Marine Le Diguerher Le 14/12/21

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TP : Les techniques immunologiques

Introduction :
Les techniques immunologiques reposent sur une réaction antigène-anticorps. Ces techniques
sont utilisées pour mettre en évidence, des antigènes ou des anticorps. Lorsqu’on veut
détecter des antigènes, on doit disposer d’anticorps spécifiques correspondant à la spécificité
antigénique recherchée.

Complexe immun

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1. But :
Découvrir les différentes techniques immunologiques en recherchant des anticorps ou
antigènes dans le sérum de différents animaux. Dans ce TP nous allons utiliser 2 techniques
différentes : la technique de précipitation (n°1) et la technique immunoenzymatique(n°2).
Dans la technique n°1 nous allons détecter d’éventuels anticorps présents dans le sérum des
chèvres grâce à la technique d’Ouchterlony et nous allons doser des anticorps anti-AEC
présents dans le sérum des chèvres grâce à la technique de Mancini. Dans la technique n°2
nous allons détecter et doser des antigènes G42 du parasite provoquant la Giardiose dans le
sérum d’un chien grâce a la technique Elisa.
Ces techniques sont utilisées dans des laboratoire d’analyse médicale.

2. Techniques de précipitation :
2.1. Technique d’Ouchterlony :
2.1.1. Principe :
L’immunodiffusion double ou technique d’Ouchterlony est une méthode utilisée pour
différencier des antigènes dans un mélange, les réactifs (antigène et anticorps) sont alors
déposés dans des puits creusés dans le gel et migrent l’un vers l’autre. Les arcs de précipitation
peuvent être de 3 types. Deux arcs qui fusionnent indiquent une identité entre les antigènes.
Si les arcs sont indépendants, les antigènes reconnus ne sont pas identiques. Enfin si les arcs
fusionnent mais en formant un éperon, les antigènes sont partiellement identiques, l’un d’eux
présentant des épitopes absents sur l’autre.

2.1.2. Méthode :
Risque et prévention :
Après chaque utilisation de matériel à usage unique les jeter dans un sac biohazard. Porter
des gants lors de l’utilisation des solutions d’antigènes.

Matériels :
− Boites de pétri de petit diamètre, glycérinée
− Pipettes pasteur
− Micropipettes et cônes - 5mL d’agar en surfusion
− Poubelle, éthanol… - Emporte-pièce (cônes coupés)

Réactifs :
− Sérum total d’une chèvre
− Solution d’antigène de brucellose

− Solution d’antigène de chlamydiose

− Solution d’antigène de paratuberculose

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− Solution d’antigène de la tremblante du mouton

- Solution d’antigène de mycoplasme

Protocole :
Etape1 : Préparation des gels
Après avoir coulé les boîtes de pétrie a une épaisseur de 3 à 4mm préparer les puits
dans la gélose.

Creuser les réservoirs avec le cône.

→ Puit n°1 de 7mm et 5 puits répartis à

équidistance autour du puits n°1 à
5mm.

Ne faire que 6 puits.

Etape 2 : Dépôts dans les puits

Ajouter dans chaque puits 80µL de chaque

solution ci-dessous :
Puit n°1= Sérum de chèvre
Puit n°2= sol antigène de brucellose
→ Puit n°3= solution antigène de chlamydiose
Puit n°4= solution antigène de paratuberculose
Puit n°5= solution antigène de la tremblante
du mouton
-
Puit n°6= solution antigène de mycoplasme

Laisser diffuser 40minutes à température ambiante en chambre humide

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2.1.3. Résultat :

Arc entre le sérum de chèvre (puit

n°1) et l’antigène de brucellose puit
(puit n°2).

2.1.4. Interprétation :
On observe un arc entre le puit n°1 le sérum de chèvre et le puit n°2 l’antigène de
brucellose. Il y a donc formation d’un complexe immun entre les anticorps du sérum
de chèvre et l’antigène de brucellose donc il y a une réaction immunologique. En
revanche on observe la non formation d’arc entre le sérum de chèvre (puit n°1) et les
puits n°3,4,5 et 6 ceux qui veut dire qu’il n’y pas de complexe immun donc pas de
réaction immunologique.

