Dr F.

BOUBRIT

DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

Moyens du diagnostic virologique :

❖ Diagnostic direct : mise en évidence du virus ou de ses constituants
❖ Diagnostic indirect : recherche d’Anticorpsspécifiques synthétisés par l’organisme en réponse
à une infection virale.

I. Diagnostic direct :

1) Les Prélèvements :
1. Choix des prélèvements :
• Très important, se fait en fonction de l’infection.
• Se fait à la phase aigüe de l’infection
o Donc les prélèvements doivent être faits dès l’apparition des signes cliniques
• L’excrétion du virus n’excède pas 3-6jrs à rapidité (+++)
• Les prélèvements sont faits au niveau du site de multiplication (point d’entrée) et au niveau des lésions.
2. Conditions des prélèvements :
a. Matériels : à utiliser selon le prélèvement
• Pots stériles à fermeture hermétique.
• Tubes à vis stériles de 10ml
• Ecouvillons sauf ceux à l’alginate de Ca (inactive les herpes virus)
• Seringues stériles (aspiration)
• Curette ophtalmiques (grattage)
b. Transport : rapidité (+++) dépend de la nature du prélèvement.
i. Acheminement rapide :
• Inactivation des virus à température ambiante
• Fragilité à la dessiccation
• Présence d’une flore bactérienne ou fongique.
ii. Température adéquate :
• Basse température (2-6°C)
• Eviter congélation/ décongélation
• Parfois transport à très basse température.
• Milieu de transport (éviter les dessiccations, écouvillons, biopsies d’organes)
c. Conservation :
2-6°C ​àInférieur à 5jrs
​àPlus longue durée
d. Fiche de renseignement :
i. Identification :
• Du patient : identité, âge, sexe.
• Du prescripteur.
• Du prélèvement : date et heure, nature du prélèvement.
ii. Renseignement cliniques : motivant la demande

2) Le diagnostic direct :
Différentes techniques de diagnostic direct existent :
a. Isolement du virus :
• Culture cellulaire
• Œuf embryonné
 • Œuf embryonné
• Animaux
b. Mise en évidence des Ags viraux : Diagnostic rapide
c. Microscopie électronique ::Visualisation des virus
d. mise en évidence du génome viral : Techniques de biologie moléculaire.

a) Isolement du virus :

1. Culture cellulaire :
Différents types de cellules en fonction du virus recherché :
❖ Cellules primaires :
Issues directement du tissu d’origine (durée de vie limitée à quelques passages)
Ex : rein du singe, lymphocytes
❖ Cellules secondaires :
Généralement c’est les cellules diploïdes, fibroblastiques humaines embryonnaires.
Durée de vie : max 40 passages
❖ Cellules de lignées continues :
Cellules transformées
Immortalisées
Facile à cultiver
Ex : cellule HELA carcinome du col utérin
Durée de vie illimitée
• Isolement virale sur culture cellulaire :
Virus cultivables Culture difficile Non cultivable
o Adenovirus o Inoculés sur culture cellulaire o Virus des hépatites
o Myxovirus dans des conditions précises o HPV
o Herpes virus o HIV (lympho) (nouveau-né)
o Cytomegalovirus
o Varicelle
o Enterovirus

• Identification sur culture cellulaire :

➢ Effet cytopathogène (ECP)
• Multiplication du virus dans les cellulesà altération de la morphologie cellulaire
• L’ECP est spécifique d’une famille de virus
• Il est observé au microscope optique inversé à l’état frais après coloration et après un temps
déterminé pour chaque famille et parfois pour chaque virus (24h à 7jrs)
➔ Immunofluorescence
➔ Séroneutralisation ​ ​ ​ ​ID du virus
➔ Inhibition de l’hémagglutination
2. Œuf embryonné
Inoculation du prélèvement sur œufs embryonnés de 8, 9 à 11 jours en fonction des virus
❖ Voies d’inoculation :
− V. amniotique
− V. allantoïde
− V. vitelline
− V. intraveineuse
− Membrane chorio-allantoïdienne
❖ Identification : (après récupération du liquide)
− Hémadsorption
− Hémagglutination ​ ​ ​hématies spécifiques
− Inhibition de l’hémagglutination
− Séro-neutralisation

3. Inoculation à l’animal : (animal sensible) :

ex
 ex
Ragesouris (œil)
Coxsackie A ​souris (VIP, V inter cérébrale)
Coxsackie B ​Souris
Entérovirus ​ ​ ​ ​ ​ ​souriceaux nouveau-nés
❖ Les voies les plus utilisées : IV, IP, intra cérébrale, intra oculaire
❖ En fonction du virus : on choisit deux systèmes cellulaires
ex : entérovirus inoculés aux souriceaux nouveau-nés

b) Détection de l’Ag viral

Mise en évidence d’Ag viraux présents au niveau des prélèvements par l’intermédiaire d’Ac
spécifique à diagnostic rapide
❖ Techniques utilisées :
➢ Immunofluorescence
➢ Immun peroxydase
➢ Latex (agglutination)

Ex :
− Détection des rotavirus / adénovirus dans les selles (latex)
− Détection des virus respiratoires, au niveau aspiration nasale LB A (IF)
− Détection Agp2V (HIV), Ag HBs (hépatites) ELISA
c) Microscope électronique
➢ Détection de virus entier
➢ Recherche de virus non cultivables (rotavirus, astrovirus)
✓ Techniques utilisée dans le cadre de la recherche et pour les virus non cultivables
✓ Technique pas très sensibles et très couteuse
✓ Ne permet pas la différenciation des virus
d) Détection du génome viral : Biologie moléculaire en virologie
➢ La Biologie moléculaire complète l’efficacité des techniques virologies classiques
➢ La sensibilité et la spécificité dépassent parfois les techniques de référence
➢ Elles sont utilisées dans :
o Détection des génomes viraux
o L’analyse fine des séquences
❖ Techniques :
1) Hybridation moléculaire :
Entre le génome viral et des sondes nucléiques marqués par des éléments radioactifs àidentification de
virus non cultivables, ex : HPV
2) Amplification génique (conventionnel) : Polymerasechainreaction = PCR
Identificationet mise en évidence des agents viraux

