’anticorps dirigés contre

FICHE 16.1 – Recherche d’anticorps dirigés contre les plaquettes
la membrane des polynucléaires neutrophiles GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du
Tazzari PL, Rondelli D, Re F, et al. Antibodies reactive 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des
with neutrophils following allogeneic haemato- analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai
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Chapitre 17
Cytogénétique hématologique

266 Oncologie moléculaire hématologique
Fiche 17.1
Caryotype onco-hématologique
Code NABM 0906
Signification biologique du paramètre (n’existant que dans les cellules tumorales) et clo-
Le caryotype consiste en l’étude des chromosomes nales (les mêmes anomalies sont retrouvées dans
d’une cellule ou d’un clone cellulaire. Dans les toutes les cellules malignes issues d’une seule cellule
hémopathies malignes, le caryotype peut être nor- mutée). Quelle que soit la maladie en cause (leucé-
mal ou anormal. Les anomalies chromosomiques, mies aiguës ou chroniques, syndromes lymphopro-
lorsqu’elles existent, correspondent à des pertes lifératifs, néoplasies myéloprolifératives, syndromes
(délétion, monosomie, nullosomie), des gains myélodysplasiques, lymphomes, etc.), l’établis-
(duplication, trisomie, etc.) ou des déplacements sement du caryotype joue un rôle majeur dans la
(translocations, insertions entre plusieurs chromo- prise en charge des patients par sa valeur diagnos-
somes, inversions intra chromosomiques, etc.) de tique et/ou pronostique, permettant de choisir
matériel génétique. Les anomalies ne sont pas répar- l’option thérapeutique la plus adaptée. Par ailleurs,
ties au hasard. Des chromosomes ou des bandes l’existence d’un marqueur chromosomique peut
chromosomiques sont concernés de façon récur- être exploitée pour le suivi de la maladie du patient.
rente, voire spécifique d’une hémopathie. Il existe
une relation entre génotype et phénotype : une Place dans la hiérarchie d’un
anomalie chromosomique affecte un ou plusieurs bilan d’exploration
gènes importants qui modifient le comportement Le caryotype est pratiqué au moment du diagnos-
cellulaire et conditionnent la réponse au traitement. tic de l’hémopathie, avant tout traitement. Il est
important que toutes les analyses nécessaires à
Objectifs de l’analyse et principales la prise en charge d’une hémopathie maligne
indications de prescription (morphologiques, immunophénotypiques, cyto-
Le caryotype onco-hématologique a pour objectif génétiques, moléculaires) soient réalisées lors du
la détection d’anomalies chromosomiques dans les même prélèvement et avant le début du traite-
cellules malignes. Ce sont des anomalies acquises ment. Un caryotype peut également être réalisé
lors du suivi du patient.
Nature du prélèvement Aspiration médullaire, prélèvement sanguin, biopsie ganglionnaire ou tissulaire (rate, peau, etc.),
liquide d’épanchement.
Recommandations pour la L’étude cytogénétique de type caryotype n’est possible que sur des échantillons vivants et aseptiques.
qualité du prélèvement Les prélèvements doivent être introduits dans un flacon stérile contenant un milieu de culture simple,
de l’héparine et un antibiotique, mais en aucun cas un fixateur. Le prélèvement sanguin ou médullaire
doit être réalisé sur tube héparine lithium.
Contraintes Le transport doit être aussi rapide que possible (24 h maximum), à température ambiante.
d’acheminement
Chapitre 17. Cytogénétique hématologique 267
Mode de conservation Le culot cellulaire obtenu à l’issue de la culture est conservé à – 20 °C et peut être utilisé jusqu’à
épuisement.
Principe méthodologique Les chromosomes ne sont visibles que dans des cellules en division. Les prélèvements à étudier
doivent donc contenir des cellules en cycle. Au laboratoire de cytogénétique, ces prélèvements sont
préparés pour une culture brève dont la durée sera adaptée à la pathologie suspectée, suivie d’un
blocage des cellules en métaphase (le plus souvent au moyen de colchicine), moment du cycle où
les chromosomes sont condensés et facilement identifiables. L’application d’une solution hypotonique
permet d’obtenir un gonflement des cellules et de disperser les chromosomes. Les cellules sont
ensuite fixées et peuvent être conservées à – 20 °C à ce stade. L’analyse est faite en général sur
20 métaphases obtenues après étalement du culot cellulaire sur lames. Une dénaturation permet
ensuite de faire apparaître les bandes chromosomiques spécifiques de chaque paire de chromosomes
et de les classer. La formule chromosomique est donnée suivant des règles établies par une
nomenclature internationale régulièrement révisée et doit comporter l’analyse d’au moins 20 mitoses.
Type de méthode La technique nécessaire à l’obtention des cellules en métaphase est le plus souvent manuelle. Les
mitoses repérées au microscope (par un opérateur ou un robot chercheur de métaphases) sont
capturées à l’aide de logiciels analyseurs d’images qui permettent un classement semi-automatique.
Type de test Mesure qualitative et moyennement quantitative.
CIQ Maison.
EEQ Oui.
Performances du test Le caryotype permet une analyse globale du génome, avec comme limite la résolution de cette
technique (environ 5-10 mégabases). Il permet de détecter les anomalies cellule par cellule, avec une
hiérarchisation des anomalies clonales et sous-clonales.
Causes d’erreur, limites Des faux négatifs sont possibles si :
du test - seules des métaphases de cellules normales ont été obtenues ;
- le clone cellulaire anormal est très minoritaire ;
- la qualité des chromosomes est médiocre. Échec du caryotype possible, en particulier si
prélèvement pauvre, coagulé ou contaminé.
Fiche 17.2
Hybridation sur chromosomes métaphasiques et/ou
interphasiques
Codes NABM 0903, 0904 ou 0905
Signification biologique du paramètre en augmentant le nombre de cellules analysées

L’hybridation in situ fluorescente (Fluorescence lorsque l’évaluation porte sur les signaux de
In Situ Hybridization ou FISH) est réalisée avec noyaux interphasiques. Enfin, elle peut permettre
des sondes spécifiques marquées par des fluoro- de rechercher une anomalie de façon spécifique
chromes et permet de détecter des anomalies en cas d’échec du caryotype, puisqu’elle peut être
génomiques sur des chromosomes métaphasiques réalisée sur cellules ne se divisant pas (noyaux
et/ou des noyaux interphasiques. C’est une interphasiques).
technique complémentaire au caryotype (cf. Il est également possible de réaliser de la FISH
fiche 17.1, indispensable dans la prise en charge sur des appositions ou des coupes anatomopa-
de nombreuses hémopathies. thologiques.

En complément du caryotype, la FISH per- En fonction du type d’hémopathie, des arbres
met soit de détecter des anomalies cryptiques stratégiques ont été mis en place par le groupe
(non visibles), de préciser des anomalies ou de francophone de cytogénétique hématologique
confirmer l’implication d’un gène dans une ano- (GFCH), concernant en particulier le choix de(s)
malie. Elle peut aussi permettre une meilleure (la) sonde(s) à réaliser, au diagnostic et/ou dans
quantification des cellules portant l’anomalie, le suivi des hémopathies
Nature du prélèvement Aspiration médullaire, prélèvement sanguin, liquide d’épanchement, biopsie médullaire, biopsie ou
apposition ganglionnaire, splénique ou de masse tumorale.
Recommandations pour la Lorsque la FISH est réalisée sur chromosomes, les conditions sont les mêmes que pour l’étude
qualité du prélèvement cytogénétique de type caryotype et elle n’est possible que sur des échantillons vivants et aseptiques.
Les prélèvements doivent être introduits dans un flacon stérile contenant un milieu de culture simple,
de l’héparine et un antibiotique, mais en aucun cas un fixateur. Le prélèvement sanguin ou médullaire
doit être réalisé sur tube héparine lithium. Pour la FISH interphasique, un étalement sur lame est
suffisant, frottis ou cytocentrifugat de bonne qualité. Les coupes anatomopathologiques doivent être
les plus fines possible.
Contraintes Le transport doit être aussi rapide que possible (24 h maximum), à température ambiante.
d’acheminement
Mode de conservation Le culot cellulaire obtenu à l’issue de la culture est conservé à – 20 °C et peut être utilisé jusqu’à
épuisement.
Chapitre 17. Cytogénétique hématologique 269
Principe méthodologique Chaque sonde spécifique d’un chromosome entier, d’une région chromosomique ou d’un locus,
s’hybride sur une séquence de l’ADN analysé. Ceci est réalisé par dénaturation thermique (séparation
des 2 brins de l’ADN), puis renaturation. Cette technique repose sur la complémentarité des bases
de l’ADN : la sonde ne se fixe que si la séquence ciblée est présente. La sonde est couplée à un
fluorochrome et la préparation est lue au microscope à fluorescence à la fin de la technique. Le signal
fluorescent peut alors être présent sur le chromosome attendu, présent sur un autre chromosome,
scindé, ou absent. Il est classique d’utiliser deux sondes couplées à des fluorochromes différents (le
plus souvent émettant respectivement en vert et en rouge). Les sondes caractéristiques des fusions
chromosomiques résultant de translocations donnent des signaux séparés sur les chromosomes
normaux et des signaux proches sur le site de la translocation. À l’inverse, les sondes dites
breakapart donnent des signaux proches sur le chromosome normal au niveau de point de cassure
potentiel et des signaux séparés en cas de translocation.
Type de méthode Méthode manuelle et semi-automatisée (dénaturation-renaturation), lecture des signaux par un
opérateur ou par un chercheur de métaphases.
CIQ Maison.
EEQ Oui.
Performances du test Technique plus sensible que le caryotype, avec un seuil de résolution de 100 à 300 kb, la FISH
peut détecter des translocations, des pertes ou des gains de matériel chromosomique. Elle permet
également de détecter ces anomalies cellule par cellule plutôt que dans l’ensemble de l’ADN. Elle
peut être réalisée sur cellules non cultivées et sur tissus.
Causes d’erreur, limites La FISH est une technique ciblée d’analyse du génome dans laquelle « on ne trouve que ce que
du test l’on cherche ». En fonction de la localisation de la sonde, certains remaniements peuvent ne pas
être détectés. Il faut donc connaître de façon précise la construction de la sonde. Sur noyaux
interphasiques de cellules en suspension, le seuil de positivité pour détecter des anomalies varie de
1 à 5 % en fonction des sondes. Sur coupes anatomopathologiques, la superposition des couches de
cellules rend la lecture difficile et délicate.
Bibliographie du chapitre 17 Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol

Clin 2016;74:525–34.
FICHE 17.1 – Caryotype onco-hématologique
Luquet I, Bidet A, Cuccuini W, et al. Cytogenetics
Nguyen-Khac F, Daudignon A, Eclache V, et al. Cyto-
in the management of acute myeloid leukemia: an
genetics in the management of hematologic mali-
update by the Groupe Francophone de Cytogé-
gnancies: an update by the Groupe Francophone de
nétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin
Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol
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Baranger L, Cuccuini W, Lefebvre C, et al. Cytogenetics
FICHE 17.2 – Hybridation sur chromosomes
in the management of children and adult acute lym-
métaphasiques et/ou interphasiques
phoblastic leukemia (ALL): an update by the Groupe
Nguyen-Khac F, Daudignon A, Eclache V, et al. Cyto-
genetics in the management of hematologic mali- Francophone de Cytogénétique Hématologique
gnancies: an update by the Groupe Francophone de (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:547–60.
Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Nguyen-Khac F, Borie C, Callet-Bauchu E, et al. Cyto-
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Roche-Lestienne C, Boudry-Labis E, Mozziconacci MJ. leukemia: an update by the Groupe Francophone de
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leukemia”: an update by the Groupe Francophone Clin 2016;74:561–7.
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Bilhou-Nabéra C, Bidet A, Eclache V, et al. Cytogenetics an update by the Groupe Francophone de Cytogé-
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Francophone de Cytogénétique Hématologique Daudignon A, Quilichini B, Ameye G, et al. Cytogene-
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Eclache V, Lafage-Pochitaloff M, Lefebvre C, et al. update by the Groupe Francophone de Cytogé-
Cytogenetic place in managing myelodysplastic syn- nétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin
dromes: an update by the Groupe Francophone de 2016;74:588–95.
Chapitre 18
Exploration des proliférations
myéloïdes

Fiche 18.1
Recherche et quantification des transcrits BCR-ABL1
Code LC N407
Signification biologique du paramètre d’ABL1 dans la stratégie thérapeutique, soit en

Les transcrits BCR-ABL1 sont produits par le monothérapie (LMC) soit en association avec
gène BCR-ABL1. Dans le contexte d’un syn- une polychimiothérapie intensive (LAL). Dans
drome myéloprolifératif (SMP, ou néoplasme le contexte de la LMC, la quantification des
myéloprolifératif NMP), ils constituent le mar- transcrits BCR-ABL1 doit être prescrite sur une
queur moléculaire diagnostique de la leucémie base trimestrielle, de l’initiation du traitement
myéloïde chronique (LMC). Ce marqueur n’est jusqu’à l’obtention de la réponse moléculaire
cependant pas spécifique de la LMC puisqu’il majeure (RMM). Une fois la RMM obtenue et
est aussi exprimé dans un sous-groupe de leucé- confirmée, la quantification des transcrits BCR-
mies aiguës lymphoblastiques (LAL). La protéine ABL1 peut se faire sur un rythme semestriel.
codée par les transcrits BCR-ABL1 est la cible L’objectif est d’identifier les patients pour les-
des agents thérapeutiques de la classe des inhibi- quels un ajustement thérapeutique est nécessaire.
teurs d’ABL1. La détection des transcrits BCR- À plus long terme, la quantification des transcrits
ABL1 ouvre donc la possibilité de l’utilisation BCR-ABL1 est indispensable pour justifier une
des inhibiteurs d’ABL1 à des fins thérapeutiques. suspension du traitement. En situation d’arrêt
De plus, la quantification régulière des transcrits de traitement la quantification des transcrits
BCR-ABL1 tout au long du traitement permet de BCR-ABL1 permet de diagnostiquer la rechute
vérifier la qualité de la réponse de chaque patient moléculaire qui nécessite la reprise du traitement.
et d’identifier ceux pour lesquels une adaptation Dans le contexte des LAL BCR-ABL1 positives,
thérapeutique est nécessaire. la quantification des transcrits BCR-ABL1 doit
être adaptée au protocole de traitement qui a
Objectifs de l’analyse et principales été choisi.
La recherche des transcrits BCR-ABL1 doit être
entreprise devant toute suspicion de LMC pour d’un bilan d’exploration
confirmer l’hypothèse diagnostique, devant toute La recherche des transcrits BCR-ABL1 doit se
suspicion de NMP pour exclure le diagnostic de faire en première intention devant toute suspicion
LMC, et pour toute LAL de la lignée B. L’objec- de LMC, devant toute suspicion de NMP, devant
tif est de justifier l’utilisation des inhibiteurs toute LAL de la lignée B.
Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA, voire moelle.