2.1.5. Conclusion :
La chèvre a ou a eu la maladie de Brucellose.

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2.2. Technique de Mancini :

2.2.1. Principe :
L’immunodiffusion radiale simple ou technique de Mancini permet d’identifier mais aussi de
quantifier les anticorps ou les antigènes ce qui consiste à incorporer des Anticorps spécifiques
dans la gélose et à déposer la solution d'Ag dans des puits. A l'équilibre il se forme un anneau
de précipitation dont le carré du diamètre est proportionnel à la concentration de l'Ag. La
concentration est exprimée par référence à une courbe standard avec un Ag de concentration
connue.

2.2.2. Méthode :

Risque et prévention :
Après chaque utilisation de matériel à usage unique les jeter dans un sac biohazard. Porter
des gants lors de l’utilisation des solutions d’antigènes.

Matériels :
− Emporte-pièce de 3mm de diamètre
− Pipettes, cônes
− Boîte de pétri déjà coulée
− Chambre humide (boîte tupperware avec du papier absorbant à l’intérieur)

Réactifs :
− Solution a dosé de sérum de l’échantillon des 10 chèvres (sérum2)
− Solution mère d’anticorps de chèvre à 25g.L-1.
− Solution d’antigène AEC mélangée dans la gélose
− Tampon PBS (Phosphate Buffer Salin) pH 7,2
− Tube d’agarose en surfusion

Protocole :

Gélose contenant
l’Antigène AEC + gel
→ d’agarose.

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Creuser 6 puits de 3mm de

→
diamètre selon le schéma ci-
contre dans la gélose
préalablement préparer.

Réalisation de la gamme étalon :

Etalon Etalon Etalon Etalon
1 2 3 4
Solution mère
d’anticorps (µL) 10 15 20 30

Tampon PBS (µL) 20 15 10 0

Concentration
massique de la 8,3 12,5 16,7 25
solution
d’anticorps (g/L)

Vf = 20*10 = 30µL
𝐶𝑚∗𝑉𝑚
Cf= 𝑉𝑓

25∗10
Cf= 30
= 8,3µL

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Ajouter dans chaque puit 5µL de

chaque solution ci-dessous :
Puit n°1= Etalon 1

→ Puit n°2= Etalon 2

Puit n°3= Etalon 3
Puit n°4= Etalon 4
Puit n°5= sérum de l’échantillon des
10 chèvre
Puit n°6= sérum de l’échantillon des
10 chèvre

Incuber 24 à 48h à température ambiante en chambre humide

2.2.3. Résultat :
Manipulation réalisée avec Isabelle Hado.

Il y a 2 auréoles : une au niveau du

puit n°1 et une au niveau du puit n°5.
Puit n°5=1,3 cm de diamètre
Puit n°1= 1,7cm de diamètre

Nos résultats ne sont pas exploitables car nous aurions dû observer 6 auréoles or ici nous en
avons que 2 nous ne pouvons donc pas réalisée la droite d’étalonnage du diamètre 2 en
fonction de la concentration en anticorps. C’est pourquoi nous allons analyser les résultats
d’un autre groupe (Jean-Baptiste et Fanny).

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Puit Concentration en
Anticorps en g/L D (diamètre de D2
l’auréole)
1 8,3 0,8cm 0,64cm
2 12,5 1,2cm 1,44cm
3 16,7 1,5cm 2,25cm
4 25 1,9cm 3,61cm
5 ? 1,5cm 2,25cm
6 1,5cm 2,25cm

Droite d'étalonnage du Diamètre2 en fonction de

la concentration en anticorps
4
3,5
3
Diamètre2

2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentration en anticorps (g/L)

Détermination de la concentration en anticorps anti-AEC grâce à l’équation de la droite

d’étalonnage :
Y= ax + b
𝑦−𝑏
X= 𝑎
2,25−0,7896
X= 0,177

X= 8,25 g/L

2.2.4. Conclusion :
La quantité d’anticorps anti-AEC présents dans le sérum des 10 chèvres est de 8,25g/L. Un
taux d’anticorps anti-AEC inférieur à 20g/L est considéré normal. Donc le taux d’anticorps
anti-AEC des 10 chèvres est considérés comme normal, il ne faut donc pas mettre en place
un traitement anti-AEC.

