REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

SECTEUR SANITAIRE DE KOUBA

HOPITAL BACHIR MENTOURI

LABORATOIRE CENTRAL

Chef de service : Pr M DAHMMANE

RAPORT DE FIN DE STAGE

De

Rdige par : Mlle NADJEM KHALIDA

Sous la direction de : Dr R. OUSSEDIK

Anne
2002 / 2003
 Les travaux dcrits tout au long de ce rapport de fin de stage ont t
ralis au laboratoire central de l'hpital de Kouba " BACHIR
MENTOURI ", dirig par Madame le professeur M. DAHMANE .

Je tiens remercier , tout d'abord Mlle Oussedik, de m'avoir encadr

de si prs et dirig tout au long de mon sjours au sein de son unit de
Srologie .

Je n'oublierais pas de remercier M elles Abdenbi Meriama et Saidani

Linda de m'avoir apprise, avec sympathie, les diffrentes techniques des
paillasses .
I- Dosage de la CRP.

II- Dosage des ASLO .

III- Recherche du facteur rhumatode par test au latex sur carte .

IV- Test d'hemagglutination de la syphilis TPHA .

V- Test de grossesse .

VI- Dtection des anticorps antiVIH1 et VIH2 par technique immunienzymatique .

VII- Dpistage des anticorps anti HCV par technique immunoenzymatique .

VIII- Dtection des antignes de surface du virus de l'hpatite B par technique

immunoenzymatique .
 I- Dosage de la C.R.P : ( Protine C ractive ) :

1/ Dfinition et intrt diagnostique :

La protine C ractive ( CRP : PM : 120 000 DA ) est synthtisme dans le foie, une demi vie
de 20 30 heures .
La CRP fait partie des protine dites de la phase aigu, dont la concentration srique
augmente au cours de la rponse gnrale non spcifique des processus inflammatoire
infectieuse ou non infectieuse des ncroses cellulaire et des noplasies malignes .
La CRP participe en particulier, par lactivation du complment et lacclration de la
phagocytose la protection non spcifique.
La Concentration srique de CRP chez les sujets sains est :
< 5 mg /l [ C ] = 20 900 mg /l en 4 8 heures dans les maladies aigus .
Le Dosage de la CRP est indiqu dans les cas suivants :

Teste de dpistage des processus inflammatoires et ncrotiques .

Diagnostic et contrle de lvolution des infections et des processus inflammatoire

Comme par exemple :

- Septicmie nonatale, mningite .
- Pneumonie .
- Pylonphrite
- Complication postopratoires .
- Maladies malignes en particulier en association avec dautres protines de la phase
aigu et des marqueurs tumoraux .

Apprciation du tableau clinique dans les maladie inflammations .

- En cas de Rhumatisme palendronique
- En cas dinfection pousser aigu ou intermittente .

Diagnostic diffrentiel des maladies inflammatoires .

- Lupus rythmateux systmatique .
- Arthrite rhumatode ou autre .
- Cystite aigu / pylonphrite .

2/ Principe de la mthode :

Cest une technique qui permet la dtermination qualitative et semi quantitative de la

protine C ractive dans le srum par agglutination directe au latex sur lame .
Les particules de latex sont recouvertes danti CRP humaine mono spcifique et sensibilises
de faon dtecter un seuil de 0,3 mg de CRP/l ( soit 6 mg de CRP / de srum pur ) .

3/ Mode opratoire :

Ractifs particulier de latex recouverts danti CRP .