▪ PCR en temps réel :

• Des techniques PCR nouvelles moins longues que les précédentes prennent de plus en plus de
l’ampleur dans leur utilisation pour le diagnostic virologique
• Le principe est basé sur une PCR conventionnée qui entraine une modification d’un signal
fluorescent, le signal est analysé en permanence par un système optique
• Un logiciel trace les courbes de cinétique et permet de déduire la quantité initiale de cible
• C’est des techniques rapides, simples.

3)
3)Séquençage
Séquençage :
(1) Principe :
− Déterminer la succession des nucléotides qui composent une séquence d’ADN
− Utilisation de désoxyribonucléotides marqués
− Séparation des fragments marqués par électrophorèse
− Obtention d’une cartographie
(2) Application :
− Caractériser un nouvel agent pathogène
− Comparer les souches
− Recherches de mutationà résistance au traitement
II. Diagnostic indirect ::((Diagnostic sérologique
sérologique)):

➢ Il permet de poser un diagnostic sur la base de la recherche d’AC spécifique

➢ Il est basé sur la recherche d’Ac (apparition) surtout dans les primo-infections ou leur ascension
(augmentation du titre) significative, 4 x le titre
➢ Le prélèvement de deux sérums à 15jrs d’intervalle est indispensable
→ 1er sérum=précoce
→ 2ème= 15 jrs plus tard
➢ La recherche d’IgM est témoin d’une infection récente sauf exception (HSV…etc). dans ce cas
un seul sérum est suffisant
→ Infections néonatales et congénitales (rubéole…)
→ Primo-infection

❖ Différentes techniques sont utilisées :

A- Réaction de Sero Seroneutralisation

neutralisation :
Elle est basée sur la neutralisation de l’infectivité d’un virus par l’intermédiaire d’un Ac neutralisant
(inhibant l’ECP)
C’est une technique ancienne est souvent de référence, elle se fait sur présence :
• D’un système cellulaire sensible au virus
• D’une quantité déterminée de virus
• Dilutions croissantes de sérum à tester.
Le mélange virus-sérum est inoculé à la culturecellulaire après un temps d’inoculation bien déterminé,
la lecture se fait au microscope inversé à la recherche d’un éventuel ECP
ECP positifàRéactionnégative
ECP négatifàRéaction positive (entérovirus,poliovirus)
(Il existe un phénomène d’interférence pour le virus de la rubéole)

B- Réaction d’immun-enzymatique : (IEA) :

Elles permettent la MEE du complexe Ag-Ac par l’intermédiaire d’un conjugué marqué (enzyme de
type peroxydase ou phosphatase alcaline). La réaction est révélée par l’addition d’un substrat.
Ces techniques permettent la MEE des IgG et IgM, elles utilisent une phase solide sur laquelle est fixé
l’Ag(papier, verre plastique, polystyrène)
❖ La lecture : ​microplaqueà D.O au spectrophotomètre
​Papierà à l’œil nu.
Plusieurs tests sont utilisés : Elisa indirect, Elisa compétition, Elisa Sandwich
Sur papier ou nylonà western Blot, Immuno Blot
Exemples :
➢ microplaque :
o Rubéole,
o HIV,HCV,HBV,HAV ….etc
o CMV, Rage
o Rotavirus…..etc
➢ Membranes:WB, VIH
➢ Immunoblot :VIH, HCV …etc

C- Inhibition de l’hemagglutination :
Utilisée pour les virus hemagglutinants tel que :
• Virus de la Rubéole (hématie de coq)
• ADV (hématies de rat ou de singe)
• Arthomyxo (hématies de cobaye)
• Virus des Oreillons (hématies de poussin)
• Virus de la rougeole (hématie de singe)
❀ IHA=technique pour la MEE du complexe immun en inhibant sa fonction d’hemagglutination. (il faut
❀ IHA=technique pour la MEE du complexe immun en inhibant sa fonction d’hemagglutination. (il faut
éliminer de l’échantillonsérique les Ac hétérologues dirigé contre les hématies test(risque de faux
positif)

Choix des Techniques sérologiques :

Le choix de la technique utilisée est fonction de :
➢ Cinétique des anticorps
➢ Spécificité des virus (HA,neutralisants……)
➢ Sensibilité de la technique
➢ Spécificité de la technique
➢ Cout
Avantages et inconvénients du diagnostic direct et indirect :
Diagnostic direct Diagnostic indirect

Avantages ✓ La culture prouve le ✓ Simple , peu couteuse , de

pouvoir infectieux (virus routine
vivant) ✓ Adapté a une grande variété
✓ Détection très rapide du de virus
virus (PCR ,antigènes) ✓ Sensibilité et spécificité
✓ Très sensibles et très satisfaisante
spécifiques (PCR)
✓ Interprétation
relativement aisée
✓ Adaptée a priori a tout
les virus impliqués en
pathologie
✓ Permet le suivi des
patients
Inconvénients ✓ Techniques couteuses ✓ Diagnostic souvent
✓ Longues et fastidieuses rétrospectif
(Culture) ✓ Interprétation délicate
✓ Tributaires de la qualité ✓ Possibles faux positifs
du prélèvement (Culture) (réactions croisées) ou de
✓ Risque de contamination faux négatifs
ou de faux positifs (PCR) (immunodépression)