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3. Technique immunoenzymatique:
Les dosages ELISA sont utilisés dans de nombreux domaines de recherche et essais pour
détecter et quantifier les antigènes dans un grand nombre d’échantillons. Les lysats
cellulaires, les prélèvements de sang, les aliments…

3.1. Principe :

Dans ce TP nous avons utilisés la technique de l’Elisa sandwich direct. Cette technique
consiste à « coincer » l’antigène entre 2 anticorps, il n’y a qu’un seul anticorps qui va doser
l’antigène et un autre qui émet le signal avec l’enzyme cela permet de travailler avec de petit
volume. (cf schéma ci-dessus).Il en existe plusieurs comme l’Elisa direct, l’Elisa sandwich
indirect…
La technique ELISA est une technique immuno-enzymatique qui permet de visualiser, à partir
d'un échantillon biologique, les réactions entre un antigène et un anticorps à l'aide d'une
réaction colorée produite par un marqueur enzymatique (ici se sera un substrat de la
peroxydase : le TMB). La réaction colorée permet de confirmer l’identification de la bactérie
isolée ou la présence du virus recherché et l'intensité de la couleur donne une indication de la
quantité d'antigènes ou d'anticorps dans l'échantillon donné (ici se sera la quantité
d’antigène).
La concentration en antigènes est ensuite étudiée à l’aide d’un lecteur microplaque et du
logiciel gen 5.0.

3.2. Méthode :
Risque et prévention :
L’acide sulfurique est dangereux il est donc important de :
- Porter des lunettes
- Porter une blouse
- Manipuler sous hotte
- Porter des gants

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Lors de notre TP l’acide sulfurique était en faible concentration à 0,0625 N donc nous
n’avons pas manipuler sous hotte mais nous avons quand même porter des gants et une
blouse.

Matériel :
− Micropipette de 10 à 100µL et cônes
− 1 barette de micro-titration avec son support (9puits)
− Tubes
− Lecteur microplaque et logiciel gen 5.0

Réactifs :
− 1 microtube contenant 1mL d’anticorps anti-G 42 de chien couplé à la peroxydase
− 1 microtube contenant 200µL d’une solution G 42
− 1 microtube contenant 110 µL de sérum de chien non atteint
− 1 microtube de sérum de chien à titrer
− 1 flacon contenant 10mL d’eau stérile de PBS tween
− 1 tube de 1mL TMB
− 1 tube de 1mL PBS 1 X
− Acide sulfurique H2SO4 à 0,0625 N

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Protocole :

Puit n°1= Echantillon (chien)

Puit n°2à 7 = gamme étalon
dilution cascade
Puit n°8= témoin négatif

Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4

Etape 1 : Fixation de l’anticorps au cupule Coating « réalisée par les enseignants »

Solution très concentrée d’anticorps anti-G 42 qui va tapisser le fond des cupules et occuper
tous les sites de fixation protéique. Les cupules sont ensuite lavées à l’aide d’un tampon et
sont prêtes à l’emploi.
Etape 2 : Fixation de l’antigène à doser (dilution en cascade de la cupule 2 à 7)

Réaliser les dépots suivants :

+80µL +80µL de
+ 80 µL de
sérum de chien +160µL PBS1 sérum non
d’antigène atteint
G 42-C1

1 2 3 4 5 6 7 8

Dilution en cascade de la cupule 2 à 7 :

+ 80 µL Poubelle
+80µL 80µL 80µL 80µL 80µL

1 2 3 4 5 6 7 8

Incuber durant 15min à température ambiante

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Réalisation de 3 lavages :
+ 80 µL de PBS tween
Réaliser un
retournement de la
barrette sans
hésitation pour éviter
de mélanger les
cupules entre elle et
1 2 3 4 5 6 7 8 donc de les
contaminé. Tapoter
ensuite sur un sopalin
pour enlever les
gouttes restante.