- Tampon glycine PH = 8,2 .
- Srum humain de contrle positif .
- Srum humain de contrle ngatif .
- Srum de malade obtenu aprs centrifugation du sang total recueilli sur tube sec , porter tous
les ractifs et les prlvements la temprature ambiante .

a) Test qualitatif :

Diluer le srum au 1/20 avec le tampon glycine .

exp : srum 50 l . tampon 1 ml .
- Utiliser chaque test sur lame , le contrle positif et le contrle ngatif , ils sont pr dilus .
* Test sur lame :
- Placer 50l sur une lame de srum dilu .
- Ajoute une goutte de ractif latex aprs lavoir bien agit .
- Mlanger les 2 gouttes avec un agitateur propre et tendre le mlange jusqu la limite de
cercle .
- Balancer doucement la lame davant en arrire et observer lagglutination lil nu .
- Lire au bout de 2 mn sous un clairage en lumire directe .

b) Test semi quantitatif :

- A partir de la dilution au 1/20 prparer une srie de dilution dans le tampon glycine raison
de 1/40 - 1/64 .
- Tester chaque dilution en qualitatif .
- A partir de la plus grande dilution donnant un test positif calculer la concentration
limite , en sachant que le seuil de dtection au niveau de la lame est de 0,3 mg
de CRP /L : 0,30 x dilutions de srum = concentration de la CRP en mg/l .

4/ Lecture :

Raction positive :

Lagglutination est ( possible ) visible sous forme dagglomrats de taille plus ou moins
grosse apparaissant dans les 2 minutes .
Pour le test semi quantitatifs , le calcul doit tre fait partir de la plus grande dilution qui
donne une agglutination mette en moins de 2 mn .

Raction ngative :

Aucun agglutination nest visible, le ractif reste homogne comme pour le tmoin ngatif .
- On dit que la raction est positive si CRP >6mg/l .
- On dit que la raction est ngative si CRP <6mg/l .
- On dit quil y a une inflammation quand le taux de CRP est suprieur 6mg/l .
 II- Dosage des ASLO :

1/ Dfinition :

ASLO : anticorps antistreptolysine 0

Ces anticorps sont synthtises contre la streptomycine 0 qui est un enzyme scrte par les
streptocoques hmolytiques du groupe A lors de leur introduction dans lorganisme
Le danger du streptocoque est double.
Le 1er est du son effet bactriologique
Le 2me la synthse excessive des ASLO qui sont lorigine des syndrome du
rhumatisme articulaire aigu ( RAA ).
Donc lindication biologique du dosage des ASLO est le diagnostic du RAA .

2/ Principe de la mthode :

Le test consiste en une raction immuno-chimique entre lantistreptolysine o du srum

et la streptolysine O fixe sur des particules de latex en cas de concentration
dantistreptolysine o augmente , il se produit une agglutination visible des particules de
latex .

3/ Mode opratoire :

a) Test qualitatif avec une sensibilit de 200 UI/ml :

- Porter les chantillons sriques et les ractifs la temprature ambiante .

- Dposer sur les champs dune plaque test une goutte de srum de contrle positif une goutte
de srum de contrle ngatif puis 80 l de chacun des srums de patient non dilu .
- Ajouter cot de chaque goutte dj dpose 1 goutte de Rapitex ASL bien mlanger
laide dun agitateur puis imprimer la plaque un mouvement de rotation .
- Lire lagglutination aprs 2 mn .
- Une agglutination nette indique un taux danti streptolysine 0 > 200UI/ml -+ 20% .

b) Test qualitatif avec une sensibilit de 100 UI/ml :

- Porter les chantillon srique et les ractifs la temprature ambiante .

- Dposer sur les champs dune plaque test une goutte de srum de contrle positif , une
goutte du srum de contrle ngatif puis 80 l de chacun des srums de patient non dilu
- Ajouter cot de chaque goutte dj dpose une goutte de Raplex ASLO, bien mlanger
laide dun btonnet , puis imprimer la plaque un mouvement de rotation .
- Lire lagglutination aprs 4 minutes .
- Une agglutination mette indique un taux danti-streptolysine 0 > 100 UI /ml -+20 % .

c) Test quantitatif :

