Inmunohistochimie

Analyse histopathologique
Biopsie ou chirurgie → Macroscopie → Fixation → Circulation → Enrobage → Coupe →
Coloration H&E+Marquage de Biomarqueurs(IHC)

Localisation Localisation
Cellule unique Quantification Co-localisation
tissulaire subcellulaire

Immunohistochimie (IHC)
Principe : Identifier / localiser la présence et la distribution d’un antigène (Ag) cible dans un tissu donné au moyen d’un
anticorps (Ac) spécifique couplé à un signal visible(marqueur). IHC à haut débit par la construction de micromatrices
tissulaires
IHC = Réaction Ag-Ac + marqueur.
IHC + H&E sur la même lame pour le biomarqueur et le diagnostic simultanément
Définitions
Antigène : Macromolécule qui est une substance qui entraîne une réaction immunitaire (antigénicité) lorsqu’elle est
introduite dans un organisme vivant
Épitope: ou déterminant antigénique, la partie de l'antigène reconnue par un anticorps
Anticorps : Immunoglobulines (protéines) produites par les lymphocytes B en réponse à une stimulation antigénique,
principalement de classe IgG. Primaire (reconnaître un antigène spécifique (fragment variable de l’Ac)) et
Secondaire (reconnaître un anticorps primaire selon l’espèce (anti-mouse, rabbit, etc.) et qui est couplé à un marqueur
(fragment constant de l’Ac).)

Marqueurs : La mise en évidence d’un antigène par un anticorps sur une coupe histologique nécessite l’utilisation d’un
marqueur fixé à l’anticorps. • Enzymes (immunohistochimie; IHC) • Fluorochromes (immunofluorescence; IF) • Radio-
isotopes

10 étapes importantes
Étape 0: Préparation du projet
Choisir: cible (antigène), espèce (réactive), application et marqueaur.

Étape 1: Préservation du tissu

Congelation: visualiser des épitopes détruits par des procédés de fixation et d'inclusion
Paraffine

Étape 2: Coupe au microtome

emploi de lames chargées positivement, 4µm d’épaisseur, sécher 16 heures à température ambiante verticale.

Étape 3-10: Coloration

Déparaffinage: (xylène, toluène ou substituts)
démasquage de l'antigène: fixateur pouvant masquer les épitopes antigéniques
Blocage:Avant l’application de l’anticorps primaire Ø Réduire les interactions non-spécifique
Incubation avec l'anticorps primaire: choix selon compagnie, publications avec le meme produit, Conc. finale 2-20ug'ml, diluant
(PBS,TBS), incubation 1-24h et Tº 37-TPièce-4º, témoins positif (IHC du ap) témoins neg (spécifité du ap) (coloration non liée)
Incubation avec l'anticorps secondaire,- Detection directe (sans ac sec) Ideal Ag fort exp- - Detection indirecte (anti-Ig G)
Anticorps secondaire (anti-IgG dirigé contre l’espèce dans laquelle est produit l’anticorps primaire) conjugué à un marqueur
Sensibilité accrue / Signal amplifié (Ac 1re lié par plusieurs Ac 2e)
détection IHC/IF , chromogène en IHC mais couleurs limitée, IF signal pas permanent.
contre-coloration, l’hématoxyline +/- agent bleuissant pour un bon contraste avec le brun.
montage, Hématoxyline → Éosine → Éthanol 100% → Xylène/Toluène/Substitut → Colle

Démasquage de l’antigène
PIER (Proteolytic-Induced Epitope Retrieval): enzymes protéolytiques (trypsine, protéase, pepsine) +dificile
HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) chaleur (Citrate de sodium pH6 vs TRIS-EDTA pH8) +utilisé

Blocage
Interactions hydrophobes non-spécifiques - serum, Tween20
Biotine endogène (foie, rein, cœur, cerveau, poumon)- préincubation Avidine
Enzymes endogènes: Peroxidase - H2O2 rein,foie, G.Rouges ou Phosphatase alcaline- Ac. Acétique 1% (intestin, rein)

Ac Primaire - Temoins = Assurance qualité

Interne (la même lame) - externe (autre lame même temps)
Positif (reaction IHC-AcP) exprime l'antigène recherche. NVs: pas visibilité
Négatif (spécificité AcP) élément tissulaire sans s'exprime NVs: element exprese
Négatif réactifs (coloration parasite) prouve rc Ag-Ac, pas reaction du reactif
 L’étape 8: La détection / révélation

Enzyme (Chromogénique)
En présence de son substrat soluble, l’enzyme génère un
produit coloré insoluble sur le site d’expression de
l’antigène (approche chromogène)
Peroxydase (HRP) DAB Brun - AEC Rouge
Phosphatase (AP) Fast red/blue/Naphtol-AS-MX-
Phosphate, BCIP/NBT Indigo

IF- Fluorescent (fluorescent)

Fluorophore (ou fluorochrome) ABSORBE
l’énergie de la lumière à une longueur d’onde
donnée
pour ÉMETTRE un signal fluorescent à une
longueur d’onde plus élevée
IHC à haut débit – Micromatrices tissulaires
La construction de micromatrices tissulaires (tissue microarrays = TMAs) permet de marquer (IHC ou IF) plusieurs
échantillons sur une seule lame.
Il y a 2 avantages considérables :
• C’est une technique qui permet de faire des économies.
• De plus, tous les échantillons sont traités exactement de la même façon pour le marquage.

Objectifs
• Décrire les étapes d’approbation d’un marquage
temois et comparation dans la lame en localisation et intensite
1ere étape: évaluation du témoin lui-même:
Localisation attendue: Protein Atlas, (vérifier clone et dilution) noyaux ou m. basal
Intensité attendue
Permet de s’assurer que la réaction a bien fonctionné
2e étape: comparaison entre l’intensité du témoin, les localisations, et le marquage sur la lame
Permet de s’assurer que la réaction est celle attendue

• Décrire le processus permettant de définir des seuils de positivité sur des carottes de TMAs
1. seuil acceptable ou besoin de validation avec multiples variables
2. hipotese
3. equidistance
4. literature/spectre de lame
5. analyse virtuelle
• Nommer trois composantes des couleurs en informatique
Saturation(vive 100%-fade0),
Intensite(0noir,255blancRGB),
Teinte (rouge0, vert(0.33), bleu(0.66),brun(0.1))
• Comparer les avantages et inconvénients des différentes techniques d’analyse
-analyse virtuel - tiempo, algorith, connai
-visuel - semiquantitative – clinique
Type I: interprété en fonction de la morphologie
Souvent pour établir un diagnostic
Souvent en panels
Résultat peut être « ignoré » par le pathologiste si jugédiscordant
Type II: interprété sans égard à la morphologie
Souvent prédictif ou plus rarement pronostique
Seul
Rarement la capacité de déterminer si discordant ou non
• Intégrer ces informations dans des démarches de recherche
J’utiliserais la technique de l’IHC dans un groupe hétérogène d’échantillons, accompagné d’abord d’une analyse visuelle
avec un microscope optique et ensuite d’un microscope virtuel, scannant les lames et si possible accompagné
d’algorithmes de reconnaissance.