Notions de cytogénétique

Dr OUEDRAOGO R Alexis
 Plan
1. Généralités
2. Chromosomes
3. Cytogénétique
3.1. Caryotype
3.2. HISF
4. Anomalies
 1. Généralités
Définitions
• Cytogénétique:
Etude des chromosomes, et de la façon dont les
variations de structure et/ou du nombre sont liées
à la maladie
• Chromosome:
Support du matériel héréditaire, constitué d’une
molécule d’ADN et de protéines. Il n’est bien
visible que lors de la division cellulaire
• Caryotype:
Etude du nombre et de la structure des
chromosomes d’un individu.
 2. Chromosomes
2.1. Structure
• Constitué de molécule d’ADN
• Support de l’information génétique
• Bien visible que pendant une courte période
Disposition de l'ADN dans le chromosome
• Deux brins disposés en une double hélice
Chaque brin est une succession de nucléotides
(une base azotée, un désoxyribose et un
groupement phosphaté).
• Longueur de la double hélice d’une cellule: environ
1,90 m
• Longueur totale des chromosomes d’une cellule:
environ 220 µm
 Base azotée

Groupement
phosphaté

Désoxyribose

Formule développée d’une portion de la double hélice

• Chromosome: fibre d'ADN et histones
• Microscopie électronique
- Fibre fine formée par un alignement de particules,
reliées par des filaments: perles d'un collier
La fine fibre = Fibre nucléosomique (structure primaire)
composée de nucléosomes et liens internucléosomiques
• A l'état normal les liens sont enroulés
- l'ensemble forme filament de 10 nm de diamètre:
Le nucléofilament.
- Il réalise une 1ère condensation de l'ADN
- 2ème niveau de compaction:
* Modèle solénoïde
* modèle en super boules
2.2. Les différentes parties du chromosome

- une zone étranglée : centromère

- 2 bras: p et q
- extrémité des bras: télomère
• Centromère:
- Région où s'attachent les microtubules.
- Sur le plan moléculaire:
* séquences d'ADN répétées un grand nombre de
fois
* sans rôle de transcription connu.
• Les 2 bras:
- Deux segments principaux
- Séparés par le centromère
- Chacun est constitué de 2 chromatides

• Selon la position du centromère:

3 types de chromosome
(1) Métacentrique
- Centromère centrale

(2) Submétacentrique
- Centromère non centrale

(3) Acrocentrique
- Centromère près de l'extrémité
• Télomère du chromosome

- Chromomères terminaux
- Ferme le bout des chromosomes normaux
- Ne peuvent pas se lier avec les autres bouts du
chromosome cassé.
 3. Cytogénétique
• Deux niveaux: conventionnelle, moléculaire
• Chromosomes: lors de la division cellulaire
• Techniques : cellules bloquées à ce stade
• cellules en phase de multiplication active:
spontanément
culture préalable
• Blocage des cellules en mitose
• Coloration des préparations
 3.1. Caryotype
- Arrangement standard de l’ ensemble des
chromosomes d’une cellule
- Photographié selon 1 format standard par paire
 3.1. Caryotype
3.1.1. Réalisation pratique(10 étapes)

• Prélèvement
• Mise en culture
• Incubation
• Arrêt
• Choc hypotonique
• Fixation
• Etalement
• Murissement
• Coloration
• Observation
 3.1. Caryotype
1- Prélèvement
- Conditions d’asepsie
- S’assurer de la non prise d’antibiotique ou
d’antimitotique)
- 5ml de sang dans 2 tube d’ héparine sodique
 3.1. Caryotype
2-Mise en culture
- 5ml de milieux de culture + 500µl de sang
- Dévisser et place dans étuve à CO2
 3.1. Caryotype
3 à 4. Incubation (72h) et arrêt
- Les deux tubes dans l’étuve à CO2
- 72ème H, arrêt culture(colchicine) 0,5mg/tube
- Centrifuger à 1200tr/mn pendant 10 mn
- Aspirer le surnagent jusqu’à 1cm du culot
 3.1. Caryotype