Cest lvaluation de la concentration dantistreptolysine O pour cela , diluer lchantillon du

patient en solution satire wotonique.
Tester ensuite les dilutions avec le ractif comme il a t dcrits prcdemment .
4/ Rsultats :

a) Test qualitatif avec une sensibilit de 200 UI/ml : une agglutination mette rvle les
chantillons dont la concentration dASLO est > 200 UI / ml +- 20% .
- Les chantillon dont la [ c ] dASLO est < 200UI /ml 1er pressentent par dagglutination

b) Test qualitatif avec une sensibilit de 100 UI/ml :

- Les chantillon dont le rsultat est ngatif avec la mthode (a ) et la raction positive avec la
mthode (b) ont une concentration dASLO comprise entre 100 et 200 UI / ml une
agglutination mette rvle les chantillon dont :
Le [ c ] dASLO est > 100 UI /ml -+ 20% .
Les chantillon dont la [ c] est < 100 UI / ml ne pressentent aucune agglutination test
qualitatif avec une sensibilit de 100 UI /ml .

c) Exploration semis quantitative :

Retenir la dilution pour laquelle une agglutination nette est encore visible lire la concentration
danti streptolysine O de lchantillon selon le tableau suivant :

Agglutination la dilution Concentration dASLO -+ 20%

1/2 400 UI / ml
1/4 800 UI / ml
1/8 1600 UI / ml
1/16 3200 UI / ml

5/ Valeurs de rfrence :

- A titre indicatif, la limite suprieure du domaine normal est internationalement situe

200UI/ml .
-Valeur normale des enfants non scolariss = 100 UI / ml, la concentration dASLO augmente
avec lge de lenfant atteint . Un pic pendant la priode de scolarisation puis chute de
nouveau .
 III/ Recherche du facteur rhumatode par un test
au latex sur carte.

1/ Dfinition du facteur rhumatode (FR):

Le facteur Rhumatode est un auto anticorps dirig contre le fragment Fc des IgG retrouv
chez les malades atteints de polyarthrite rhumatode , ainsi que d'autres maladies auto
immunes.
Cet auto anticorps peut appartenir la classe des IgG ou IgA, diffrants isotypes sont
appels FR IgM, IgG ou IgA. Cependant,, dans la majorit des cas on a affaire une
IgM dirige contre une IgG.

Celle ci peut tre essentiellement mise en vidence par deux techniques : le test au
Latex et la raction de WAALER ROSE.

2/ Principe :
La recherche du facteur rhumatode se fait par raction dagglutination sur carte, de particules
de latex sensibilises par des globulines humaines, en prsence de facteurs rhumatodes.

3/ Ractifs: (une Conservation des ractifs entre 2-8C jusqu la date dexpiration indique
sur le coffret) .

Composition du coffret (pour 100 dterminations):

Ractif 1 Ractif latex RF Suspension aqueuse de particules de latex

2 x 2,5 ml (azide de sodium :1g/l) sensibilises par des globulines
humaines
Falcon compte-gouttes (bouchon blanc)
(1 goutte=50l ). Bien agiter avant
utilisation.

Ractif 2 Srum positif(lapin) Falcon compte-gouttes(bouchon rouge)

1 x 2 ml (azide de sodium :1g/l) (1goutte=50l).

Ractif 3 Srum ngatif(cheval) Falcon compte-gouttes(bouchon bleu)

1 x 2 ml (azide de sodium :1g/l) (1goutte=50l).

Ractif 4 Tampon glycocolle-NaCl prt lemploi.

1 x 95 ml PH 8,2 (azide de sodium :1g/l)

4/ Prcautions dutilisation:

Ce coffret contient des composants dorigine humaine. Aucune des mthodes

danalyse actuellement connues ne peut garantir de faon absolue que ces produits ne
contiennent aucun agent pathogne transmissible. Il est recommand de les manipuler avec les
prcautions dusage relatives aux produits potentiellement infectieux.
5/ Echantillons :
Srums frais ou conservs 20C, prsentant une coagulation complte.
Rejeter tout srum lipmique ou contamin.