Recommandations pour la Ne pas congeler le prélèvement.
Contraintes d’acheminement Acheminement au laboratoire à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai
inférieur ou égal à 24 h.
Mode de conservation Conservation des prélèvements à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai
inférieur ou égal à 24 h.
Principe méthodologique Recherche des transcrits BCR-ABL1. Transcription inverse des ARN en ADNc suivi d’une
amplification par PCR avec électrophorèse des fragments amplifiés.
Quantification des transcrits BCR-ABL1. Transcription inverse des ARN en ADNc suivie par une
amplification par PCR en temps réel.
Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes 273
Type de test Test qualitatif pour la recherche et quantitatif pour la quantification des transcrits BCR-ABL1.
CIQ « Maisons » ou commerciaux.
EEQ Disponibles auprès du GBMHM (Groupe de biologie moléculaire des hémopathies malignes), à la
fois pour la recherche et la quantification des transcrits BCR-ABL1.
Valeurs de référence/Inter- Recherche des transcrits BCR-ABL1. Identification des transcrits BCR-ABL1, y compris les
prétation et performances transcrits atypiques, et typage de l’isoforme exprimée.
Quantification des transcrits BCR-ABL1. Détermination des niveaux d’expression des transcrits
BCR-ABL1, normalisés sur l’expression d’un gène contrôle (ABL1, GUSB ou BCR). Dans
le contexte de la LMC, le niveau d’expression doit en outre être standardisé sur l’échelle
internationale. Cela n’est applicable que pour les LMC exprimant les transcrits e14a2 ou e13a2.
Causes d’erreur, limites du Recherche des transcrits BCR-ABL1 : dégradation des ARN, présence d’un inhibiteur, expression
test d’une isoforme non amplifiable par la méthode mise en œuvre.
Quantification des transcrits BCR-ABL1 : dégradation des ARN, présence d’un inhibiteur, isoforme
non déterminée avant traitement.
Fiche 18.2
Recherche des mutations du domaine tyrosine kinase
de BCR-ABL1
Code RIHN N421
Signification biologique du paramètre tyrosine kinase de BCR-ABL1 a pour objectif

Les mutations du domaine tyrosine kinase de BCR- de caractériser la résistance et de proposer un
ABL1 sont des évènements génétiques somatiques traitement alternatif efficace. L’examen doit être
acquis par les cellules tumorales et susceptibles entrepris en situation d’échec ou de réponse
d’induire une résistance aux agents thérapeutiques suboptimale au traitement, comme défini par
de la classe des inhibiteurs d’ABL1. En situation de l’European Leukemia Net (ELN).
résistance ou de réponse suboptimale au traitement,
l’identification d’une mutation doit conduire à la Place dans la hiérarchie d’un
révision du traitement. Les spectres des mutations bilan d’exploration
de résistance aux différents inhibiteurs d’ABL1 La recherche des mutations du domaine tyrosine
étant différents, le type de la mutation identifiée kinase de BCR-ABL1 doit se faire en première
est un des éléments fondamentaux qui permettent intention :
de guider de façon rationnelle l’adaptation du • en situation d’échec ou de réponse suboptimale
traitement. La détection d’une mutation est aussi au traitement ;
le signe d’une instabilité génétique associée à un • devant une augmentation du niveau d’expres-
risque accru de progression de la maladie. sion des transcrits BCR-ABL1 d’un ½ Log10, soit
3,3 fois.
Dans le contexte du traitement par un inhibiteur
d’ABL1, la recherche des mutations du domaine
Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse.

Recommandations pour la qualité du Ne pas congeler le prélèvement.
prélèvement
Contraintes d’acheminement Acheminement au laboratoire à une température comprise entre + 15
et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h.
Mode de conservation Conservation des prélèvements à une température comprise entre + 15
et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h.
Principe méthodologique La recherche de mutation du domaine kinase de BCR-ABL1 comporte extraction
d’ARN et la préparation par transcription inverse d’ADN complémentaires
(ADNc). Après amplification par PCR, une capture du domaine tyrosine kinase
est réalisée et les amplicons sont séquencés. Les séquences obtenues sont
comparées à une séquence de référence.
Type de test Mesure qualitative pour les méthodes de séquençage de type Sanger.
Mesure quantitative pour les méthodes de séquençage en parallèle en phase
solide.
CIQ Oui, maison.

EEQ Pas d’EEQ disponible actuellement.
Valeurs de référence/Interprétation et Sensibilité de détection de 15-20 % pour les méthodes de séquençage type
performances Sanger.
Sensibilité de détection de 1 à 5 % pour les méthodes de séquençage en
parallèle en phase solide.
Il est possible d’identifier des mutations composites.
Causes d’erreur, limites du test Causes d’erreur : mutations induites par les enzymes utilisées pour la trans-
cription inverse et l’amplification par PCR.
Limite du test : le niveau d’expression des transcrits BCR-ABL1 doit être
supérieur à 0,1 %. Une qualité insuffisante des ARN extraits peut aussi
minimiser les résultats.
Fiche 18.3
Recherche/Quantification de la mutation JAK2V617F
Code LC N417
Signification biologique du paramètre la mutation renforce le diagnostic de Néoplasie

JAK2 est une tyrosine-kinase impliquée dans la myéloproliférative. Cette recherche est égale-
transduction du signal de récepteurs aux cyto- ment pleinement justifiée en cas de thrombose
kines, en particulier celui de l’érythropoïétine splanchnique (thrombose porte, syndrome de
(EPO-R), de la thrombopoïétine (TPO-R ou Budd-Chiarri), y compris si l’hémogramme est
MPL) et du facteur de croissance des granu- normal. L’indication est bien plus discutée dans
locytes (G-CSF-R ou CSF3R). La muta- d’autres situations thrombotiques inhabituelles
tion NM_004972.3 (JAK2 :c.1849G > T; (thrombose veineuse cérébrale, thrombose d’un
p.Val617Phe) ou JAK2V617F est la plus fré- site inhabituel, récidives thrombotiques sans
quemment retrouvée dans les néoplasies myé- étiologie) en l’absence d’anomalies de l’hémo-
loprolifératives. Elle entraîne une perte de la gramme. La quantification de la mutation peut
régulation négative physiologiquement jouée par orienter le diagnostic (homozygotie indiquée
le domaine JH2 (pseudo-kinase) sur le domaine par un taux > 50 % classiquement limitée aux
JH1 (domaine kinase) avec pour conséquence une polyglobulies de Vaquez et myélofibroses) et
hypersensibilité et même une indépendance des aider au suivi des NMP (augmentation si pas-
progéniteurs hématopoïétiques par rapport à leurs sage en myélofibrose, diminution en réponse au
facteurs de croissance. traitement).
Objectifs de l’analyse et principales Place dans la hiérarchie

indications de prescription d’un bilan d’exploration
La recherche de la mutation JAK2V617F est Dans un bilan de polyglobulie, la recherche/
un élément majeur du diagnostic des néopla- quantification de JAK2V617F a toute sa place
sies myéloprolifératives (NPM) : en situation en première intention en dehors de situations
de polyglobulie, la présence de cette muta- cliniques évidentes (insuffisance respiratoire avec
tion est un argument fort en faveur de la hypoxie, shunt cardiaque droit/gauche, etc.), sou-
maladie de Vaquez (ou Polycythemia Vera), vent en association avec le dosage d’érythropoïé-
surtout si son taux est > 5 %. En présence tine. En cas de thrombocytose, la recherche peut
d’une thrombocytose ou d’une suspicion de être engagée après avoir éliminé les causes réac-
myélofibrose (érythromyélémie, splénomégalie, tionnelles les plus fréquentes (syndromes inflam-
anémie, dacryocytose, etc.), la découverte de matoires chroniques, carences martiales, asplénie).

Recommandations Une détermination précise de la charge allélique, en particulier en cas de suivi, est préférentiellement
pour la qualité du réalisée sur polynucléaires purifiés. Prévoir suffisamment de sang (minimum 10 mL).
prélèvement
Contraintes d’achemi- Température ambiante, transport rapide (sous 24 h), surtout si nécessité de purifier les polynucléaires.
nement
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur sang total congelé.
Principe méthodolo- Plusieurs techniques sont disponibles, le plus souvent PCR quantitative avec discrimination allélique
gique basée sur l’utilisation de compétition de sondes ou d’amorces spécifiques.
Type de test Mesure quantitative ou qualitative selon la technique utilisée. Une mesure quantitative est préférable.
CIQ Maison et commercial.
EEQ Disponible au sein du GBMHM.
Valeurs de référence/ La détection d’une mutation JAK2V617F est une marque de clonalité fournissant un argument fort en
Performances du test faveur du diagnostic de NMP. Il faut interpréter avec prudence les faibles charges alléliques (< 2 %) qui
peuvent être de simples marqueurs d’hématopoïèse clonale liée à l’âge (CHIP : Clonal Hematopoiesis of
Indeterminate Potential).
Causes d’erreur, limites Les faibles charges alléliques doivent être interprétées avec prudence, surtout en situation de
du test polyglobulie ou de thrombose sans autre stigmate de néoplasie myéloproliférative.
Exceptionnellement, une mutation additionnelle proche peut négativer la recherche (interférence avec
l’hybridation des amorces). Il faut alors avoir recours à une technique alternative.
Fiche 18.4
Recherche de mutation de l’exon 12 de JAK2
Code RIHN N455 (forfait)
Signification biologique du paramètre l’absence de la mutation JAK2V617F. On ne la

JAK2 est une tyrosine-kinase impliquée dans la trouve pas dans les autres néoplasies myéloproli-
transduction du signal de récepteurs aux cytokines, fératives (NMP).
en particulier celui de l’érythropoïétine (EPO-R),
de la thrombopoïétine (TPO-R ou MPL) et du
facteur de croissance des granulocytes (G-CSF-R Place dans la hiérarchie d’un
ou CSF3R). Les mutations de l’exon 12 de JAK2 bilan d’exploration
sont retrouvées dans de rares polyglobulies de Dans un bilan de polyglobulie, la recherche de
Vaquez. Elles activent fortement l’activité kinase. mutations de l’exon 12 de JAK2 est réservée
Il s’agit de mutations diverses (insertions, délé- aux cas où la mutation JAK2V617F n’est pas
tions, substitutions, combinaisons de ces éléments) retrouvée (ou parfois retrouvée à un taux inha-
siégeant au niveau d’une séquence limitée de bituellement bas) et souvent après avoir éliminé
l’exon 12. les causes simples de polyglobulie secondaire ou
de fausse polyglobulie. Un taux bas d’érythro-
Objectifs de l’analyse et principales poïétines en l’absence de mutation JAK2V617F
indications de prescription est une bonne indication à la recherche de
La recherche de mutations de l’exon 12 permet mutations de l’exon 12.
de poser le diagnostic de maladie de Vaquez en

Recommandations pour la Devant la difficulté de détecter des clones peu importants, ce qui est fréquent, il est préférable de
qualité du prélèvement travailler sur polynucléaires purifiés (au moins 10 mL de sang).
Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les
polynucléaires.
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire.
Principe méthodologique Plusieurs techniques sont disponibles. Le séquençage de Sanger a une limite de détection
suboptimale (10-20 %). Les techniques HRM (High Resolution Melting) permettent une détection
relativement sensible mais nécessitent un séquençage de confirmation. Les techniques NGS sont
très intéressantes dans cette indication.
CIQ Maison.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Perfor- La recherche de mutation de l’exon 12 de JAK2 permet de poser le diagnostic de maladie de
mances du test Vaquez chez les quelques patients (2-3 %) ne présentant pas de mutation JAK2V617F.
Causes d’erreur, limites du Les petits clones sont parfois difficiles à détecter, il faut s’assurer d’utiliser une technique sensible
test et ne pas hésiter à répéter l’examen en cas de doute.
Fiche 18.5
Recherche de mutations de CALR
Signification biologique du paramètre d’une mutation de CALR est un argument fort