5-Choc hypotonique
- KCl 75Mmol, porté à 37°C
- Verser avec pipete pasteur dans la solution en
vortextant
- Replacer tube sans incliner et incuber 25mn,37°
- Centrifuger à 1200 tr/ mn pendant 10 mn
- Aspirer le surnageant
 3.1. Caryotype

6-fixation ( très capitale pour réussir)

- Ajouter le fixateur goutte à goutte puis en
continue/vortex
- Répéter la fixation jusqu’à obtenir un surnageant
clair
 3.1. Caryotype

7- Etalement
- Condition = 45° humidité, 22°C température
- Étaler le culot sur la lame, puis égoutter
- Ranger les lames pour le murissement
 3.1. Caryotype
8-Murissement
- Sur une plaque chauffante à 55°C pendant
tout une nuit et colorer
 3.1. Caryotype

9.Coloration
4 bains:
- A = trypsine 1mn
- B= rinçage
- C= Giemsa
- D= rinçage
- Séchage
 3.1. Caryotype
10. Observation
- A l’aide d’un photo-microscope
- Sélectionner à faible grossissement les mitoses à
long chromosomes sans superposition
- Capturer les bonnes mitoses à l’ écran
- Couper et classer
3.1.2. Classement des chromosomes(caryotype)

Plusieurs critères:
• la taille: du plus grand au plus petit
• l'index centromérique: 3 familles
• les bandes chromosomiques
3.1.2. Classement des chromosomes (suite)

• les bandes chromosomiques:

- Nombre de bandes variable: condensation
- Standard: 300 à 550 bandes
- Haute résolution: début de condensation,
800 à 1000 bandes par lot haploïde
3.1.3. Interprétation du caryotype

Déchiffrage de la formule chromosomique :

• Nombre de chromosomes par cellule

• Liste des chromosomes sexuels présents
• Liste des anomalies trouvées
• Nomenclature internationale (ISCN : International
System for human Cytogenetic Nomenclature)
• Exemple:
- Caryotype masculin normal : 46,XY
- Caryotype féminin normal : 46,XX
 3.1. Caryotype

3.1.4. Indication du caryotype

- Examen peut être réaliser soit sur:
Villosité choriale dès la 11e-12e Semaine
d’aménorrhée (SA)
Amniocytes à partir de la 14e-15e SA
Sang fœtal à la 20e SA
• Période néonatale :
- Antécédents d’anomalies chromosomiques.
- Anomalie chromosomique de structure équilibrée
chez un parent.
- Age maternel avancé.
- Signes d’appel échographiques.
• Le nouveau-né et l’enfant :
- Ambiguïté sexuelle.
- Polymalformations.
- Retard mental.
- Dysmorphie (surtout avec retard mental).
- Retard de croissance chez une fille.
- Impubérisme.
- maladies cassantes.
- Leucémies.
• Adulte :
- Aménorrhée
- Anomalies du spermogramme
- Hypogonadisme d’origine basse
- Maladie abortive
- Leucémies
- Bilan d’une procréation médicalement
assistée (PMA)
 3.2. Cytogénétique moléculaire

• Principe:
- Utilisation de l'appariement base-base pour une
identification précise.
• Technique:
Hybridation in situ en fluorescence (HISF)
 3.2. Cytogénétique moléculaire
(HISF)
• Principes de l’HISF :
- Utilisation d'une sonde moléculaire (marquée)
- Mise en contact avec le matériel génétique
- Hybridation spécifique
- Observation au microscope à fluorescence
• Différents types de sondes
- Sondes centromériques
- Sondes de peinture chromosomique
- Sondes locus spécifique
• Indications de la HISF

- Dénombrement de chromosomes
- Identification de l'origine d'un fragment
- Mise en évidence de microdélétions
 4. Anomalies chromosomiques

• Une anomalie chromosomique peut être :