6/ Mode opratoire:

1. Ramener les ractifs et les srums tester temprature ambiante(18-25C)

2. Diluer les srums tester au 1/20 dans le tampon R4(50l de srum+0,95 ml de tampon
3. Dposer successivement sur la carte :
- 20l ou1 goutte de srum positif(R2).
- 20l ou1 goutte de srum ngatif (R3).
- 20l ou1 goutte (50l) de la dilution des srums tester.
4. A cot de chaque dpt, ajouter 1 goutte de ractif latex RF bien homognis.
5. Mlanger laide dun agitateur.
6. Imprimer la carte un lent mouvement de rotation .Noter lapparition dune agglutination
en 2 minutes.

7/ Lecture:
Raction positive (agglutination) : prsence de facteurs rhumatodes dont la concentration
peut tre estime grce la technique semi-quantitative.

Raction ngative (suspension homogne) : absence de facteurs rhumatodes ou prsence

un taux infrieur la limite de dtection (environ 25UI/ML).

Technique semi-quantitative :

En cas de raction positive poursuivre partir de la dilution au 1/20 une srie de dilutions
raison 2 en tampon R4.
Tester chaque dilution selon le protocole dcrit prcdemment.
Le titre du srum en facteurs rhumatodes, exprim en UI/ML est obtenu en multipliant par
linverse de la dernire dilution donnant une raction faiblement positive, par le seuil de
sensibilit indiqu sur ltiquette du coffret.
Exemple :
Sensibilit du coffret : 1,25 UI/ML.
Dernire dilution donnant une raction positive : 1/20
Titre du srum en UI/ML : 1,25 x 20 = 25 UI/ML.

8/ Interprtation :
Dans le cas de polyarthrite rhumatode suspecte cliniquement, les facteurs rhumatodes sont
dtects dans 80% des srums de patients.
Les formes sropositives sont gnralement plus graves que les formes srongatives.
En cas de positivit du test au latex, il est conseill de confirmer le rsultat par une raction de
type WAALER ROSE.
En dehors de la polyarthrite rhumatode, des facteurs rhumatodes peuvent tre retrouvs :
- Chez 4% des sujets sains (ce pourcentage augmentant avec lage).
- Chez certains sujets atteints de lupus rythmateux dissmin, dhpatite, de cirrhose du
foie, de syphilis...
Dans ces cas , le taux de facteurs rhumatodes est en gnral plus faible que dans une
polyarthrite rhumatode.
 IV/ TEST DHEMAGGLUTINATION DE LA SYPHILIS T.P.H.A :

1/ Principe :

Cest une technique qui permet le dpistage et le dosage des anticorps anti Trponma
pallidum.
Lantigne utilis est constitu par un lyophilisat de Trponma pallidum, fix sur des
hmaties de mouton formoles et tannes. Lorsque cet antigne est mis en prsence dun
srum contenant lanticorps trponmique homologue, il y a formation dun immun complexe
qui entrane lagglutination des hmaties.

2/ Ractifs et matriel :

- Absorbant.
- Hmaties de mouton formoles, tannes et sensibilises.
- Hmaties de mouton non sensibilises.
- Srum de contrle positif et ngatif.
- Rhydratant.
- Compte-gouttes.
- Plaques comportant des alvoles.

3/ Prparation des ractifs :

- Adsorbant : prt lemploi.

- Hmaties sensibilises : flacon rhydrat avec 0,8 ml de rhydratant.
Dilution de travail : - 1partie ( 1ml ) dhmaties rhydrates.
- 3,5 partie (5,5ml) dadsorbant.
- Hmaties non sensibilises : flacon rhydrat avec 0,5 ml de rhydratant.
Dilution de travail : - 1ml dhmaties rhydrates.
- 5,5ml dadsorbant.
- Srum de contrle positif et ngatif : rhydrats avec 0,5 ml de rhydratant chacun.