Le gène de la calréticuline (CALR) est muté chez en faveur du diagnostic de NMP. Elle permet en
environ un quart à un tiers des patients présentant outre une catégorisation pronostique : dans une
des néoplasies myéloprolifératives (NMP) à pré- thrombocytémie essentielle, les mutations CALR
dominance mégacaryocytaire (thrombocytémie sont associées à un moindre risque thrombotique
essentielle, myélofibrose primitive). Il code pour et dans les myélofibroses, elles sont associées à
une protéine résidente du réticulum endoplas- une meilleure survie globale. Il faut toutefois
mique assurant le contrôle de qualité des glyco- nuancer ces propos qui semblent dépendre du
protéines et jouant un rôle dans l’homéostasie type de mutation. Contrairement aux mutations
calcique. Les formes mutées de calréticuline inter- JAK2V617F, les mutations de CALR ne sont
agissent spécifiquement avec les récepteurs MPL pas retrouvées de façon significative en cas de
de la thrombopoïétine, entraînant leur activation thrombose si l’hémogramme est normal.
en l’absence de cytokine. Les mutations de CALR
siègent au niveau du dernier exon (exon 9) et Place éventuelle dans la hiérarchie
entraînent systématiquement un décalage du cadre d’un bilan d’exploration
de lecture. Celui-ci est responsable du changement
Le plus souvent mutuellement exclusive des
de la séquence protéique qui, d’acide, devient
autres mutations de prolifération (JAK2, MPL),
basique et donne naissance à un peptide soluble.
la recherche de mutations de CALR est souvent
réalisée en seconde intention après celle de
mutation JAK2V617F en cas de suspicion de
indications de prescription thrombocytémie essentielle ou de myélofibrose.
En présence d’une thrombocytose ou d’une Rarement, ces mutations peuvent être asso-
suspicion de myélofibrose, la mise en évidence ciées, surtout en cas de faible charge allélique.
Recommandations pour la Le plus souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait pour la recherche de mutation JAK2V617F faite
qualité du prélèvement en première ligne.
Contraintes d’achemine- Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les polynucléaires.
ment
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur sang total congelé.
Principe méthodologique Plusieurs techniques disponibles, mettant souvent à profit le fait qu’il y a systématiquement un chan-
gement de taille de l’exon 9 (analyse de fragment, HRM). Le séquençage Sanger est envisageable car
les charges alléliques sont quasi exclusivement supérieures à 10 %. Le séquençage NGS est possible
avec parfois des difficultés bio-informatiques d’alignement dans cette région hautement répétitive.
Type de test Test principalement qualitatif, quantification possible.
CIQ Maison.
EEQ Prévu au sein du GBMHM.
Performances du test Marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de NMP. Classification pronostique.
Causes d’erreur, limites De rares variants génétiques constitutionnels entraînent des variations du nombre de répétitions
du test de l’exon 9. Ces délétions de bases par multiples de trois ne doivent pas être confondues avec des
mutations pathogènes.
Fiche 18.6
Recherche de mutations de MPL
Signification biologique du paramètre d’une mutation de MPL est un argument fort

MPL est le gène codant pour le récepteur de en faveur du diagnostic de NMP. Il y a une
la thrombopoïétine. Il est muté chez un faible possible classification pronostique, sous réserve
pourcentage de patients présentant des néopla- du faible nombre de patients rapportés dans les
sies myéloprolifératives (NMP) à prédominance séries : les mutations de MPL confèrent un risque
mégacaryocytaire (thrombocytémie essentielle : thrombotique proche de celui observé chez les
environ 5 %, myélofibrose primitive : jusqu’à patients présentant une mutation JAK2V617F
10 %). Les mutations de MPL se situent principa- et un risque fibrotique qui serait plus important
lement au niveau de l’exon 10 et plus particulière- qu’avec les autres mutations.
ment au niveau du tryptophane en position 515.
Ce résidu, proche de la zone transmembranaire, Place éventuelle dans la hiérarchie
assure le maintien au repos du dimère de récep- d’un bilan d’exploration
teurs en l’absence de ligand. Sa substitution pour
Le plus souvent mutuellement exclusive des
un grand nombre d’autres acides aminés entraîne
autres mutations de prolifération (JAK2, CALR),
une activation du récepteur en l’absence de
la recherche de mutations de MPL est plutôt
thrombopoïétine.
réalisée en troisième intention après la recherche
de mutations JAK2V617F et de l’exon 9 de
CALR, en cas de suspicion de Thrombocytémie
indications de prescription Essentielle ou de myélofibrose. Rarement, ces
En présence d’une thrombocytose ou d’une mutations peuvent être associées, surtout en cas
suspicion de myélofibrose, la mise en évidence de faible charge allélique JAK2V617F.

Recommandations pour la La recherche de cette mutation est le plus souvent réalisée sur l’échantillon d’ADN extrait pour la
qualité du prélèvement recherche de mutation JAK2V617F réalisée en première ligne.
Contraintes Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les polynucléaires.
d’acheminement
Principe méthodologique Plusieurs techniques sont disponibles, explorant tout l’exon 10 de MPL (HRM1, séquençage) ou
uniquement la position W515, voire uniquement les deux substitutions les plus fréquentes (PCR
spécifiques d’allèles). Le séquençage par NGS est volontiers utilisé.
Type de test Mesure qualitative, certaines techniques sont quantitatives.
CIQ Maison.
EEQ Non.
Valeurs de référence/ La mise en évidence d’une mutation de MPL est une marque de clonalité fournissant un argument
Performances du test fort en faveur du diagnostic de néoplasie myéloproliférative. Classification pronostique.
Causes d’erreur, limites Selon la technique utilisée, certaines mutations peuvent ne pas être détectées, soit par manque
du test de sensibilité (petits clones fréquents), soit qu’il s’agisse d’une mutation plus rare non explorée
(mutation S505, autres mutations complexes, etc.).
1. HRM: High Resolution Melting.

Fiche 18.7
Recherche de mutations de CSF3R et SETBP1
Signification biologique du paramètre ment) dans les LNC (surtout CSF3R) et les LMCa.
CSF3R est le gène qui code pour le récepteur Tous deux sont des marqueurs de clonalité parfois
du G-CSF. Des mutations activatrices ont été fort utiles. Les mutations de CSF3R constituent
retrouvées, principalement dans les néoplasies un critère majeur de diagnostic des LNC. Les muta-
myéloprolifératives (NPM) rares ou atypiques tions de SETBP1 semblent associées à un pronostic
(leucémie neutrophile chronique, LNC, et leu- défavorable dans les LMCa mais aussi dans les Leu-
cémie myéloïde chronique atypique, LMCa). cémies myélomonocytaires chroniques (LMMC).
Il existe deux zones importantes de mutation : Les mutations de CSF3R pourraient conférer une
une dans le domaine extracellulaire, proche du sensibilité élective aux inhibiteurs de JAK2.
domaine transmembranaire, dont les mutations
activent la voie JAK-Stat, l’autre au niveau Place dans la hiérarchie d’un
intracellulaire où des délétions suppriment des bilan d’exploration
régions de régulation négative. SETBP1 est un
Ces recherches sont volontiers pratiquées lors
partenaire de SET, un inhibiteur de la phospha-
du bilan de NMP inhabituel, à la recherche
tase suppresseur de tumeur PP2A. Les mutations
d’un marqueur de clonalité en l’absence
de l’exon 4 (domaine SKI) de SETBP1 inhibent
d’anomalie cytogénétique ou pour en préciser
la dégradation de la protéine, permettant donc
le type et le pronostic. Elles sont fréquem-
sa surexpression qui inhibe PP2A mais aussi
ment associées à des explorations plus larges
d’autres cibles comme RUNX1.
par technique de Next Generation Sequencing
(NGS).
Les mutations de ces deux gènes, volontiers associées,
se retrouvent principalement (mais pas exclusive-

Recommandations pour la L’examen est souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait pour la recherche de mutation
qualité du prélèvement JAK2V617F faite en première ligne.
Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide.
Principe méthodologique Le séquençage est nécessaire, soit par technique de Sanger avec sa limite de sensibilité (10-
20 %), soit souvent par NGS (Next Generation Sequencing).
CIQ Maison.
EEQ Non, sauf si panel myéloïde du GBMHM.
Valeurs de référence/Perfor- Marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de néoplasie
mances du test myéloproliférative. Argument en faveur du diagnostic de LNC pour CSF3R. Classification
pronostique.
Causes d’erreur, limites du Qualité de l’ADN, envahissement tumoral.
test
Fiche 18.8
Forfait syndromes myélodysplasiques (SMD)
Signification biologique du paramètre le cadre de l’abaissement du seuil de sidéroblastes

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont en couronne à 5 % s’il existe une mutation de
des hémopathies myéloïdes hétérogènes du sujet SF3B1 pour les SMD-RS selon la classification
âgé dont le diagnostic repose sur l’examen mor- OMS 2016) ;
phologique des cellules médullaires. La physiopa- • affiner le pronostic des patients selon le statut
thologie des SMD est associée à la présence de mutationnel du gène TP53 et/ou le nombre
nombreuses mutations somatiques. Ces mutations cumulé de mutations ;
affectent des gènes impliqués dans différents pro- • envisager des pistes thérapeutiques (si présence
cessus cellulaires dont la régulation épigénétique, de mutation dans les gènes IDH1, IDH2, SF3B1,
l’épissage des ARN, la prolifération et la diffé- SRSF2, U2AF1, DNMT3A, etc.) ;
rentiation. Grâce aux nouvelles technologies de • utiliser ces données en tant que marqueurs thé-
séquençage ciblant les principaux gènes d’intérêt, ranostiques. Ce dernier point est en lien avec les
il est admis désormais que 90 % des patients sont traitements par agents stimulant l’érythropoïèse,
porteurs d’au moins une mutation et en moyenne par hypométhylants ou par greffe allogénique
entre 2 et 3 mutations sont retrouvées par patient, de cellules souches hématopoïétiques en asso-
en association avec les anomalies cytogénétiques ciation avec les autres marqueurs déjà établis. La
observées dans 50 % des cas. Au niveau inter- recherche de mutations somatiques dans les SMD
national, la classification des hémopathies mise à s’envisage sous la forme d’un forfait englobant
jour par l’OMS en 2016 a introduit la présence les principaux gènes décrits (recommandations
de mutations somatiques afin de mieux définir GBMHM).
l’entité des SMD avec sidéroblastes en couronne
(SMD-RS). À terme, les résultats de la recherche Place dans la hiérarchie
de mutations somatiques dans les SMD seront d’un bilan d’exploration
incorporés lors de la prochaine révision du score
Chez tout patient bénéficiant d’un projet théra-
pronostic international (IPSS-R2).
peutique, la recherche des mutations somatiques
dans les SMD doit se faire au stade du diag-
nostic en première intention et doit s’envisager
indications de prescription en deuxième intention en cas d’évolution de la
En lien avec de nombreuses publications, la maladie ou de perte de réponse au traitement mis
recherche de mutations somatiques dans le cadre en place. Tous ces résultats doivent faire l’objet de
des SMD se révèle importante pour : réunions de concertation pluridisciplinaires afin
• aider dans certains cas à poser le diagnostic (en d’aider à la prise en charge des patients.
cas de dysplasie d’interprétation délicate et dans
Nature du prélèvement Moelle sur tube EDTA ou milieu Hank’s hépariné/culot de cytogénétique.
Recommandations pour la Le plus souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait du matériel médullaire ayant permis de poser le
qualité du prélèvement diagnostic cytologique/cytogénétique.
Contraintes d’achemine- Température ambiante, transport rapide (sous 48 h).
ment
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur moelle congelée après
séparation des cellules mononucléées sur gradient de ficoll.
Principe méthodologique Plusieurs techniques sont disponibles, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est à privilégier
de par sa capacité à étudier de nombreux gènes simultanément avec une sensibilité importante. Le
séquençage Sanger ou l’analyse de fragments peut se révéler utile pour certains gènes d’inter-
prétation délicate en NGS (ASXL1, CEBPa, etc.).
Type de méthode Méthode manuelle, non automatisable.
Type de test Mesure quantitative pour le NGS, qualitative pour les autres techniques.
CIQ Maison/En cours de réflexion au sein du GBMHM (groupe de biologie moléculaire des hémopathies
malignes).
EEQ Disponible au sein du GBMHM (NGS myéloïde).
Valeurs de référence/Inter- Méthodes sensibles et spécifiques à visée diagnostique, pronostique et théranostique améliorant la
prétation et performances prise en charge des patients.
Causes d’erreur, limites Des processus bio-informatiques adaptés et la connaissance des bases de données des variants
du test décrits (ClinVar, UCSC, etc.) sont nécessaires pour l’interprétation correcte du caractère somatique
des mutations. Toute suspicion d’une anomalie constitutionnelle devra faire l’objet d’une consultation
de génétique auprès d’un spécialiste.
2. IPSS : International Prognostic Scoring System.