Etape 3 : fixation du conjugué enzymatique

+ 80 µL de solution d’anticorps

1 2 3 4 5 6 7 8

Incuber 15min à température ambiante

Réalisation de 3 lavages :
+ 80 µL de PBS tween

1 2 3 4 5 6 7 8

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Etape 4 : Détection des anticorps fixés

+ 80µL de TMB

1 2 3 4 5 6 7 8

Mesure d’absorbance au lecteur microplaque à 450nm

! Au-delà de 5 min les puits présenteront tous la même intensité de bleu. La révélation
enzymatique continue, il faut donc bloquer l’enzyme en ajoutant 80µL d’acide sulfurique.

+ 80µL d’acide sulfurique

1 2 3 4 5 6 7 8

3.3. Résultat :
On observe un dégradé de couleur en fonction de la dilution en cascade ce
qui veut dire que la manipulation à bien été réalisé. Plus la cupule est
concentrée en antigène et plus la couleur du bleu est foncée. (Résultat de
Manon car ma manipulation n’était pas bien réalisée).

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Gamme étalon de l'absorbance en fonction en

fonction de la concentration en antigène.
0,5
0,45
0,4
0,35
Absorbance a 0,3
450nm 0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentration en en anticorps en µg/mL

Ma courbe est inexploitable on observe un coefficient de corrélation de 0,04

ce qui n’est pas du tout proche de 1 cela montre donc que la corrélation est
faible.
Je vais donc exploiter les résultats d’un camarade. (Jean-Baptiste)

Gamme étalon de l'absorbance en fonction en fonction de

la concentration en antigène.
1,4

1,2
Absorbance a 450nm

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Concentration en en anticorps en µg/mL

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Puits Concentration Absorbance à 450nm

en µg/mL
Puit n°1 0,0067 g/L 0,7
Puit n°2 17 1,094
Puit n°3 8,5 0,847
Puit n°4 4,25 0,703 Concentration = Facteur de
dilution*concentration sol. mère
Puit n°5 2,125 0,536
Puit n°6 1,0625 0,395 C puit n°3= 0,5*17
Puit n°7 0,5355 0,319
C puit n°3= 8,5 µg/L
Puit n°8 0,148

Concentration en antigène G 42 de l’échantillon de chien :

Y= ax+b
𝑦−𝑏
X= 𝑎
0,7−0,4019
X= 0,0443
X= 6,72 µL/mL = 0,0067 g/L

3.4. Interprétation :
Les résultats que j’obtiens sont inexploitable, cela peut venir de la manipulation lors du
retournement de la barrette le contenue des cupules c’est peut-être mélanger les unes aux
autres et donc contaminé toutes les cupules. En revanche les résultats de Jean-Baptiste sont
exploitables car on observe un coefficient de corrélation de 0,91 ce qui est proche de 1 donc
la corrélation est élevée.
Après calcul, j’en déduis que la concentration en antigène G 42 du chien est de 0,0067 g/L.
Un chien est considéré comme positif à la Giardose lorsqu’il a une concentration en antigène
G 42 supérieur à 1,3g/L.

3.5. Conclusion :
Le chien analysé lors de se TP n’est pas atteint de la maladie de Giardose car la concentration
en antigène G42 est inférieur a 1,3g/L qui est la concentration en antigène de référence a ne
pas dépassé pour ne pas être considéré positif à cette maladie.

4. Conclusion générale :
Pour conclure sur ces 3 TP, on remarque que les manipulations que j’ai effectuées non pas été très
bien réalisé car je n’obtiens pas de bons résultats sur la technique de Mancini et la technique Elisa. En
revanche la technique d’ouchterlony a quand même bien été réalisé.

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