Remarque : il faut attendre 1 heure avant dutiliser un ractif qui vient dtre reconstitu.

4/ Prparation des srums :

- Doivent tre exempt de toutes particules en suspension, frais ou inactiv.

- Faire une dilution au 1/20 de chaque srum : - 0,95 ml dadsorbant.
- 0,05 ml de srum.
- Mlanger et laisser incuber temprature ambiante pendant 30 mn exactement.
- Faire 2 tmoins positif et ngatif en procdant de la mme faon.

5/ Excution de la raction :

On fait pour chaque srum 2 alvoles.

- Mettre 0,025 ml de srum adsorb ( 1/20) dans les 2 alvoles.
- Ajouter : - dans la rang du haut 0,075 ml des dilutions de travail des hmaties
sensibilises.
- dans la rang du bas 0,075 ml des dilutions de travail des hmaties non
sensibilises.
Dans chaque alvole on obtient une dilution du srum au 1/80.
Agiter et laisser la plaque recouverte temprature ambiante.
Procder de la mme manire pour les tmoins positif et ngatif.

6/ Lecture :

On fait deux lectures :

- La 1re lecture au bout de 4 heures.
- La 2me lecture le lendemain.
Raction ngative :
Sdimentation des hmaties en un point dans les 2
- Hmaties sensibilises.
alvoles.
- Hmaties non sensibilises

Raction positive :

- Hmaties non sensibilises : Sdimentation des hmaties en un point.

- Hmaties sensibilises : le font de lalvole est uniformment recouvert
agglutination.

7/ Intrt diagnostique :

Les raction positives permettent de dterminer sil sagit dune syphilis aigu ou ancienne en
cas de suspicion dune infection rcente, le diagnostic srologique dfinitif se fera partir de
la mise en vidence dune augmentation du titre .
Pour cela faire un 2me prlvement 10 14 jours plus tard et tester les 2 chantillons en
parallles une augmentation du titre dau moins 2 dilutions indique une syphilis en volution.
 V/ Test de Grossesse :

1/ Principe :

Le test est bas sur une raction dinhibition de lhemagglutination des rythrocytes ont t
en robes dHCG . Lorsque des anticorps de LHCG dont ajouts ce ractif , une raction
dagglutination se produit et un mode de sdimentation diffus se forme au fond du tube .
Laddition simultane dHCG libre qui est pressente dans Lurine dune femme enceinte
bloque les anticorps et empche la raction avec les rythrocytes les rythrocytes se dposent
alors au fond du tube sous forme dun anneau caractristique ( raction positive ) si LHCG
cest pas ou en faible quantit pressente dans lurine ,on observe un mode de sdimentation
diffus ( raction ngative ) .
Les rythrocytes utiliss proviennent du mouton et ont t stabilis .
Les anticorps sont dorigine monoclonale .

2/ Echantillon :

- Urine frache garde temprature ambiante ( nexcdant pas 25c ) doit tre utilise le jour
mme .
- Les urine conserves 1 ou 2 jours doivent tre gardes entre 2 et 8C, il peut alors
yavoir une perte de HGG .
- Les chantillon congels doivent tre compltement dcongels avant dtre test .
ne pas conserver des chantillons ayant t dcongels .
- On ne doit pas utiliser une urine contenant du sang ou des composants du sang ou de lurine
fortement contamine pas des micro organismes .

3/ Protocole :

- Filtrer au minimum 5 8 ml durine ( de prfrence un chantillon du lever ) travers un

papier filtre nos, on centrifuge pendant 5 10 mn , utiliser le filtrat ou le surnageant clair .
- Ouvrir le tube et le placer dans 1 support de tubes 5 miroir approprie .
- Pipeter 400 l deau distille dans le tube .
- Ajoute 100 l durine .
- Agiter doucement le support du tube pendant environ 30 afin dobtenir un mlange
parfait et le placer dans un endroit situ labri des vibrations et de la chaleur .