Fiche 18.9
Recherche de la mutation de NPM1
Signification biologique du paramètre • un facteur pronostique majeur dans les LAM

NPM1 est une protéine chaperonne multifonc- de groupe cytogénétique intermédiaire (clas-
tionnelle faisant la navette entre le noyau et le sification ELN 2017) permettant de classer les
cytoplasme. En situation physiologique, sa loca- patients dans le groupe favorable si elle est asso-
lisation est essentiellement nucléolaire. Elle joue ciée à une absence de mutation de FLT3-ITD ou
un rôle dans la stabilité du génome, la biogénèse à une mutation FLT3-ITD de ratio FLT3-ITD/-
des ribosomes et régule des gènes suppresseurs de FLT3 sauvage < 0,5 ;
tumeurs. • une cible de quantification de la maladie rési-
Les mutations de NPM1 dans les leucémies aiguës duelle (MRD).
myéloblastiques (LAM) sont localisées sur l’exon 12
et consistent en une insertion de 4 bases, décalant Place dans la hiérarchie d’un
le cadre de lecture, et aboutissant à une protéine bilan d’exploration
modifiée d’expression cytoplasmique prépondé- Dans le bilan d’une LAM de cytogénétique
rante. intermédiaire, la recherche d’une mutation de
Ces mutations sont présentes dans 30 % des LAM NPM1 est indispensable pour la stratification
et plus particulièrement dans le sous-groupe à thérapeutique et est réalisée en première inten-
caryotype normal. tion.
Si elle est positive, elle peut également servir de
Objectifs de l’analyse et principales cible pour la quantification de la MRD.
La recherche de la mutation NPM1 permet d’iden-
tifier :
Nature du prélèvement Moelle sur EDTA. Si blastose périphérique, sang EDTA ou sang citrate CPT.
Recommandations Il est nécessaire d’utiliser un prélèvement le plus blastique possible (> 20 %).
pour la qualité du La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en
prélèvement blastes.
Contraintes d’achemi- Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tubesCPT,
nement centrifuger avant envoi.
Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle osseuse.
Principe méthodolo- Plusieurs techniques disponibles, le plus souvent PCR fluorescente avec analyse de fragments et
gique séquençage Sanger ou séquençage de nouvelle génération (NGS, Next Generation Sequencing).
Type de méthode Méthode manuelle, partiellement automatisable.
Type de test Mesure qualitative pour la détection, quantitative pour la MRD.
CIQ Contrôles interlaboratoires.
EEQ Envisagé (GBMHM).
Valeurs de référence/ Méthode sensible et spécifique.
Performances du test
Causes d’erreur, limites Il y a peu de faux négatifs car il existe une très bonne corrélation entre la blastose et le clone portant la
du test mutation NPM1. On observe peu de variation lors des rechutes.
Fiche 18.10
Recherche des mutations de FLT3 : FLT3-ITD et FLT3 TKD

FLT3 est un récepteur tyrosine kinase normale- indications de prescription
ment exprimé à la surface des cellules progéni- La recherche de la mutation FLT3-ITD est un
trices de l’hématopoïèse. Il est activé par la liaison facteur pronostique majeur dans les leucémies
de son ligand, la cytokine FLT3LG ; il s’en suit aiguës myéloblastiques (LAM) de groupe cyto-
une dimérisation du récepteur à l’origine d’une génétique intermédiaire, permettant de classer
activité tyrosine kinase entraînant une activation les patients dans le groupe ELN défavorable en
de voies de signalisation en aval, responsables de cas de ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage > 0,5
la survie, de la prolifération et de la différenciation (European LeukemiaNet [ELN] 2017).
des progéniteurs hématopoïétiques primitifs. La recherche de la mutation FLT3-ITD et TKD
Des mutations somatiques responsables d’une est indiquée pour mettre en place un traitement
activation constitutive de FLT3 (sans liaison par un inhibiteur ciblant l’activité tyrosine kinase
nécessaire du ligand) ont été identifiées dans deux de FLT3.
domaines fonctionnels du récepteur :
• le domaine juxta membranaire de FLT3,
mutation qui consiste en une duplication interne
en tandem (FLT3-ITD), en phase de lecture d’un bilan d’exploration
(multiple de 3 bases), de taille et de localisation Dans le bilan de LAM de cytogénétique inter-
variables entre les exons 14 et 15 ; médiaire, la recherche de mutation FLT3-ITD est
• le domaine tyrosine kinase de FLT3, mutation indispensable pour la stratification thérapeutique
non-sens dans l’exon 20 de FLT3 TKD ou muta- (indication d’allogreffe de cellules souches héma-
tions des codons D835 et I836. topoïétiques) en première ligne.
Nature du prélèvement Moelle sur EDTA, si blastique. Sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT.
Recommandations pour la Prélèvement le plus blastique possible (> 20 %).
qualité du prélèvement La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du
prélèvement en blastes.
Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT,
centrifuger avant envoi.
Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de sang ou de moelle avec plus de 20 % de blastes.
Principe méthodologique Plusieurs techniques sont disponibles, le plus souvent PCR fluorescente avec analyse de fragments
permettant l’établissement d’un ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage.
La mutation FLT3-TKD peut être recherchée par technique HRM (High Resolution Melting),
séquençage Sanger ou séquençage de nouvelle génération.
Type de méthode Méthode manuelle, partiellement automatisée.
Type de test Mesure qualitative et quantitative avec calcul du ratio pour FLT3-ITD.
Mesure qualitative pour la recherche de mutation FLT3-TKD.
CIQ Dilution de la lignée FLT3-ITD mutée.
Échanges interlaboratoires.
EEQ Oui, ponctuel (GBMHM).
Performances du test Marqueur pronostique et théranostique pour les traitements par un inhibiteur ciblé anti FLT3.
Causes d’erreur, limites du Fréquence de sous-clones multiples très faiblement mutés pour FLT3-ITD.
test
Fiche 18.11
Mutation de CEBPa
Signification biologique du paramètre cytogénétique intermédiaire permettant de classer
La protéine CEBPα (qui existe sous deux isoformes, les patients dans le groupe clinique favorable si
p30 et p42) est un facteur de transcription impliqué elles sont associées à une absence de mutation
dans l’hématopoïèse des granuleux et des monocytes. de FLT3-ITD ou à une mutation FLT3-ITD
Les mutations de CEBPα sont le plus souvent de ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage < 0,5 (clas-
acquises, somatiques. On en observe deux types : les sification ELN 2017). Ces patients ne seront pas
mutations C terminales affectant la liaison à l’ADN éligibles, dans un premier temps, à un traitement
et l’homo ou l’hétérodimérisation de la protéine et intensif du type allogreffe de cellules souches
les mutations N terminales produisant une protéine hématopoïétiques.
tronquée favorisant l’expression de l’isoforme le Place dans la hiérarchie
plus court de la protéine, p30, qui inhibe la trans-
d’un bilan d’exploration
activation de l’isoforme p42 par un effet dominant
négatif. L’augmentation du ratio p30/p42 bloque Les mutations FLT3-ITD et FLT3-TKD doi-
l’induction du récepteur au G-CSF. vent être recherchées systématiquement en cas
Les doubles mutations du gène CEBPα sont d’indication de traitement par inhibiteur de
présentes dans environ 4 % des leucémies aiguës Flt3. De plus, dans le bilan de LAM de cytogé-
myéloïdes (LAM) de patients de moins de 65 ans. nétique intermédiaire, la recherche de mutation
CEBPa est indispensable pour la stratification
Objectifs de l’analyse et principales thérapeutique du patient. Elle peut être réalisée
indications de prescription dans un deuxième temps après la recherche de
Les mutations bi-alléliques de CEBPα sont un mutation de FLT3-ITD et de NPM1 (qui sont
facteur de bon pronostic dans les LAM de groupe plus fréquentes).
Nature du prélèvement Moelle sur EDTA, sang si blastique – sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT.
Recommandations Utiliser le prélèvement le plus blastique possible. Du fait de la sensibilité de la technique utilisée (séquençage
pour la qualité du Sanger), un pourcentage de blastes supérieur à 20 % est nécessaire pour la validation du résultat.
prélèvement La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes.
Contraintes d’achemi- Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT, centrifuger
nement avant envoi.
Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de sang ou de moelle avec plus de 20 % de blastes.
Principe méthodolo- Seule la technique de séquençage Sanger est utilisée pour mettre en évidence les mutations de CEBPα
gique (insertion/délétion, parfois de grande taille, mutation ponctuelle, duplication, etc.).
Le séquençage de nouvelle génération n’est pas, pour le moment, adapté au séquençage de ce gène du
fait de sa structure (richesse en bases GC) et de la taille des insertions/délétions.
Type de méthode Méthode manuelle, partiellement automatisée ou totalement automatisable.
CIQ Échanges interlaboratoires.
EEQ Oui, en cours GBMHM.
Valeurs de référence/ Difficultés d’interprétation de certaines mutations (substitution) dont le caractère pathogénique n’est
Performances du test pas certain (nombreux polymorphismes). Préconiser des contrôles sur sang après rémission ou sur
prélèvement de matériel biologique constitutionnel.
Causes d’erreur, Pourcentage de blastes insuffisant (< 20 %).
limites du test
Fiche 18.12
Mutations de RUNX1, TP53, ASXL1, IDH1 et IDH2
Signification biologique du paramètre entraîne le reclassement du patient de groupe
Recherche de mutations de mauvais pronostic intermédiaire en groupe de mauvais pronostic en
clinique dans les leucémies aiguës myéloblastiques cas de caryotype de risque intermédiaire.
(LAM) : Les mutations de RUNX1 et ASXL1 sont fré-
• RUNX1 (AML1), facteur de transcription quemment associées.
nécessaire à l’hématopoïèse tardive ; La plupart des LAM avec mutation de TP53 sont
• ASXL1, protéine nucléaire impliquée dans la déjà classées dans le groupe de mauvais pronostic
régulation épigénétique de l’expression de gènes du fait de la coexistence d’anomalies cytogéné-
et participant au remodelage de la chromatine ; tiques de mauvais pronostic (caryotype complexe
• TP53, facteur de transcription nucléaire impli- ou monosomique).
qué dans l’arrêt du cycle cellulaire et la mort La recherche de mutations des gènes IDH1/2 est à
cellulaire par apoptose pour permettre de pallier à visée théranostique car il existe des médicaments inhi-
d’éventuels dommages de l’ADN. TP53 a un rôle biteurs d’IDH1 et IDH2 et la mise en évidence de
dans le maintien de la stabilité du génome. ces mutations peut changer la stratégie thérapeutique.
Recherche de mutations à visée théranostique Place dans la hiérarchie d’un
dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) : bilan d’exploration
IDH1 et IDH2 (isocitrate déshydrogénase),
Ces recherches sont réalisées pour les patients
enzymes impliquées dans le cycle de Krebs dont les
présentant une LAM du groupe cytogénétique
mutations entraînent l’augmentation de production
intermédiaire n’ayant pas de mutation FLT3-
d’un oncométabolite le 2 hydroglutarate (2 HG).
ITD/sauvage > 0,5, ce qui les classe dans le
groupe de mauvais pronostic.
La recherche des mutations des gènes IDH1/2
est effectuée en seconde intention en cas de LAM
Une mutation des gènes RUNX1, ASXL1 ou en rechute ou réfractaire, mais devrait rapidement
TP53 est un facteur de mauvais pronostic qui être effectuée au diagnostic (années 2020).
Nature du prélèvement Moelle sur EDTA, si blastique, sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT.
Recommandations pour Prélèvement le plus blastique possible (> 20 %).
la qualité du prélève- La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes.
ment
Contraintes d’achemi- Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT,
nement centrifuger avant envoi.
Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle osseuse.
Principe méthodologique Séquençage Sanger et/ou séquençage de nouvelle génération (NGS).
Type de méthode Méthode automatisée partiellement.
CIQ Échanges interlaboratoires.
EEQ Oui GBMHM pour le NGS myéloïde.
Valeurs de référence/
Performances du test
Causes d’erreur, limites Pourcentage de blastes insuffisant, couverture incomplète du gène.
du test
Bibliographie du chapitre 18 FICHE 18.4 – Recherche de mutation de l’exon 12

de JAK2
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Blood 2017;129:424–47. Blood 2017;129:424–47.
Chapitre 19
Exploration des proliférations
lymphoïdes

Fiche 19.1
Recherche de clonalité B par PCR multiplex
Codes LC N400 et N420
Signification biologique du paramètre de leur juxtaposition) et de déterminer s’ils ont

La région variable des immunoglobulines (Ig) une allure clonale (taille unique) ou non (tailles
est dotée d’une extrême diversité. Celle-ci résulte multiples).
de processus de recombinaisons génétiques L’étude de clonalité moléculaire est indiquée :
complexes survenant pendant l’ontogenèse des • devant une prolifération lymphoïde suspecte
lymphocytes B qui aboutissent à la juxtaposition sur une biopsie tissulaire ou des cellules en sus-
des différents gènes (V, éventuellement D et pension (en particulier en l’absence de monotypie
J) qui codent pour ces régions variables. Dans franche des chaînes légères à l’immunophénoty-
une population lymphoïde B clonale, toutes les page, ou en l’absence d’immunophénotypage) ;
cellules ont les mêmes réarrangements des gènes • pour comparer et affirmer la nature clonale
de chaînes lourdes (IGH) et légères kappa (IGK) identique (ou non) en cas de localisations mul-
ou lambda (IGL), alors qu’une population réac- tiples ou de récidive d’une hémopathie connue.
tionnelle est composée de cellules portant un
ensemble de réarrangements distincts. Place dans la hiérarchie d’un
Objectifs de l’analyse et principales Il s’agit le plus souvent d’une technique de
indications de prescription deuxième intention à mettre en œuvre en cas de
L’objectif de l’étude moléculaire de clonalité lym- doute sur un prélèvement après un examen ana-
phoïde B est d’analyser les profils des réarrange- tomo-pathologique, cytologique et/ou immuno-
ments des gènes des Ig (en particulier la zone phénotypique.
Nature du prélèvement Biopsie tissulaire fraîche, congelée ou fixée et incluse en paraffine.