- soit homogène : toutes les cellules
* gamétogenèse
- soit en mosaïque : une partie des cellules.
* lors des 1ères divisions de l’œuf.
• Anomalies du caryotype: 2 ordres:
- Nombre
- Structure
4.1. Anomalies de nombre
4.1.1. Polyploïdie :
- nombre multiple entier > 2n
- Causes : accident de la fécondation.
- Anomalies souvent létales (in utéro).
- Exemples :
* triploïdie : 69, XXX ou XXY ou XYY, (dispermie
ou digynie)
* tétraploïdie : 4n chromosomes (92).
4.1.2. Aneuploïdies
- Nombre anormal, différent d’1 multiple n.
* Trisomies : un chromosome en 3 exemplaires
Autosomiques : T21, T13, T18.
Gonosomiques : Syndrome de Klinefelter: 47, XXY.
• Trisomie 21(syndrome de Down)
- Risque augmente avec âge
- Nouveau né: hypotonie+dysmorphie
- Encéphalopathie; dysmorphie, cardiopathies
- QI 50 à l'âge de 5 ans et décroît
- Difficultés d'acquisition du langage
• Syndrome de Klinefelter: 47,XXY
Clinique :Signes principaux :
* Atrophie testiculaire
* Gynécomastie
* Stérilité
* Pas de dysmorphie importante
* Monosomies : absence d’un chromosome donné,
nombre total = 45.
· Autosomiques : létales, fausses couches
· Gonosomiques : Syndrome de Turner : 45, X

Cause: non disjonction chromosomique

• Syndrome de Turner: 45,X

Clinique
-Signes principaux
Petite taille (1 m 50)
Impubérisme
Agénésie ovarienne
-Malformations somatiques évocatrices
4.2. Anomalies de structures
• Cassures suivies ou non d’un recollement aberrant.
• Équilibrées : matériel génétique normale
• Non équilibrées : perte ou gain de matériel
génétique
• Peut porter sur un ou 2 chromosomes
4.2.1. Portant sur un chromosome
• Délétions
• Anneaux
• Inversions
• Isochromosomes
• Autres anomalies
• Les délétions :
- Perte d’un segment de chromosome
- Peut être terminale ou interstitielle
- exemple :
Dystrophie musculaire de Duchenne (Xp21)
Mucoviscidose (gène CFTR en 7q31) 24% due à des
délétions
• Hémophilie A : gène F8 en Xq28 (soit liée à
une inversion, soit à une délétions-
insertions).
• Les anneaux :
- Cassure aux 2 extrémités d’un ch.,
- réunion circulaire du segment intermédiaire,
- perte des segments distaux.
- Exp. : Anneau de X dans le Sd de turner (X).
• Les inversions :
- 2 cassures sur un chromosomes
- Recollement, avec une rotation de 180°
- Péricentriques :
exemple: inv9p11q13.
- Paracentriques : sur un même bras
• Les isochromosomes
- 2 bras courts ou de 2 bras longs.
Le plus fréquent : isochromosomie du bras long du
X dans le syndrome de Turner: 46X, i (Xq)
• Autres
- Mutation par changement d’une base
- Insertions : 2 cassures sur un bras, suivies de
l’insertion du segment intermédiaire sur
l’autre bras.
4.2.2. Anomalies portant sur 2 chromosomes
• Les translocations Robertsoniennes
• Les translocations réciproques
• Les translocations Robertsoniennes :
- Fusion de 2 chromosomes acrocentriques
Un caryotype à 45 chromosomes
- Équilibrées : sans retentissement phénotypique.
- exemple: t (13,14) et t (14,21).
• Les translocations réciproques :
- Concernent tous les chromosomes.
- Cassure, échange de segments
- Equilibrées: (90%)
- Déséquilibrées
- Chromosome Philadelphie = t (22,9).
Lymphome Burkit : t (8,14) ou t (8,22) ou t (8,2)
 Références
• Lynn B Jorde: Génétique médicale. Elsevier,
2004, 412p
• Marc Jean Pierre: Génétique médicale:
formelle, moléculaire, clinique. Masson, 2004,
421p
• Pasternark J J: génétique moléculaire
humaine: une introduction aux mécanismes
des maladies héréditaires. De Boeck, 522p
• Huret JL, Leonard C, Savage JRK .
Chromosomes, anomalies chromosomiques.
Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May
2000
• http://cvirtuel.cochin.univ-
paris5.fr/cytogen/indxcyto.htm: consulté le
24/03/2011