4/ Rsultat :

Le miroir inclin la base du support de tube permet de lire le rsultat sans modifier les
modes de sdimentation .
Un anneau brun clairement dfini indique un rsultat ngatif .
Si le diamtre de lanneau est plus grand ou si lanneaux est plus vague et moins clairement
dfini le rsultat doit tre considr comme quivoque et le test doit tre refait quelques jours
plus tard .
VI- Dtection des anticorps anti-VIH1 et anti-VIH2 dans le srum et plasma par
technique immuno-enzymatique:

Le SIDA est une maladie infectieuse d'origine virale se traduisant par un dficit
profond de l'immunit cellulaire.
Deux types de virus apparents au groupe des lentivirus ont t isols des lymphocytes
e patients atteint e SIDA ou de ses prodromes. Le 1er nomm VIH1 a t isol en
France, puis aux tats unis. Le second nomm VIH2 a t isol chez deux malades
d'origine africaine et s'est rvl tre responsable d'un nouveau foyer de SIDA en
Afrique de l'Ouest.
La prsence e la maladie repose sur le contrle obligatoire des dons de sang par la
dtection d'anticorps antiVIH1 et antiVIH2 ( principaux facteur de l'infection ) afin
d'liminer les poches des sujets contamines. Toute fois , certaines enqutes
pidmiologiques ou srologiques ont montr que certains sujets contamins par le
virus VIH2, atteint e SIDA ou porteurs asymptotiques n'taient pas reconnus positifs
par les trousses de diagnostique VIH1.

Le test ELISA permet la dtection simultane des anticorps anti VIH1 et VIH2.

1/ principe:

C'est une technique enzymatique base sur le principe du sandwich en deux tapes
pour la dtection des diffrants anticorps associs aux virus VIH1 et ou 2, dans le
srum ou plasma humain.

La mise en uvre du test comprend les tapes suivantes:

1- Les srums sont distribus dans les cupules. Si les anticorps antiVIH1 et ou VIH2
sont prsents, ils se lient aux antignes fixs sur la phase solide.
Le dpt d'chantillon est valid par un changement de couleur, du violet au bleu .
2- Les antignes VIH1 et VIH2 purifis, marqus la peroxydase, sont ajouts aprs
lavage. Ils se lient leur tour aux IgG et ou IgM et ou IgA, retenus par la phase
solide.
3- La prsence e l'enzyme immobilise sur les complexes est rvle par incubation
en prsence du substrat aprs limination de la fraction de conjugu reste libre.
4- Aprs arrt de la raction, la lecture s'effectue au spectrophotomtre 4450-620nm.
L'absorbance observe pour un chantillon permet de conclure quant la prsence ou
l'absence d'anticorps antiVIH1 et ou 2.

2/ Mode opratoire:

1- Sortir le cadre support et les barrettes de l'emballage protecteur.

2- Dposer directement, sans prlavage de la plaque, successivement:
25 l de diluant dans chaque cupule.
 75 l de srum de contrle ngatif.
75 l de srum de contrle seuil.
75 l de srum de contrle positif.
75 l du 1er chantillon.
75 l de 2eme chantillon, etc
Homogniser le mlange par 3 aspirations minimum avec la pipette de 75l ou en
agitant la microplaque aprs l'tape de pipetage.
3- Couvrir d'un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer
l'tanchit.
4- Incuber la microplaque au bain-marie thermostat ou sec pendant 30+/- 5min
37c.
5- Retirer le film, aspirer le contenu de toutes les cupules et ajouter immdiatement
dans chacune d'elles 0.370 ml de solution de lavage, attendre 30sec . aspirer de
nouveau. Rpter le lavage au moins 2 fois.
6- Distribuer 100 l de la solution de conjugu dans toutes les cupules.
7- Incuber 30min temprature ambiante.
8- Vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois .
9- Distribuer rapidement dans toutes les cupules 80l de la solution de rvlation de
l'activit enzymatique pralablement prpare. Laisser la raction se dvelopper
l'obscurit pendant 30min temprature ambiante.
10-Ajouter 100 l de la solution d'arrt .
11-Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire la densit optique 450-
620nm l'aide d'un lecteur de plaques, dans les 30 min suivantes.