Sang, moelle, ou tout autre liquide biologique.
Recommandations pour la Prélèvement sur EDTA (l’héparine peut interférer avec l’amplification).
qualité du prélèvement L’ADN extrait de fragment en paraffine peut parfois être de moins bonne qualité, car trop fragmenté.
Contraintes d’achemi- Température ambiante (sauf biopsie congelée) sous 48 h.
nement
Mode de conservation Température ambiante (sauf biopsie congelée) jusqu’à extraction de l’ADN.
Principe méthodologique La méthode est basée sur l’amplification génique des régions variables des gènes des Ig par la
technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) à l’aide d’amorces multiples (multiplex). Les produits
d’amplification sont ensuite analysés par électrophorèse (le plus souvent capillaire). La cible de choix
est le locus IGH, qui doit être complétée dans certains cas (résultat faussement négatif en raison
de mutations somatiques dans les IGH) par celui des loci IGK et des IGL.
Type de méthode Méthode manuelle, éventuellement automatisable.
Type de test Mesure essentiellement qualitative, bien qu’une appréciation grossièrement quantitative (clone
majoritaire ou minoritaire) puisse être obtenue.
EEQ EEQ national (GBMHM) et européen (EuroClonality).
Valeurs de référence/ Test spécifique mais devant être interprété en fonction d’autres données biologiques (résultats
Interprétation et anatomo-pathologiques, cytologiques, immuno-phénotypiques). Il faut distinguer la polyclonalité,
performances associée aux populations B physiologiques, l’oligoclonalité témoignant d’une réponse immunitaire
restreinte à quelques clones et la clonalité vraie se traduisant par un pic unique.
Causes d’erreur, limites - La présence d’un clone lymphoïde B, surtout minoritaire, n’est pas toujours synonyme de population
du test tumorale maligne.
- La technique a une sensibilité d’environ 5 % et n’est donc pas adaptée au suivi de la maladie
résiduelle (qui nécessite une autre méthodologie).
Chapitre 19. Exploration des proliférations lymphoïdes 293
Fiche 19.2
Recherche de clonalité T par PCR multiplex
Codes LC N404 et N420
Signification biologique du paramètre de leur juxtaposition) et de déterminer s’ils ont

La région variable des récepteurs à l’antigène des une allure clonale (taille unique) ou non (tailles
lymphocytes T (TCR) est dotée d’une extrême multiples).
diversité. Celle-ci résulte de processus de recom- L’étude de clonalité moléculaire est indiquée :
binaison génétique complexes survenant pendant • devant une prolifération lymphoïde suspecte
l’ontogenèse des lymphocytes et aboutissant à la sur une biopsie tissulaire ou sur des cellules
juxtaposition des différents gènes (V, éventuelle- en suspension (en particulier en cas d’anomalies
ment D et J) qui codent pour ces régions variables. cytologiques et/ou à l’immunophénotypage) ;
Dans une population lymphoïde T clonale, toutes • pour comparer et affirmer la nature clonale
les cellules ont les mêmes réarrangements des identique (ou non) en cas de localisations mul-
gènes des TCR, alors qu’une population réac- tiples ou de récidive d’une prolifération T connue.
tionnelle est composée de cellules portant un
ensemble de réarrangements distincts. Place dans la hiérarchie d’un
Objectifs de l’analyse et principales Il s’agit le plus souvent d’une technique de
indications de prescription deuxième intention à mettre en œuvre en cas de
L’objectif de l’étude moléculaire de clonalité lym- doute sur un prélèvement après un examen ana-
phoïde T est d’analyser les profils des réarrange- tomo-pathologique, cytologique et/ou immuno-
ments des gènes des TCR (en particulier la zone phénotypique.
Nature du prélèvement Biopsie tissulaire fraîche, congelée ou fixée et incluse en paraffine.

Sang ou moelle sur EDTA, ou tout autre liquide biologique.
Recommandations pour Prélèvement sur EDTA (l’héparine peut interférer avec l’amplification).
la qualité du prélève- L’ADN extrait de tissus conservés en paraffine peut parfois être de moins bonne qualité, trop fragmenté.
ment
Contraintes Pas de délai pour les biopsies congelées ou fixées, 48 heures pour sang ou moelle.
d’acheminement
Mode de conservation Température ambiante (sauf biopsie congelée, carboglace) jusqu’à extraction de l’ADN.
Principe méthodologique La méthode est basée sur l’amplification génique des régions variables des TCR par la technique de
Polymerase Chain Reaction (PCR) à l’aide d’amorces multiples (multiplex). Les produits d’amplification
sont ensuite analysés par électrophorèse (le plus souvent capillaire). La cible de choix est le TCR
gamma car il est réarrangé dans tous les lymphocytes T matures et un grand nombre de proliférations T
immatures1, qu’ils soient de type alpha-bêta ou gamma-delta. On peut compléter le bilan par l’analyse
des gènes du TCR bêta s’il persiste un doute, ou exceptionnellement du TCR delta pour confirmer le
caractère gamma-delta d’une prolifération T.
Type de méthode Méthode manuelle, éventuellement automatisable en partie.
Type de test Mesure essentiellement qualitative, bien qu’une appréciation grossièrement quantitative (clone
majoritaire ou minoritaire) puisse être obtenue.
EEQ EEQ national (GBMHM) et européen (EuroClonality).
Valeurs de référence/ Test spécifique mais devant toujours être interprété en fonction du contexte clinique et des autres
Interprétation et résultats biologiques, en particulier anatomopathologiques, cytologiques, immunophénotypiques. Il faut
performances distinguer la polyclonalité, associée aux populations T physiologiques, l’oligoclonalité témoignant d’une
réponse immunitaire restreinte à quelques clones et la clonalité vraie se traduisant par un pic unique.
Causes d’erreur, limites - Clonalité n’est pas toujours synonyme de malignité. Ceci est particulièrement vrai en cas de clones T
du test plus ou moins minoritaires qui peuvent se voir dans de nombreuses situations s’accompagnant d’un
déséquilibre du répertoire immunitaire : infections (chroniques surtout), auto-immunité, greffe de moelle,
immunodépression, vieillissement.
- La technique a une sensibilité d’environ 5 % et n’est donc pas adaptée au suivi de la maladie
résiduelle qui nécessite une autre méthodologie.
1. Le locus gamma est le premier à être réarrangé lors de la lymphopoïèse T et les réarrangements abortifs persistent
dans le génome des lymphocytes T à TCR alpha-bêta.
Fiche 19.3
Statut mutationnel du locus de la chaîne lourde des
immunoglobulines
Code RIHN N420

Les lymphocytes B subissent une phase de dif- indications de prescription
férenciation complémentaire dans les organes L’analyse consiste à réaliser la séquence des gènes
lymphoïdes secondaires caractérisée en particulier IGHV des cellules tumorales afin de détermi-
par la maturation d’affinité de leur récepteur à ner leur pourcentage d’identité par rapport aux
l’antigène (B-Cell Receptor, BCR). Celle-ci est liée séquences dites germinales dont elles dérivent.
à l’introduction de mutations somatiques dans Elles sont alors classées en « non mutées » ou
les gènes codant pour les régions variables des « mutées » selon que ce pourcentage est supé-
immunoglobulines, et à la sélection des mutants rieur ou inférieur au seuil de 98 %. Le statut
ayant une affinité accrue pour leur cible antigé- mutationnel IGHV est un facteur à visée pronos-
nique. Pour des raisons encore mal élucidées, tique puissant, mais qui tend à devenir également
le taux de ces mutations somatiques dans les un facteur théranostique pour guider l’attitude
régions variables des gènes de chaînes lourdes des thérapeutique. À noter que contrairement à de
immunoglobulines (IGHV) constitue un facteur nombreux autres paramètres biologiques (géné-
pronostique majeur des leucémies lymphoïdes tiques notamment), le statut mutationnel IGHV
chroniques (LLC). Un taux de mutation inférieur est inchangé au cours de l’évolution de la maladie,
à 2 % (ou autrement dit une identité avec la et peut donc être réalisé à n’importe quel moment
séquence germinale d’origine de plus de 98 %) est de la prise en charge du patient.
un facteur de mauvais pronostic, l’inverse étant
vrai pour un taux de mutations supérieur à 2 %. Place dans la hiérarchie d’un
De plus, des séquences de BCR quasi identiques bilan d’exploration
(qualifiées de stéréotypiques) ont été décrites
Cet examen a une place dans le bilan pronos-
chez des patients différents, certaines d’entre elles
tique de la maladie, et est désormais à prendre en
ayant une valeur pronostique indépendante de
compte pour guider le choix thérapeutique.
leur statut mutationnel IGHV.
Nature du prélèvement Sang (sur EDTA) essentiellement. Rarement moelle osseuse ou biopsie ganglionnaire (fraîche,
congelée ou fixée et incluse en paraffine).
Recommandations pour la Il est parfois nécessaire de réaliser l’analyse à partir de l’ARN, ce qui nécessite un délai de transport
qualité du prélèvement de moins de 48 h.
Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 48 h).
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire et extraction de l’ADN. Possibilité de travailler
sur cellules congelées.
Principe méthodologique La méthode comporte plusieurs étapes :
1) amplification génique des réarrangements clonaux des gènes d’immunoglobulines par la
technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) (voir chapitre 19) ;
2) séquençage des produits de PCR par technique conventionnelle (Sanger) ou de nouvelle
génération (NGS) ;
3) comparaison de la séquence obtenue avec la séquence germinale la plus proche à l’aide d’outils
bio-informatiques spécifiques.
Type de méthode Méthode manuelle, pouvant être partiellement automatisable.

EEQ EEQ européen (ERIC : European Research Initiative on CLL).
Valeurs de référence/Perfor- Test spécifique de la LLC, aucune valeur n’a été démontrée à ce jour pour les autres hémopathies
mances du test lymphoïdes.
Causes d’erreur, limites du L’amplification des gènes IGHV peut parfois s’avérer impossible à partir de l’ADN (en raison de
test mutations somatiques) et nécessiter le recours à l’ARN. En outre, le statut mutationnel peut être
impossible à déterminer dans de rares situations : absence d’obtention d’un réarrangement
productif, présence de 2 réarrangements ayant des statuts mutationnels discordants (l’un muté,
l’autre non muté).
Fiche 19.4
Étude du profil mutationnel des hémopathies lymphoïdes
par séquençage haut débit
Signification biologique du paramètre du LYSA (LYmphoma Study Association) a permis

Les hémopathies lymphoïdes (B et T) sont un de proposer un panel de gènes d’intérêt pour les
groupe hétérogène d’hémopathies, dont la hémopathies lymphoïdes B ou T, publié en 2018.
nosologie intègre des données cliniques, mor- Il n’y a pas actuellement de consensus sur les
phologiques, phénotypiques, cytogénétiques et indications de l’analyse moléculaire des hémopa-
moléculaires. L’avènement des technologies de thies lymphoïdes.
séquençage du génome à haut débit a permis de
mettre en évidence des mutations récurrentes Place dans la hiérarchie d’un
dans certaines entités, dont la détection peut avoir bilan d’exploration
un impact pour le diagnostic positif, la stratifi-
En première ligne, il semble raisonnable d’avoir
cation pronostique ou la décision thérapeutique
recours au séquençage d’un lymphome en cas
(théranostique).
de diagnostic difficile, ou bien pour préciser le
pronostic (par exemple en déterminant le score
Objectifs de l’analyse et principales m7 FLIPI [Follicular Lymphoma International
indications de prescription Prognostic Index] dans le lymphome folliculaire),
L’objectif de l’analyse est de rechercher des muta- ou encore à visée théranostique (par exemple,
tions ponctuelles/insertions/délétions concer- recherche de mutations de TP53 dans la leucémie
nant un panel de gènes ayant un impact dans la lymphoïde chronique [LLC], qui sera alors traitée
prise en charge diagnostique, pronostique et/ou par un inhibiteur de la voie du BCR). En situation
théranostique des hémopathies lymphoïdes. Un de rechute ou de maladie réfractaire, l’analyse du
travail commun du GBMHM (Groupe de bio- profil mutationnel peut permettre de favoriser
logie moléculaire des hémopathies malignes) et l’inclusion dans un essai clinique de thérapie ciblée.
Nature du prélèvement De préférence ADN extrait de biopsie envahie congelée ou fixée et incluse en paraffine, en sachant que la
qualité de la technique est alors altérée.
Recommandations La qualité de l’ADN est optimale à partir de matériel congelé, ou de prélèvement sanguin ou médullaire si
pour la qualité du ces tissus sont envahis.
prélèvement
Contraintes d’achemi- Il est souhaitable que les biopsies parviennent à l’état frais au laboratoire d’anatomo-pathologie, qui
nement réalisera alors la congélation d’un fragment.
Mode de conservation Une fois congelés, les prélèvements peuvent être conservés à – 80 °C pendant plusieurs années.
Principe méthodolo- - Enrichissement de l’ADN tumoral par la constitution d’une librairie représentant le panel de gènes
gique d’intérêt (différentes stratégies existent : capture, amplicons, etc.).
- Séquençage des librairies.
- Analyse bio-informatique.
Type de test Mesure qualitative avec données quantitatives (fréquence d’allèles variants).
CIQ Maisons ou commerciaux.
EEQ Organisés par le GBMHM.