3/ Interprtation des rsultats:

La prsance ou l'absence des anticorps anti VIH1 et ou 2 est dtermine en comparant

pour chaque chantillon l'absorbance enregistre celle de la valeur seuil calcule.

1- Calculer de la valeur seuil: la valeur seuil sera dtermine par le rapport:

VS= DO seuil
10
2- Validation de l'essai:
Le srum de contrle ngatif doit tre infrieur 70% de la valeur seuil c'est dire <
0.7 VS.
3- Interprtation des rsultats:
Les chantillons dont l'absorbance est infrieur 70% de la valeur seuil sont
considrs ngatif d'aprs ce test.

Toutefois, les rsultats situs juste au dessous de la valeur seuil doivent tre interprts
avec prudence , et les test en double.
Les chantillons dont l'absorbance est gale ou suprieures la valeur seuil sont
considrs initialement positifs , ils doivent tre contrls de nouveau en double avant
l'interprtation finale.
 VII- Dpistage des anticorps anti HCV par technique immunoenzymatique:

1/ Principe du test:

Monolisa antiHVC plus est une technique immunoenzymatique de type indirect

permettant le dpistage des anticorps associs une infection par le virus de l'hpatite
C dans le srum ou le plasma humain.

Ce test repose sur l'utilisation d'une phase solide prpare avec des antignes purifis:
trois protines recombinantes produites par E coli partir de clones slectionns dans
la rgion non structurale et dans la rgion structurale du gnome du virus de l'hpatite
C et d'une phase liquide constitue d'anticorps de chvre anti IgG humaines purifis
par chromatographie d'affinit et coupls la peroxydase.

La mise en uvre du test comprend les tapes ractionnelles suivantes:

1- Les chantillons tudier ainsi que les srums de contrle sont distribus dans les
cupules. Si des anticorps antiHCV sont prsents, ils se lient aux antignes fixs sur
la phase solide.
2- Les anticorps antiIgG humaines marqus la peroxydase sont ajouts aprs lavage.
Ils se fixent leur tour aux anticorps spcifiques retenus sur la phase solide.
3- Aprs limination du conjugu enzymatique non li, le complexe antigne
anticorps est rvl par addition du substrat.
4- Aprs arrt de la raction, la lecture s'effectue au spectrophotomtre 450/620nm.
L'absorbance mesure permet de conclure quant la prsence ou l'absence
d'anticorps antiHCV. L'intensit de la coloration est proportionnelle la quantit
d'anticorps antiHCV lis sur la phase solide.

2/ Mode opratoire:

1- Sortir le cadre support et les barrettes e l'emballage protecteur.

2- Dposer directement, et successivement:
80l de diluant dans chaque cupule.
20l de srum de contrle ngatif.
20 l de srum de contrle positif.
20l du premier chantillon, etc

3- Incuber 37c pondant 60min

4- Aspirer le contenu e toute les cupules dans un conteneur pour dchets contamins,
et ajout dans chacune d'elles un minimum de 0.370 ml de solution de lavage.
Aspirer de nouveau. Rpter le lavage 2 fois. Scher la plaque par retournement sur
une feuille de papier absorbant.
5- Distribuer 100 l de la solution de conjugu dans toutes les cupules. Incuber 37c
30min.
6- Vider toutes les cupules par aspiration et laver 4 fois . scher les barrettes par
retournement sur une feuille de papier absorbant.
7- Distribuer 100l de la solution de rvlation de l'activit enzymatique dans toutes
les cupules. Laisser la raction se dvelopper l'absurdit 30min temprature
ambiante.
8- Ajouter 100l de la solution d'arrt en adoptant la mme squence et le mme
rythme de distribution que pour la solution de rvlation.
9- Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire la DO 450/620nm , dans les
30 min qui suivent l'arrt de la raction .

3/ Calcul et interprtation des rsultats:

La prsence ou l'absence d'anticorps antiHCV est dtermine en comparant pour

chaque chantillon l'absorbance enregistre celle de la valeur seuil calcule.

1- Calcule e la valeur seuil VS:

VS = DO contrle positif
5

2- Les critres de validation sont les suivants:

Pour le contrle ngatif : chaque valeur individuelle de l'absorbance mesure doit
tre infrieure 0.150.
Pour le contrle positif : si la valeur du contrle positif s'carte de plus de 30% de
la moyenne, refaire la calcul .

4/ Interprtation des rsultats:

Les chantillons dont la DO est infrieure la valeur seuil sont considrs ngatifs
d'aprs le test MONOLISA.
Toutefois, les rsultats situs juste au dessous de la valeur seuil ( DO chantillon > DO
valeur seuil - 10% ) doivent tre interprts avec prudence et les chantillons
correspondants retests en double.
Les chantillons dont la DO est > ou gale au seuil sont considrs comme
initialement positifs et doivent tre retests en double avant l'interprtation finale.
 VIII- Dtection de l'antigne de surface du virus de l'hpatite B par technique
immunoenzymatique:

1/ Principe :

La prsence de l'Ag HBs dans le srum tmoigne d'une infection par le virus de
l'hpatite B. il est le 1er marqueur apparatre et peut prcder de 2 3 semaines les
signes cliniques et biologiques de la maladie. Sa prsence peut tre trs brve de
quelque jours, ou trs longue de plusieurs annes. Au del de 6 mois de persistance de
l'Ag HBs, l'hpatite est qualifie de Chronique.

Le test MONOLISA Ag HBs est une technique imminoenzymatique de type sandwich

en un temps utilisant trois anticorps monoclonaux slectionne pour leur capacit se
lier aux diffrents sous types de l'Ag HBs actuellement reconnus par l'OMS.
La phase solide est constitue de cupules en polystyrne sensibilises avec le 1 er
anticorps monoclonal. Les 2 autre anticorps sont coups la peroxydase.

Le dosage comprend les tapes suivantes:

1- Distribution des chantillons dans les cupules de la microplaque.
2- Distribution du conjugu.
NB: dans les 2 cas on peut contrle visuellement la coloration entre une cupule vide
et une cupule contenant un chantillon. Elle peut tre aussi contrle par lecture
spectrophotomtrique 450 - 620 nm.

3- Incubation.
4- Lavage puis rvlation de l'activit enzymatique lie la phase solide par addition
de substrat.
5- Arrt de la rvlation, puis lecture des DO .

2/ Calcul et interprtation des rsultats:

Calcule de la valeur seuil:

La valeur seuil est gale : DO contrle positif + 0.040 .
Condition de validation du test:
il est possible d'liminer au plus une valeur individuelle aberrante si sa DO se situe en
dehors de la norme prcdente ou lorsqu'elle est suprieure de plus de 40 % par
rapport la moyenne des contrles ngatifs. Lorsque la valeur aberrante a t limin.
Le test est recommencer si tous les contrles sont hors de l'intervalle des valeurs ci
dessus.

interprtation des rsultats: Les chantillons dont la DO est infrieure la valeur

seuil sont considrs ngatifs d'aprs le test MONOLISA.
Les chantillons dont la DO est suprieure ou gale la valeur seuil sont considrs
comme initialement positifs et doivent tre retests en doubles avant l'interprtation
finale.