Performances du test Les performances sont largement dépendantes de facteurs pré-analytiques : degré d’envahissement
tumoral, qualité de l’ADN.
Les pipelines d’analyse bio-informatique sont très importants pour l’identification de polymorphismes et
de mutations pathologiques.
Causes d’erreur, limites - Difficultés d’interprétation de certains variants : est-ce une mutation somatique ou un polymorphisme
du test rare ? Ce variant a-t-il une signification biologique claire ?
- Hétérogénéité tumorale.
Bibliographie du chapitre 19 Langerak AW, Groenen PJ, Brüggemann M, et al. Euro-

Clonality/BIOMED-2 guidelines for interpretation
FICHE 19.1 – Recherche de clonalité B par PCR
and reporting of Ig/TCR clonality testing in sus-
multiplex
pected lymphoproliferations. Leukemia 2012;26:
van Dongen JJ, Langerak AW, Brüggemann M, et al.
2159–71.
Design and standardization of PCR primers and
protocols for detection of clonal immunoglobulin FICHE 19.3 – Statut mutationnel du locus de la
chaîne lourde des immunoglobulines (forfaitisé
and T-cell receptor gene recombinations in sus- avec les leucémies lymphoïdes chroniques)
pect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Sutton LA, Hadzidimitriou A, Baliakas P, et al. European
Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia Research Initiative on CLL (ERIC). Immunoglo-
2003;17:2257–317. bulin genes in chronic lymphocytic leukemia: key
Evans P, Pott Ch, Groenen PJ, et al. Significantly impro- to understanding the disease and improving risk
ved PCR-based clonality testing in B-cell mali- stratification. Haematologica 2017;102:968–71.
gnancies by use of multiple immunoglobulin gene Rosenquist R, Ghia P, Hadzidimitriou A, et al. Immuno-
targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action globulin gene sequence analysis in chronic lym-
BHM4-CT98-3936. Leukemia 2007;21:207–14. phocytic leukemia: updated ERIC recommendations.
Langerak AW, Groenen PJ, Brüggemann M, et al. EuroClo- Leukemia 2017;31:1477–81.
nality/BIOMED-2 guidelines for interpretation and Stamatopoulos K, Agathangelidis A, Rosenquist R, et al.
reporting of Ig/TCR clonality testing in suspected Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic
lymphoproliferations. Leukemia 2012;26:2159–71. leukemia. Leukemia 2017;31:282–91.
FICHE 19.2 – Recherche de clonalité T par PCR FICHE 19.4 – Étude du profil mutationnel des
multiplex hémopathies lymphoïdes par séquençage haut
van Dongen JJ, Langerak AW, Brüggemann M, et al. Des- débit
ign and standardization of PCR primers and protocols Rosenquist R, Rosenwald A, Du MQ, et al. European
for detection of clonal immunoglobulin and T-cell Research Initiative on CLL (ERIC) and the Euro-
receptor gene recombinations in suspect lymphoproli- pean Association for Haematopathology (EAHP).
ferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action Clinical impact of recurrently mutated genes on
BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003;17:2257–317. lymphoma diagnostics: state-of-the-art and beyond.
Brüggemann M, White H, Gaulard P, et al. Powerful Haematologica 2016;101:1002–9.
strategy for polymerase chain reaction-based clona- Sujobert P, Le Bris Y, de Leval L, et al. Définition d’un
lity assessment in T-cell malignancies Report of the panel minimal de gènes pour la prise en charge
BIOMED-2 Concerted Action BHM4 CT98-3936. des hémopathies lymphoïdes matures. Hématologie
Leukemia 2007;21:215–21. 2018;24:27–59.
Chapitre 20
Maladie résiduelle moléculaire

Fiche 20.1
Recherche et quantification d’une cible unique
d’oncogénétique somatique lors du diagnostic ou du
suivi d’une leucémie aiguë myéloblastique (ou maladie
résiduelle des LAM)
Code RIHN N451
Signification biologique du paramètre d’un renforcement du traitement de consolidation

La recherche de la maladie résiduelle dans les leu- (allogreffe de cellules souches hématopoïétiques).
cémies aiguës myéloblastiques (LAM) se réalise en • Détecter précocement une rechute, ce qui per-
général par la quantification d’une cible spécifique met d’anticiper un traitement.
de la maladie : • Suivre les patients allogreffés, ce qui per-
• un transcrit de fusion (PML-RARα pour les met, en fonction du résultat du chimérisme
leucémies promyélocytaires, CBFβ-MYH11 pour correspondant, de proposer des traitements
les LAM avec inversion du 16 ou t(16;16), immunomodulateurs. Le suivi par WT1 est
RUNX1-RUNX1T1 pour les LAM avec t(8;21), particulièrement intéressant en post allogreffe
pour les plus fréquentes. De nombreux autres car son expression sanguine est plus faible dans
transcrits peuvent également être suivis ; ce contexte que chez des sujets normaux. La
• une mutation somatique comme la mutation de sensibilité de WT1 reste cependant inférieure à
NPM1 ; une cible spécifique comme NPM1 muté ou un
• une hyperexpression de WT1, mais cette cible transcrit de fusion.
est moins spécifique de la pathologie, du fait
de son expression faible dans les progéniteurs Place dans la hiérarchie d’un
hématopoïétiques normaux. bilan d’exploration
Suivi précoce des LAM permettant une réorien-
Objectifs de l’analyse et principales tation thérapeutique (changement du pronostic
indications de prescription de la leucémie).
• Suivre la décroissance de la maladie résiduelle Selon les cibles, des suivis précoces peuvent être
(MRD), facteur pronostique de la pathologie en indiqués dans la moelle et des suivis tardifs dans le
particulier dans les LAM de type CBFβ-MYH11 sang. Un suivi sur les deux tissus (sang et moelle)
et RUNX1-RUNX1T1 ou NPM1 positives. Une doit être réalisé avant de changer de type de
MRD supérieure au seuil optimal défini permet prélèvement pour une interprétation correcte des
de reclasser le patient dans un groupe bénéficiant points de suivi.
Nature du prélèvement Moelle sur EDTA, sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT.
Recommandations pour La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en
la qualité du prélèvement blastes.
Contraintes Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT,
d’acheminement centrifuger avant envoi.
Possibilité d’envoi d’ADNc issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle (cDNA
correspondant à 1 µg équivalent ARN).

Principe méthodologique Ces recherches sont réalisées par PCR quantitative avec des amorces spécifiques de l’anomalie recherchée.
L’utilisation de la PCR digitale est en développement.
Chapitre 20. Maladie résiduelle moléculaire 303
Type de méthode Méthode manuelle partiellement automatisable.

CIQ Contrôles interlaboratoires.
EEQ Envisagé pour certaines cibles (GBMHM).
Valeurs de référence/ Bonne performance avec standardisation grâce à des gammes de plasmides de calibration.
Interprétation et
performances
Causes d’erreur, limites Quantité insuffisante de cellules, d’ARN. Dégradation de l’ARN.
du test
Fiche 20.2
Quantification d’une cible d’immunogénétique (Ig/TCR)
lors du suivi d’une leucémie lymphoblastique ou d’un
syndrome lymphoprolifératif (ou maladie résiduelle)
Code RIHN N450

La quantification de la maladie résiduelle (Mini- indications de prescription
mal Residual Disease, MRD) est un biomarqueur L’objectif est de réaliser une amplification clone-
puissant d’évaluation de la réponse au traitement spécifique de la région CDR32 des remaniements
dans les hémopathies malignes. La cinétique de IG/TR par Polymerase Chain Reaction (PCR)
disparition du clone lors des phases précoces Quantitative (Q-PCR). La sensibilité, entre 10-4
a souvent une valeur pronostique. Elle reflète et 10-5, est déterminée par la quantité d’ADN
la sensibilité de l’hémopathie au traitement et analysé. La prescription est souvent dictée par le
la réponse de l’individu. Elle est complémen- protocole thérapeutique dans lequel est inclus le
taire des marqueurs d’oncogénétique des cellules patient, surtout pour les LAL. Les points précoces
tumorales. Les remaniements clonaux des gènes permettent l’évaluation du pronostic et la stratifi-
codant pour les récepteurs à l’antigène des lym- cation du traitement. Les points tardifs peuvent
phocytes B et T, IG et TR, sont des marqueurs permettre un traitement préemptif, si la cinétique
spécifiques des clones présents dans la majorité de d’augmentation de la MRD est compatible avec
cancers lymphoïdes, et sont des cibles idéales pour une intervention thérapeutique.
la quantification de la MRD des leucémies aiguës
lymphoblastiques (LAL), du myélome multiple Place dans la hiérarchie d’un
(MM) et de certains lymphomes, comme le lym- bilan d’exploration
phome du manteau1.
Analyse de première intention pour le suivi des
LAL (adulte et enfant). Examen restreint aux
patients inclus dans des protocoles thérapeutiques
pour les hémopathies lymphoïdes matures.
1. Lymphome à cellules du manteau (LCM) ou Mantle Cell Lymphoma (MCL).

2. CDR3 : 3e Complementarity Determining Region. Les CDR sont les boucles peptidiques assurant la reconnaissance
spécifique d’un épitope particulier dans les domaines variables des immunoglobulines, codées par le réarrangement
des gènes IGH et des chaînes légères d’immunoglobulines.
Chapitre 20. Maladie résiduelle moléculaire 305
Nature du prélèvement Moelle ou sang sur tube EDTA.

Recommandations pour la Ne pas prélever sur héparine (inhibition de l’amplification). Le prélèvement du diagnostic doit être
qualité du prélèvement infiltré par au moins 1 % de cellules pathologiques. Pour les lymphomes, une biopsie fixée au formol
et incluse en paraffine1 peut être utilisée si de l’ADN de qualité appropriée est obtenu. Le tissu
congelé est cependant préférable. Pour les prélèvements de suivi, il est nécessaire de disposer de 1
à 10 millions de cellules (15 mL de sang ou 1 à 2 mL de moelle osseuse, éviter l’hémodilution).
Contraintes Sang ou moelle frais (sous 48 h) préférable. Il est possible de séparer les cellules mononucléées sur
d’acheminement gradient de ficoll, et de les conserver en vapeur d’azote liquide ou à – 80 °C avant de les acheminer
en carboglace.
Mode de conservation Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire.
Principe méthodologique Un séquençage des IG/TR est effectué au diagnostic, par technique de Sanger ou NGS-amplicon.
Une PCR clone-spécifique est dessinée utilisant une amorce dirigée contre le CDR3. La quantification
aux points de suivi est réalisée par Q-PCR en comparaison à l’ADN du patient au diagnostic. Des
alternatives sont en cours d’évaluation : PCR digitale en gouttelette (ou digital droplet PCR – ddPCR),
surtout pour les lymphomes, et le NGS amplicon, surtout pour les MM. Il est nécessaire de disposer
d’une gamme de quantification pour la Q-PCR et d’un étalon interne pour le NGS.
CIQ Maison.
EEQ Euro-MRD au sein de l’ESLHO2 pour la Q-PCR, la ddPCR et le NGS (détection des cibles).
Valeurs de référence/ Il s’agit d’une mesure quantitative de la réponse au traitement. La sensibilité est déterminée par la
Interprétation et quantité d’ADN analysé, la spécificité et la performance de l’amorce allèle spécifique (l’AJO/ASO ou
performances anti-junctional allele-specific oligonucleotide) et se situe habituellement entre 10-4 et 10-5.
Causes d’erreur, limites Inhibiteur d’ADN. Hémopathie non-informative car absence de remaniement clonal identifiable par
du test PCR et séquençage au diagnostic (absence de prélèvement envahie, LAL très immature ou MM/
lymphome ayant subi trop de mutations somatiques des IGH, séquence CDR3 inappropriée, etc.).
1. Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE).

2. ESLHO : European Scientific Foundation of Hemato-Oncology.
Bibliographie du chapitre 20 document from ELN MRD Working Party. Blood

FICHE 20.1 – Recherche et quantification d’une 2018;131:1275–91.
cible unique d’oncogénétique somatique lors FICHE 20.2 – Quantification d’une cible
du diagnostic ou du suivi d’une leucémie aiguë d’immunogénétique (Ig/TCR) lors du suivi d’une
myéloblastique (ou maladie résiduelle des LAM) leucémie lymphoblastique ou d’un syndrome
Jourdan E, Boissel N, Chevret S, et al. French AML lymphoprolifératif (ou maladie résiduelle)
Intergroup. Prospective evaluation of gene muta- van Dongen JJ, van der Velden VH, Brüggemann M, et al.
tions and minimal residual disease in patients with Minimal residual disease diagnostics in acute lym-
core binding factor acute myeloid leukemia. Blood phoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and stan-
2013;121:2213–23. dardized technologies. Blood 2015;125:3996–4009.
Willekens C, Blanchet O, Renneville A, et al. French AML Kumar S, Paiva B, Anderson KC, et al. International Mye-
Intergroup. Prospective long-term minimal residual loma Working Group consensus criteria for response
disease monitoring using RQ-PCR in RUNX1- and minimal residual disease assessment in multiple
RUNX1T1-positive acute myeloid leukemia : results myeloma. Lancet Oncol 2016;17:e328–46.
of the French CBF-2006 trial. Haematologica Ladetto M, Buske C, Hutchings M, et al. ESMO Lym-
2016;101:328–35. phoma Consensus Conference Panel Members.
Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and ESMO consensus conference on malignant lym-
management of AML in adults: 2017 ELN recom- phoma: general perspectives and recommendations
mendations from an international expert panel. for prognostic tools in mature B-cell lymphomas
Blood 2017;129:424–47. and chronic lymphocytic leukaemia. Ann Oncol
Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S, et al. Minimal/ 2016;27:2149–60.
measurable residual disease in AML: consensus
Chapitre 21
Autres techniques moléculaires

Fiche 21.1
Séquençage haut débit (NGS)
Codes RIHN N452, N453, N454
Signification biologique du paramètre La majorité des cancers résulte d’évènements

Le NGS (Next Generation Sequencing) permet le mutationnels somatiques ou germinaux. Au
séquençage en parallèle de milliers de fragments cours des dernières années, de nombreuses
d’ADN. études NGS ont été menées pour fournir un
Il peut être utilisé à travers différentes approches : profil moléculaire complet des cancers, pour
le séquençage du génome entier, de l’exome cor- identifier de nouvelles altérations génétiques
respondant au séquençage de toutes les régions conduisant à l’oncogenèse, pour étudier l’hété-
codantes du génome, du transcriptome pour étude rogénéité, la complexité et l’évolution tumorale.
de l’ARN, du méthylome pour l’analyse épigéné- Ces efforts ont fourni des résultats significa-
tique et enfin le séquençage ciblé de gènes d’intérêt. tifs pour de nombreuses hémopathies malignes
tels les leucémies aiguës (LA), les syndromes
myélodysplasiques (SMD), les néoplasies myelo-
prolifératives (NMP) et les syndromes lympho-
prolifératifs (SLP)/lymphomes.
Le séquençage du génome à l’aide des technolo-
gies de NGS permet de caractériser les mutations
et polymorphismes d’un seul nucléotide (SNP : Place dans la hiérarchie d’un
Single Nucleotide Polymorphism), les insertions et bilan d’exploration
les délétions (indels) de quelques bases, l’analyse Les recherches de mutations par NGS doivent
de la variabilité du nombre de copies (CNV : Copy être effectuées en première intention lorsque leur
Number Variation) permettant d’analyser les aber- détection peut revêtir un intérêt :
rations chromosomiques telles que l’aneuploïdie. • diagnostic : pour les patients atteints de SMD,
L’application la plus classique du NGS est le LAM, SLP, NMP, les mutations détectées par
séquençage d’un panel de gènes ou de certaines NGS peuvent permettre d’établir une meilleure
de leurs régions d’intérêt spécifiques, le but étant classification pronostique et donc une meilleure
de se focaliser sur des régions codantes spéci- prise en charge thérapeutique ;
fiques. • théranostique lorsqu’elle peut être visée par
Des mutations sont présentes dans de nom- une thérapie ciblée. On peut citer les mutations
breuses pathologies, notamment dans la plupart de BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chro-
des cancers et dans certains syndromes, ce qui nique (LMC) ou les LA lymphoblastiques (LAL)
justifie leur recherche et leur identification. C’est PH1 + , ou encore les mutations de la voie BTK
également le cas en génétique pré-implantatoire. (Bruton Tyrosine Kinase) dans les SLP.
Nature du prélèvement Sang ou moelle sur tube EDTA. Culots cytogénétiques. Coupes de tissu (ganglion le plus souvent)
congelées, voire paraffinées.
Recommandations pour la Les coupes de tissu congelé sont à privilégier par rapport aux coupes paraffinées qui génèrent des
qualité du prélèvement fragments plus courts d’ADN autour de 100 à 200 paires de bases.
Contraintes d’acheminement Moins de 24 h.
Mode de conservation Entre + 15 et + 30 °C, ou congelé à – 80 °C après extraction.
Chapitre 21. Autres techniques moléculaires 309
Principe méthodologique Les principales technologies utilisées permettent d’obtenir des fragments courts.
Étapes communes aux différentes technologies :
- +/- fragmentation de l’ADN ;
- préparation d’une librairie avec des adaptateurs ;
- amplification clonale par émulsion ou bridge PCR ;
- séquençage par pyroséquençage ou fluorescence ;
- analyse bio-informatique des données générées.
Type de méthode Méthode manuelle, +/- automatisable.
Type de test Mesure quantitative indiquant la fréquence d’allèles variants.
CIQ Maisons ou commerciaux.
EEQ Par le GBMHN.
Performances du test Plus rapide et moins onéreux que la méthode Sanger.
Permet également d’augmenter la sensibilité de détection des mutations jusqu’à 1 %.
Causes d’erreur, limites du Matériel de mauvaise qualité, hétérogénéité tumorale.
test Présence d’homopolymères pour les techniques par pyroséquençage.
Erreur de séquençage pour les techniques par fluorescence.
Caractérisation pathologique parfois délicate de variants peu ou pas décrits.
Fiche 21.2
Chimérisme moléculaire
Codes RIHN G179, G180, G225

L’objectif d’une allogreffe de cellules souches indications de prescription
hématopoïétiques (Allo-SCT)1 est de rempla- Cet examen est prescrit dans les suites d’Allo-SCT
cer le tissu hématopoïétique du receveur, que réalisée :
l’on espère avoir éliminé par la procédure de • pour consolider le traitement d’une hémopa-
conditionnement (chimiothérapie, irradiation thie maligne : leucémie aiguë lymphoblastique
corporelle totale), par un nouveau tissu hémato- ou myéloblastique, néoplasie myéloproliférative
poïétique issu des cellules souches transplantées (myélofibrose), myélodysplasie, certains lym-
du donneur. Le greffon peut être de la moelle phomes agressifs ;
osseuse ou des cellules souches périphériques • en cas d’aplasie médullaire.
CD34+ mobilisées avant d’effectuer une cyta- La décision d’Allo-SCT relève d’une réunion
phérèse. Il peut aussi d’agir de sang de cordon. de concertation pluridisciplinaire (RCP). Les
Les donneurs sont des membres de la famille points de suivi des patients sont bien codifiés.
du receveur ou des donneurs volontaires non En fonction des résultats de la mesure du chi-
apparentés inscrits sur un fichier international. La mérisme, certains patients pourront bénéficier
recherche du chimérisme consiste à rechercher les d’une injection de lymphocytes du donneur2
proportions de cellules du donneur et du receveur pour consolider la prise du greffon.
dans le sang, la moelle, ou des sous-populations
cellulaires (lymphocytes T CD3+, cellules médul-
laires CD34+) du receveur. Cet examen permet Place dans la hiérarchie d’un
d’évaluer le degré de reconstitution hématopoïé- bilan d’exploration
tique (prise du greffon), son maintien dans le C’est un examen normalement codifié quant aux
temps, mais également de suspecter un rejet de points de suivi. Une recherche spécifique peut
la greffe (disparition du greffon) ou la survenue être prescrite en cas d’anomalies de la NFS ou
d’une rechute qui concerne toujours (sauf cas de manifestations cliniques suggérant une perte
exceptionnels) des cellules du receveur. du greffon.
Nature du prélèvement Sang périphérique ou moelle osseuse.

Recommandations pour la Prélèvement sur EDTA.
Contraintes d’acheminement Aucune.
Mode de conservation Température ambiante ou réfrigération à + 4 °C.
Principe méthodologique Lorsque le donneur est identifié et sélectionné, un échantillon de sang est adressé au laboratoire
pour identifier les marqueurs moléculaires permettant de différencier son ADN de celui du
receveur. Les marqueurs les plus simples sont ceux liés aux chromosomes sexuels. Toute une série
d’autres marqueurs polymorphiques a été caractérisée et est testée dans un panel d’amplification.
Les polymorphismes les plus discriminants, un spécifique du donneur et un spécifique du receveur,
sont repérés. Ils font l’objet, pour chaque couple donneur/receveur et à chaque point de mesure,
après extraction de l’ADN des cellules du receveur, d’une amplification en PCR quantitative
en temps réel. Un gène de ménage, tel que l’albumine, est amplifié en parallèle afin d’évaluer
les proportions relatives de cellules du donneur et du receveur. Les résultats sont rendus en
pourcentages.
Plus récemment, des techniques reposant sur l’amplification de petits motifs répétitifs en tandem
(short tandem repeats) ou sur le séquençage haut débit (NGS) ont été développées.
Type de méthode Méthode manuelle, semi-automatisée pour le NGS.

CIQ Non.
EEQ Non.
Valeurs de référence/Inter- De manière générale, une recherche de chimérisme identifiant au moins 98 % de cellules du
prétation et performances donneur est le signe d’une reconstitution complète : prise de greffon. Il faut noter que cette évalua-
tion sur du sang total n’est pas forcément retrouvée lorsque des sous-populations spécifiques
(triées préalablement à l’extraction d’ADN) sont testées, comme les lymphocytes T ou les cellules
souches. La signification de ces discordances fait encore l’objet de recherches.
Causes d’erreur, limites du Mauvaise qualité de l’ADN, mauvaise amplification du gène de ménage, tri cellulaire peu
test performant.
1. Allo-SCT: Allogeneic Stem Cell Transplantation.

2. DLI : Donor Lymphocyte Infusion.
Fiche 21.3
Recherche des transcrits de fusion dans les leucémies
aiguës
Signification biologique du paramètre • d’identifier les types de leucémies éligibles à

Les leucémies aiguës lymphoblastiques ou myé- une thérapeutique spécifique (transcrit PML-
loïdes présentent fréquemment des réarrangements RARA de la LAM3, LAL-B avec transcrit BCR-
chromosomiques récurrents (translocations ou ABL1 notamment) ;
délétions) résultant en gènes de fusion ayant une • d’affiner le pronostic de la maladie et d’appli-
activité oncogénique. Ces réarrangements définis- quer des critères de stratification thérapeu-
sent souvent des entités de leucémie, certaines tique ;
étant intégrées à la classification internationale des • d’identifier des marqueurs de maladie rési-
hémopathies (WHO 2016) et pouvant avoir un duelle qui serviront à évaluer la réponse au
impact sur le traitement. De nombreuses données traitement.
de la littérature associent des anomalies molécu-
laires spécifiques au pronostic de la leucémie, per- Place dans la hiérarchie d’un
mettant de guider la prise en charge thérapeutique bilan d’exploration
la plus adaptée. Certaines anomalies moléculaires
La recherche des transcrits de fusion des leucémies
peuvent aussi constituer des cibles thérapeutiques.
aiguës par RT-PCR est un examen de seconde
Les réarrangements chromosomiques peuvent
intention au diagnostic, orienté par l’analyse cyto-
être détectés en cytogénétique (caryotype et/
logique (LAL ou LAM, présence d’anomalies
ou FISH) et les gènes de fusion correspondants
morphologiques évocatrices) et la cytométrie en
peuvent également être mis en évidence en bio-
flux (LAL B ou T). Ces analyses complètent et
logie moléculaire. Ce sont alors généralement les
confirment les examens de cytogénétique. Les
transcrits de fusion produits qui sont recherchés,
anomalies devant être systématiquement recher-
par RT-PCR à partir de l’ARN extrait des cellules.
chées sont notamment :
Les transcrits de fusion peuvent être également
• PML-RARA associé à la t(15 ;17) dans la
mesurés de façon quantitative et ainsi constituer
LAM3 (LA promyélocytaire) ;
un marqueur pour le suivi de maladie résiduelle.
• CBFB-MYH11 associé à l’inv(16) dans les
LAM avec éosinophiles anormaux
Objectifs de l’analyse et principales • AML1-ETO associé à la t(8 ;21) dans les
indications de prescription LAM ;
Cette analyse vise à caractériser la leucémie d’un • BCR-ABL1 associé à la t(9 ;22) dans les LAL-B.
patient donné. Cette caractérisation permet :
Nature du prélèvement Moelle, sang, LCR ou tissus divers (en cas d’envahissement extra-médullaire).
Recommandations pour la qualité du Les prélèvements de sang et de moelle doivent être réalisés sur anticoagulant EDTA.
prélèvement Les tissus doivent être frais, non fixés, ou congelés à – 180 °C.
Contraintes d’acheminement Les prélèvements frais doivent être acheminés à température ambiante.
Les ARN étant des molécules instables, un acheminement rapide des prélèvements est
recommandé (moins de 48 h entre le prélèvement et la congélation). Si ce délai ne peut
être respecté, le prélèvement doit être traité pour isoler les cellules mononucléées (Ficoll)
et les congeler à – 80 °C, pour un acheminement différé en carboglace.
Mode de conservation Température ambiante (< 24 heures) ou congélation à – 80 °C des cellules mononu-

cléées (culot sec, DMSO ou réactif dédié à la conservation des ARN). Tissus : congélation
à – 180 °C.
Principe méthodologique La détection de ces anomalies est basée sur l’amplification des transcrits de fusion,
par utilisation d’amorces spécifiques se situant de part et d’autre de la fusion sur les
deux gènes impliqués. L’utilisation de nouvelles techniques de type RT-MLPA permet de
détecter simultanément un grand nombre de transcrits de fusion.
Type de méthode Méthode généralement manuelle.
Type de test Mesure qualitative (RT-PCR en point final) ou quantitative (RT-PCR quantitative en temps
réel).
CIQ CIQ maison, souvent des lignées cellulaires.
EEQ Il n’existe pas actuellement d’EEQ pour la plupart des cibles analysées, sauf BCR-ABL1.
Valeurs de référence/Interprétation et Ces anomalies sont par définition absentes des cellules normales.
performances Méthodes sensibles et spécifiques à visée diagnostique, pronostique, théranostique et
pour l’évaluation de la réponse au traitement (maladie résiduelle).
Causes d’erreur, limites du test Dégradation des ARN. Possibilité de contaminations.
Les techniques de RT-PCR, par principe, ne détectent que les transcrits de fusion
correspondant aux amorces choisies. La recherche de réarrangements impliquant des
partenaires variables (cas de MLL) ou des points de cassures variables ne peut être
exhaustive par RT-PCR. Les techniques de RT-MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification) multiplexant un grand nombre de sondes permettent de rechercher
simultanément de nombreux transcrits de fusion. Seule la technique de RNA-seq permet
de rechercher tous les transcrits de fusion possible sans connaissance préalable du
transcrit présent.
Bibliographie du chapitre 21 Kim J, Hwang IS, Kim HS, et al. Bone marrow chime-
rism detection using next generation sequencing
FICHE 21.1 – Séquençage haut débit (NGS)
based on single nucleotide polymorphisms following
Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, et al.
liver transplantation : comparison with short tandem
Cancer genome landscapes. Science 2013;339:
repeat-PCR. Ann Lab Med 2016;36:82–4.
1546–58.
FICHE 21.3 – Recherche des transcrits de fusion
Koboldt D, Steinberg KM, Larson DE, et al. The next-
dans les leucémies aiguës
generation sequencing revolution and its impact on
Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revi-
genomics. Cell 2013;155:27–38.
sion to the World Health Organization classification
FICHE 21.2 – Chimérisme moléculaire of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood
Alizadeh M, Bernard M, Danic B, et al. Quantitative 2016;127:2391–405.
assessment of hematopoietic chimerism after bone Ruminy P, Marchand V, Buchbinder N, et al. Multiplexed
marrow transplantation by real-time quantitative targeted sequencing of recurrent fusion genes in
polymerase chain reaction. Blood 2002;99:4618–25. acute leukaemia. Leukemia 2016;30:757–60.
Index
A ASXL1 (mutation), 287

Absorption, 250 Auto-anticorps
ACC lupique, 87 –– ADAMTS13, 208
Activité amidolytique, 171 –– anti-facteurs de la coagulation, 93
Agglutinines froides, 248 –– protéine S, 214
Agglutinines irrégulières (RAI), 240 Auto-anticorps anti-érythrocytaires, 240
Agrégation (plaquettaire), 121 B
Allo-anticorps BCR-ABL1
–– anti-érythrocytaires, 250 –– mutations, 274
–– anti-plaquettes, 258 –– transcrits, 272
–– anti-polynucléaires neutrophiles/anti HNA, 256 Bilirubine, 51
Amylose, 99 Biologie moléculaire, 21
Anémie, 4 Butyrate estérase, 19
–– arégénérative, 42 C
–– auto-immune, 23 Caillot, 91
–– corpusculaire, 53 Calréticuline (mutation), 279
–– hémolytique, 53 Carence, 55, 60
–– macrocytaire, 4 Carence martiale, 60
–– microcytaire, 4 Caryotype, 17, 266
–– régénérative, 53 CD (Cluster of differentiation), 28
Annexine V, 135 CD34, 30
Anticoagulants circulants, 86 CEBPa (mutation), 286
Anticoagulants oraux directs, 85 Cellules souches périphériques, 30
Anticorps Chimérisme moléculaire, 310
–– anti-plaquettes, 197 Chirurgie cardiaque, 197
–– FP4, 197 Clonalité B, 292
Anticorps monoclonaux, 28 Clonalité T, 293
Anti-IIa, 193 Coagulation, 84, 109
–– dabigatran, 193 –– voie extrinsèque, 84
–– idarucizumab (antidote), 193 Coagulation intravasculaire disséminée, 17
Antiphospholipides, 84 Coagulopathie, 84
Antithrombine, 165 Coefficient de saturation de la transferrine, 60
Antivitamine K, 84 Collagène, 121
Anti-Xa, 188, 191 Contexte obstétrical, 240
–– apixaban, 191 CSF3R et SETBP1 (mutations), 281
–– danaparoïde, 188 Cycle cellulaire, 35
–– edoxaban, 191 Cytochimie, 19
–– fondaparinux, 188 Cytométrie en flux, 15, 28
–– rivaroxaban, 191 Cytopénie, 4
Aplasie médullaire, 11 Cytosquelette, 51
Apoptose, 35 D
Asparaginase, 165 D-Dimères, 152

316 Index
Dopage, 7 H
Drépanocytes, drépanocytose, 42 Haptoglobine, 51, 65
E Heinz (corps de), 45
Ektacytométrie, 49 Hématies, 4
Électrophorèse, 54 Hématies cibles, 42
Elliptocytes, elliptocytose, 42 Hématocrite, 6
Élution d'anticorps, 252 Hémochromatoses, 60
Éosine maléimide, 49 Hémoglobine, 4, 47
Épreuve directe de compatibilité, 244 –– fœtale, HbF, 47
Érythropoïèse, 62 –– HbA, 70
Érythropoïétine, 6 –– HbC, 70
Euglobulines, 137 –– HbE, 71
F –– HbS, 44
Facteur tissulaire, 84 Hémoglobinose C, 49
Facteurs (de la coagulation) Hémoglobinurie paroxystique
–– Facteur V Leiden, 180 nocturne, 31
–– I (fibrinogène), 84 Hémogramme, 4
–– II (prothrombine), 84 Hémojuveline, 66
–– IX (facteur antihémophilique B), 103 Hémolyse, 31
–– V (proaccélérine), 95 Hémopathies lymphoïdes, 297
–– VII (proconvertine), 84 Hémopathies malignes, 21
–– VIII (facteur antihémophilique A), 101 Hémophagocytose, 19
–– X (facteur Stuart), 84 Hémophilie, 143
–– XI (facteur Rosenthal), 86 Hémorragie/maladie hémorragique, 91
–– XII (facteur Hageman), 107 Hémostase, 109
–– XIII (facteur de stabilisation de la fibrine), 139 Héparine de bas poids moléculaire, 188
Falciformation, 44 Héparine non fractionnée, 86
Fer, 62 Hepcidine, 62
Ferritine, 60 Hypovitaminose, 95
Ferroportine, 66 I
Fibrine, 91 IDH (mutations), 287
Fibrinogène, 84 Immunophénotypage, 21
Fibrinolyse, 91 Indice d'anticoagulant circulant, 87
FISH, 268 Inflammation, 64
FLT3 (mutations), 284 INR, 84
Formule, 13 Isopropanol, 73
Fransferrine, 62 J
Frottis sanguin, 13 JAK2, 6
G –– mutation exon 12, 278
Ganglion, 15 –– mutation JAK2V617F, 276
Glanzmann (thrombasthénie de), 119 K
Globules blancs, 4 Kininogène, 86
Glycoprotéine Ib plaquettaire, 126 Kleihauer (test de), 47
Grossesse/obstétrique/contexte obstétrical/ L
accouchement, 6, 230, 240 Lavage broncho-alvéolaire, 15
Groupes sanguin Leucémie, 4, 15
–– biologie moléculaire, 236 Leucémie aiguë, 302
Groupes sanguins, 230 Leucémie lymphoïde chronique, 295
–– ABO, 230 Leucémie myéloïde chronique, 272
–– RH, 230 Leucocytes, 4
–– Rh-K, 232 Leucocytose, 4
Guthrie (test de), 78 Leucopénie, 4
Index 317
Liquide biologique, 15 Purpura fulminans, 169

Liquide céphalo-rachidien, 15 Purpura thrombopénique idiopathique, 11
Lupus (ACC lupique), 86, 102, 178 Purpura thrombopénique immunologique, 259
Lymphocytes, 4 Purpura thrombotique thrombocytopénique, 210
Lymphome, 15 R
M Récepteur soluble de la transferrine, 64
MAIPA, 258 Résistance globulaire, 49
Maladie de Vaquez, 4, 6, 55, 276 Réticulocyte, 8
Maladie résiduelle moléculaire Rhésus, 47
–– des LAL, 304 Ristocétine, 115
–– des LAM, 302 RUNX1 (mutation), 287
–– des syndromes lymphoprolifératifs, 304 S
Maladie thromboembolique, 87 Schizocytes, 42
Médicaments antiplaquettaires, 201 Séquençage haut débit/NGS, 308
Mégacaryocyte, 11 Sidéroblaste, 19
Minkowski-Chauffard, 49 Sphérocytes, 42
Monocytes, 4 Sphérocytes, sphérocytose, 42, 45, 51
MPL (mutation), 280 Statut mutationnel des gènes des immunoglobulines,
Myélofibrose, 276 282, 295
Myélogramme, 17 Stomatocytes, stomatoytose, 42
Myéloperoxydase, 19 Surcharge, 60
N Syndrome d'activation macrophagique (SAM), 60
Néoplasie myéloproliféative (syndrome Syndrome de Bernard Soulier, 9
myéloprolifératif), 272 Syndrome des antiphospholipides, 178
Néoplasie myéloproliférative, 4 Syndrome hémolytique, 42, 246, 252
NPM1 (mutation), 13, 284 Syndrome hémorragique, 84
O Syndrome lymphoprolifératif, 28
Oxymétrie, 76 Syndrome myélodysplasique, 19, 282
P Syndrome MYH9, 9
Paludisme, 42 Syndromes myélodysplasiques (SMD), 55, 282
Panel, 28 T
Perls, 19 Taux de prothrombine (temps de Quick), 84
Plaquettes, 4, 9 Temps d'occlusion plaquettaire, 119
–– géantes, 9 Temps de céphaline avec activateur, 84
–– grises, 9 Temps de Quick, 84
–– Volume Plaquettaire Moyen, 4 Temps de thrombine, 195
Plasmine, 154 Test de Coombs, 31
Plasminogen activator inhibitor-1, 141 Test direct à l'antiglobuline, 246
Plasminogène, 212 Thalassémie, 45
Ploïdie, 35 Thrombocyte, 9
PML, 13 Thrombocytémie essentielle, 11
Polycythemia Vera, 4, 6, 276 Thrombocytose, 4
Polyglobulie, 4 Thromboélastogramme, 109
Polymorphisme érythrocytaire, 234 Thromboembolique (maladie, événement,
Polynucléaires, 4 risque), 167
Prékallikréine, 86 Thrombopathie, 126
Produits de dégradation de la fibrine, 154 Thrombopénie, 4, 197
Protéine C, 93 –– induite par l'héparine (TIH), 197
Protéine S, 95 Thrombophilie, 169
Prothrombinase, 95 Thromboplastine, 84
Prothrombine, 84 Thrombopoïétine, 11
–– polymorphismes, 180 Thromboses, 31, 91, 165, 169, 178, 199
318 Index
TP53 (mutation), 287 W

TRALI, 256 Willebrand
Transcrits de fusion, 312 –– activité inhibitrice du, 131
Transferrine, 62, 64 –– facteur, 86
Transfusion, 230 –– maladie, 101
–– concentrés de globules rouges, 240 –– multimères, 128
–– concentrés plaquettaires, 109 –– propeptide, 130
V –– protéase du (ADAMTS13), 208, 210
Vitesse de sédimentation, 23 X
Vitré, 15 X (facteur Stuart)
Voie endogène de la coagulation, 105 –– V (proaccélérine), 84

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Pr Marie Christine Béné

Collège national des enseignants d’hématologie, Société

Odile Blanchet, CHU d’Angers. Maxime Delrue, AP-HP, hôpital Lariboisière,

Claudine Caron, CHU de Lille. Claire Flaujac, CH de Versailles.

Jacques Chiaroni, EFS Provence-Alpes-Côte- Loïc Garçon, CHU d’Amiens.

Yves Gruel, CHU hôpital Trousseau, Tours. France Pirenne, EFS Île-de-France.

Pierre Morange, AP-HM, CHU La Timone, Catherine Ternisien, CHU de Nantes.

2 HG 2 Hydroglutarate CSTf Coefficient de saturation

GR Globule rouge MCL Mantle Cell Lymphoma

RPT Réaction post-transfusionnelle TDA Test direct à l’antiglobuline

Guide des analyses en hématologie

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA di ou tripotassique.

Signification biologique du paramètre de l’érythropoïétine liée à la mutation V617F

Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA.

Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA.

Signification biologique du paramètre certains traitements (fer, vitamine B12, érythro-

Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA.

Signification biologique du paramètre le SMYH9) et ne sont pratiquement pas colorées

Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA ou sur citrate de sodium.

Type de test Mesure quantitative et qualitative.

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA.

Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA.

Signification biologique du paramètre • vitré : recherche d’un lymphome oculaire ; dans

Nature du prélèvement Dépend du site prélevé.

Signification biologique du paramètre • une insuffisance rénale ou une neuropathie péri-

Signification biologique du paramètre d’appartenance des blastes de leucémie aiguë.

Type de méthode Méthode manuelle.

Signification biologique du paramètre précisé et complété afin d’orienter au mieux le

Nature du prélèvement Sang, moelle osseuse, ganglions, tumeurs, épanchements.

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA.

Bibliographie du chapitre 1 immune thrombocytopenia : a multicentric, real life

Guide des analyses en hématologie

Signification biologique du paramètre cellule : présentation ou reconnaissance de l’antigène,

Signification biologique du paramètre dans le sang des cellules mobilisées (facteurs de

Place dans la hiérarchie d’un

Signification biologique du paramètre toute hémolyse à test de Coombs négatif, les

Nature du prélèvement Sang sur EDTA.

Signification biologique du paramètre Par exemple, l’immunophénotypage d’une leucé-

Place dans la hiérarchie d’un

3. Voir aussi la fiche 2.1, Phénotypage des cellules anormales, NABM 1103.

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Nature du prélèvement Sang périphérique ou aspiration médullaire.

Nature du prélèvement Sang périphérique ou aspiration médullaire.

Signification biologique du paramètre le présentent (cellules tumorales ou infectées

Guide des analyses en hématologie

Signification biologique du paramètre • hématies cibles : carences en fer, certaines

Nature du prélèvement Sang total sur EDTA.

Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales

Nature du prélèvement Sang total sur EDTA.

Signification biologique du paramètre tétramères de chaînes de β globine très instables

Nature du prélèvement Sang total sur EDTA.

Nature du prélèvement Sang total sur EDTA.

Type de méthode Méthode manuelle.

Signification biologique du paramètre courbe vers la droite). Le diagnostic de SH repose

Type de méthode Méthode manuelle.

Signification biologique du paramètre nouveau-né. Dans ces pathologies, la perte de sur-

EEQ Non commercialisé.

L’électrophorèse des protéines de la membrane et des stomatocytoses deshydratées (xérocytose)

Signification biologique du paramètre Dans l’anémie associée à l’insuffisance rénale, le